Name: live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain
Uploaded: 2013-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain at JoVE.com

Agradecemos a Aida de la Cruz para desenvolver e ensinar o protocolo original em que esta versão é baseada 10. Trabalho no Buttitta Lab é financiado pelo NIH conceder GM086517.

1. Fly Pecuária <ol><li> Cruz voa de genótipos desejados em frascos de plástico estreitas com 10 ml de levedura-Glucose Médio 3 ou outros meios de comunicação ricos em proteínas de sua escolha. As extensas Drosophila transgénicas ferramentas disponíveis para a expressão específica de tecido e da linhagem de rastreio com a expressão da proteína fluorescente in vivo estão descritos em detalhe noutro local 4,5. Transfira os pais frascos frescos diariamente pa...

<ol>
	<li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+measurement+and+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry.">DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).</li><li>Rabinovitch, P. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.H+Exit+from+mitosis+in+Drosophila+syncytial+embryos+requires+proteolysis+and+cyclin+degradation,+and+is+associated+with+localized+dephosphorylation.">P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation.</a> Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).</li></ol>

O protocolo aqui descrito permite a análise do ciclo celular, o tamanho da célula relativo e número relativo de células em tecidos de Drosophila vivo em vários estágios de desenvolvimento. Quando esta análise é acoplado com a expressão da proteína fluorescente tipo específico de célula ou linhagem rastreamento, informações detalhadas podem ser obtidas sobre respostas celulares ao ciclo celular discreta ou perturbações de crescimento. Como prova de princípio, interrompido quietude no cérebro da...

A citometria de fluxo pode ser usado para as medições de viabilidade celular, o tamanho da célula relativo, teor de ADN e expressão de proteína fluorescente em populações de células vivas. Devido à replicação do ADN nuclear durante a fase S, as informações sobre o conteúdo de ADN numa população de células pode ser usada para inferir percentagens relativas em diferentes fases do ciclo celular 1-3. Este método tornou-se um elemento fundamental da análise do ciclo celular, em sistemas modelo de leveduras aos mamíferos. A mosca da fruta Drosophila melanogaster, tornou-se um sistema modelo excelente para a análise in vivo genética de regulação do ciclo celular. As extensas ferramentas genéticas disponíveis em moscas permitir manipulações tecido elegante específicas e temporalmente regulada de reguladores do ciclo celular, juntamente com a linhagem baseada em proteína fluorescente vivo rastreamento 4-6. A citometria de fluxo foi utilizado para estudar o conteúdo de DNA numa série de tipos de células de Drosophila, incluindo endoreple células mitóticas cultivadas icating 7,8. Um avanço importante para estudos do ciclo celular in vivo foi realizada por de la Cruz e Edgar, com o desenvolvimento de um protocolo de análise por citometria de fluxo directo diplóides 9,10 discos imaginais de Drosophila, um protocolo que foi usado e adaptado por muitos laboratórios. Esta técnica, quando acoplado com material genético in vivo linhagem rastreio através da expressão da proteína fluorescente indutível e rotulagem tecido específico, permite a obtenção de informações sobre os efeitos de manipulação de genes no tempo de duplicação celular em geral, o tamanho das células e determinar a temporização precisa de fases do ciclo celular in vivo 9 , 11. No entanto, este método tem, até agora, baseou-se no uso da célula permeável corante de ADN Hoechst 33342-intercalante ao manchar e quantificar o DNA em células vivas, o que tem limitado a utilizadores citómetros de fluxo com um laser de UV capaz de excitar o corante de Hoechst. Estes são geralmente encontradas apenas em classificadores (ou seja BD FACS Vantage, BD FACSAria) ou caro multicolor sistemas de bancada (ou seja BD LSR), geralmente necessitando de apoio institucional por instalações do núcleo de fluxo. Nós modificamos o protocolo baseado em Hoechst usar um corante de DNA de células vivas de novo Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violeta. Este é compatível com o corante violeta de 405 nm, um laser, mais comum em analisadores de bancada menores e disponíveis no analisador de bancada pequena auto-contido, o acústico Attune Focando Citómetro. Aqui é apresentado um protocolo detalhado para a análise do ciclo celular, que pode ser acoplado com o tipo de célula, o tamanho da célula, o número de células e a análise da linhagem de uma variedade de tecidos de Drosophila durante várias fases de desenvolvimento, utilizando o violeta e DyeCycle Attune. Este protocolo expande o número de citómetros adequados para esta análise com os tecidos de Drosophila e fornece exemplos de como este tipo de análise de ciclo de células vivas pode ser modificado para tipos adicionais dos tecidos e estágios de desenvolvimento.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube </td>
 <td>BD Falcon </td>
 <td>352058 </td>
 <td>5 ml tubes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Acoustic Focusing Cytometer</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4445315</td>
 <td>Blue / Violet configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Cytometer Software (version 1.2.5)</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>Free </td>
 <td>PC only</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) </td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4449754 </td>
 <td>For daily performance test</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 Inox forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11251-20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embryo dishes 
 30 mm x 12mm </td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70543-30 </td>
 <td>Glass dissection dishes </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>022670051 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T4174 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vannas-T&uuml;bingen Spring Scissors </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15003-08 </td>
 <td>Straight 5mm Cutting Edge </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vybrant DyeCycle Violet Stain</td>
 <td>Life Technologies/ Invitrogen</td>
 <td>V35003 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Required reagents and instruments.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Live DNA Stain Solution (10 ml):
 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 
 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 
 5 &mu;l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)
 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
 </td>
</tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FSC</td>
 <td>SSC</td>
 <td>BL1</td>
 <td>VL1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Threshold (x1000)</td>
 <td>100</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Voltage (mV)</td>
 <td>2950</td>
 <td>4250</td>
 <td>1800</td>
 <td>1150</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain

