Name: live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain
Uploaded: 2013-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain at JoVE.com

Мы благодарим Аида де ла Крус для разработки и преподавания оригинального протокола, на которой эта версия основана 10. Работа в Лаборатории Buttitta поддерживается NIH грант GM086517.

1. Fly хозяйство <ol><li> Крест летит желаемых генотипов в узкие пластиковые флаконы по 10 мл дрожжевой среде с глюкозой-3 или другие богатые белком СМИ по вашему выбору. Обширная трансгенные дрозофилы инструментов, доступных для конкретной ткани выражения и отслеживания клонов с ...

<ol>
	<li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+measurement+and+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry.">DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).</li><li>Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content+histogram+and+cell-cycle+analysis.">DNA content histogram and cell-cycle analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).</li><li>Ashburner, M., Roote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila:+the+laboratory+setup.">Culture of Drosophila: the laboratory setup.</a> CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).</li><li>del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li><li>McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gene+expression+targeting+with+the+TARGET+and+gene-switch+systems+in+Drosophila.">Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila.</a> Sci STKE. 2004, pl6 (2004).</li><li>Calvi, B. R., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+BrdU+labeling+and+nuclear+flow+sorting+of+the+Drosophila+ovary.">Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary.</a> Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).</li><li>Bjorklund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pathways+regulating+cell+size+and+cell-cycle+progression+by+RNAi.">Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi.</a> Nature. 439, 1009-1013 (2006).</li><li>Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+and+cell+division+in+the+Drosophila+wing.">Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing.</a> Cell. 93, 1183-1193 (1998).</li><li>de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+Drosophila+cells.">Flow cytometric analysis of Drosophila cells.</a> Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).</li><li>Reis, T., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+dE2F1+by+cyclin-dependent+kinases+controls+cell+cycle+timing.">Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing.</a> Cell. 117, 253-264 (2004).</li><li>Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+and+patterned+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+during+metamorphosis.">Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).</li><li>Schubiger, M., Palka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+spatial+patterns+of+DNA+replication+in+the+developing+wing+of+Drosophila.">Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila.</a> Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).</li><li>Theodosiou, N. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FLP/FRT+system+to+study+Drosophila+development.">Use of FLP/FRT system to study Drosophila development.</a> Methods. 14, 355-365 (1998).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.H+Exit+from+mitosis+in+Drosophila+syncytial+embryos+requires+proteolysis+and+cyclin+degradation,+and+is+associated+with+localized+dephosphorylation.">P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation.</a> Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).</li></ol>

Протокол, описанный здесь позволяет анализ клеточного цикла, относительного размера ячейки и относительные количества клеток в живых тканях дрозофилы на различных стадиях развития. Когда этот анализ в сочетании с сотового типа конкретных флуоресцентных экспрессии белка или отс...

Проточная цитометрия может быть использован для измерения жизнеспособности клеток, относительный размер ячейки, содержание ДНК и флуоресцентные экспрессии белка в клеточной популяции живых. Благодаря репликации ядерной ДНК во время S-фазы, информацию о содержание ДНК в популяции клеток может быть использована для вывода относительное процентное в различных фазах клеточного цикла 1-3. Этот метод стал краеугольным камнем анализа клеточного цикла в модельных системах от дрожжей до млекопитающих. Плодовой мушки дрозофилы стал отличным модели системы для генетического анализа в естественных условиях регуляции клеточного цикла. Обширные генетические инструменты, доступные в мухи позволяют элегантные ткани и во времени конкретных манипуляций регулируется регуляторов клеточного цикла, а также в естественных условиях флуоресцентного белка на основе отслеживания клонов 4-6. Проточная цитометрия был использован для изучения ДНК в число типов Drosophila клеток, включая endoreplicating клетки и культивируемые клетки митотического 7,8. Важный шаг вперед в естественных исследований клеточного цикла был сделан де ла Круз и Эдгар, с развитием протокола для анализа методом проточной цитометрии живых диплоидных Drosophila дисков имагинальных 9,10, протокол, который был использован и адаптирован многих лабораторий. Этот метод, в сочетании с генетической линии в естественных условиях трассировки через индуцибельной экспрессии белка флуоресцентные и тканей конкретных маркировки, позволяет получить информацию о генной инженерии воздействие на общее время удвоения клетки, размер ячейки и определить точную синхронизацию фаз клеточного цикла в естественных условиях 9 11. Однако этот метод до сих пор полагались на использование клетки проницаемыми Hoechst 33342 ДНК-интеркалирующего красителя для окрашивания и количественной оценки ДНК в живых клетках, которая ограничивает пользователей течь цитометрии с помощью УФ лазер, способным возбуждать краситель Hoechst. Как правило, они встречаются только в сортировщики (т.е. BD FACS VantaGE, BD FACSAria) или дорогие многоцветные настольных систем (т.е. BD LSR), как правило, требующие поддержки со стороны институциональных средств основного потока. Мы модифицировали Hoechst протокол на основе использования новых живых клеток ДНК красителя из Invitrogen, Vybrant DyeCycle фиолетового. Этот краситель совместим с фиолетовыми 405 нм лазер, чаще в небольших настольных анализаторов и доступны в небольших автономных настольный анализатор, Attune Акустическая Фокусировка Цитометр. Здесь мы представляем подробный протокол для сотовых анализ цикла, которое может быть связано с типом клеток, размер ячейки, номер клетки и линии анализа в различных тканях дрозофилы на различных этапах развития с использованием DyeCycle Фиолетовый и Attune. Этот протокол расширяет количество цитометры подходящих для такого анализа с тканями Drosophila и примеры того, как этот тип живого анализа клеточного цикла могут быть модифицированы для дополнительных типов тканей и стадиях развития.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube </td>
 <td>BD Falcon </td>
 <td>352058 </td>
 <td>5 ml tubes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Acoustic Focusing Cytometer</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4445315</td>
 <td>Blue / Violet configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Cytometer Software (version 1.2.5)</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>Free </td>
 <td>PC only</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) </td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4449754 </td>
 <td>For daily performance test</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 Inox forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11251-20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embryo dishes 
 30 mm x 12mm </td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70543-30 </td>
 <td>Glass dissection dishes </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>022670051 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T4174 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vannas-T&uuml;bingen Spring Scissors </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15003-08 </td>
 <td>Straight 5mm Cutting Edge </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vybrant DyeCycle Violet Stain</td>
 <td>Life Technologies/ Invitrogen</td>
 <td>V35003 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Required reagents and instruments.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Live DNA Stain Solution (10 ml):
 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 
 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 
 5 &mu;l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)
 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
 </td>
</tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FSC</td>
 <td>SSC</td>
 <td>BL1</td>
 <td>VL1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Threshold (x1000)</td>
 <td>100</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Voltage (mV)</td>
 <td>2950</td>
 <td>4250</td>
 <td>1800</td>
 <td>1150</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain

Проточная цитометрия широко используется для получения информации о ДНК в популяции клеток, чтобы вывести относительное процентное в различных фазах клеточного цикла. Этот метод был успешно распространен на митотических тканях модельного организма дрозофилы для генетических исследований регуляции клеточного цикла в естественных условиях. В сочетании с сотового типа конкретных флуоресцентных экспрессии белка и генетических манипуляций, можно получить подробную информацию о влияние на количество клеток, размеров клеток и клеточного цикла постепенно в естественных условиях. Однако эта живых клеток метод опирается на использование клетки проницаемыми Hoechst 33342 ДНК-интеркалирующего красителя, ограничивая пользователей проточных цитометров оснащен УФ-лазера. Мы модифицировали этот протокол использовать новые живых клеток ДНК краситель, Vybrant DyeCycle фиолетовый, совместимый с более распространенными фиолетовый 405 нм лазер. Протокол, представленные здесь позволяет проводить эффективный анализ клеточного цикла в сочетании с ячейкитип, относительный размер ячейки и информация количество клеток, в различных тканях дрозофилы. Этот протокол расширяет полезную клеточного цикла анализа для живых тканей Drosophila в небольшой настольный анализатор, Attune Акустическая Цитометр фокусировки, которая может быть запущена и поддерживается на одном-лабораторном масштабе.

На рисунке 2 показаны результаты для представителя личиночной образца крыло, выражая GFP в задней половине ткани, используя предоставленный GFP шаблона. Аналогичные результаты получены с тем же типом ткани и экспрессии для RFP помощью предоставленного RFP шаблон (фиг. 3А). П...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain at JoVE.com

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Протокол для клеточного цикла анализа живых<em&gt; Drosophila</em&gt; Тканей с использованием Attune акустической фокусировки цитометра описано. Этот протокол одновременно предоставляет информацию о относительный размер ячейки, число клеток, содержание ДНК и клеточного типа с помощью отслеживания клонов или ткани специфической экспрессии флуоресцентных белков<em&gt; В естественных условиях</em&gt;.

Жить анализ клеточного цикла<em&gt; Drosophila</em&gt; Тканей с использованием акустической Attune Фокусировка Цитометр и Vybrant DyeCycle Фиолетовое пятно ДНК

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Живая изображений глиальных миграции клеток в диск дрозофилы глаз имагинальных

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Подготовка Drosophila Эмбрионы для Live-визуализации с использованием висячей капли протокола

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Живая съемка Дрозофилы Эмбриональные миграции гемоцитов

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Анализ сотового Позиция цикла в клетках млекопитающих

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Оценка GFP слова и жизнеспособность использование Тали на основе изображения Цитометр

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Живая съемка апоптоза клеток во время акции<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбриогенеза

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Томатный / GFP-ФЛП / FRT Метод живых изображений мозаики взрослых<em&gt; Дрозофилы</em&gt; клетки фоторецепторов

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Цитологического анализа сперматогенеза: Живые и Исправлены Препараты<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Семенники

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Сниженной гравитационные окружающей среды и комплектующие Демонстрации проточной цитометрии и Companion микрожидкостных Технология смешивания Прототип миниатюрных

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL холестерина поглощения Assay с использованием живой клетки изображений анализ с ячейкой мониторинг состояния

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...