A citometria de fluxo foi utilizada para obter informação sobre o conteúdo de ADN numa população de células, para inferir percentagens relativas em diferentes fases do ciclo celular. Esta técnica tem sido aumentado com sucesso para os tecidos mitóticas do organismo-modelo de Drosophila melanogaster para estudos genéticos de regulação do ciclo celular in vivo. Quando combinada com a expressão da proteína fluorescente tipo específico de célula e manipulações genéticas, pode-se obter informações detalhadas sobre os efeitos sobre o número de células, o tamanho da célula e do ciclo celular phasing in vivo. No entanto, este método de células vivas foi contado com a utilização da célula permeável corante de ADN Hoechst 33342-intercalante, limitando aos utilizadores citómetros de fluxo equipado com um laser de UV. Nós modificamos este protocolo para usar uma tintura nova célula viva DNA, Vybrant DyeCycle Violet, compatível com o violeta do laser 405nm mais comum. O protocolo aqui apresentado permite a análise do ciclo celular eficiente juntamente com célulastipo, o tamanho relativo da célula e informação do número de células, em uma variedade de tecidos de Drosophila. Este protocolo estende a técnica útil para a análise do ciclo celular de tecidos vivos de Drosophila para um pequeno analisador de bancada, a Focagem Citómetro Attune acústica, o que pode ser executado e mantidas numa escala de um único laboratório.

A Figura 2 mostra resultados representativos para uma amostra de larvas de asa, expressando GFP na metade posterior do tecido, utilizando o modelo previsto a GFP. Resultados semelhantes são obtidos com o mesmo tipo de tecido e padrão de expressão para a RFP, utilizando o modelo de RFP fornecida (Figura 3A). Os modelos e voltagens fornecidas (Tabela 2) são adequados para análise de olhos larvais (Figura 3B), cérebros e asas, assim como os olhos, cérebros pupa <str...

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Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Um protocolo para a análise do ciclo celular viva<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos utilizando o Attune Acústico Cytometer Foco é descrito. Este protocolo prevê, simultaneamente, informações sobre o tamanho da célula familiar, número de celular, conteúdo de DNA e tipo de célula via linhagem traçado ou expressão específica de tecido de proteínas fluorescentes<em&gt; In vivo</em&gt;.

Análise do Ciclo de células vivas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos usando o acústico Attune Focando Cytometer e Vybrant DyeCycle Violeta DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

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