Name: live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain
Uploaded: 2013-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain at JoVE.com

Biz gelişmekte olan ve bu sürüm 10 dayandığı orijinal protokol öğretmek için Aida de la Cruz teşekkür ederim. Buttitta Laboratuarı&#39;nda çalışma NIH hibe GM086517 tarafından desteklenmektedir.

1. Yetiştiriciliği Fly <ol><li> Çapraz 10 ml Maya-Glikoz Orta 3 veya seçtiğiniz diğer proteinden zengin medya ile dar plastik şişeleri istenen genotip uçar. In vivo floresan protein ekspresyonu ile izleme doku spesifik ifade ve soy için uygun geniş bir Drosophila transgenik başka araçlar 4,5 detaylı bir şekilde tarif edilmektedir. 24 saat döl koleksiyon serisi elde etmek için her gün taze şişeleri için anne transfer, ya da daha kesin evreleme için,...

<ol>
	<li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+measurement+and+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry.">DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).</li><li>Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content+histogram+and+cell-cycle+analysis.">DNA content histogram and cell-cycle analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).</li><li>Ashburner, M., Roote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila:+the+laboratory+setup.">Culture of Drosophila: the laboratory setup.</a> CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).</li><li>del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li><li>McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gene+expression+targeting+with+the+TARGET+and+gene-switch+systems+in+Drosophila.">Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila.</a> Sci STKE. 2004, pl6 (2004).</li><li>Calvi, B. R., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+BrdU+labeling+and+nuclear+flow+sorting+of+the+Drosophila+ovary.">Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary.</a> Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).</li><li>Bjorklund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pathways+regulating+cell+size+and+cell-cycle+progression+by+RNAi.">Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi.</a> Nature. 439, 1009-1013 (2006).</li><li>Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+and+cell+division+in+the+Drosophila+wing.">Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing.</a> Cell. 93, 1183-1193 (1998).</li><li>de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+Drosophila+cells.">Flow cytometric analysis of Drosophila cells.</a> Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).</li><li>Reis, T., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+dE2F1+by+cyclin-dependent+kinases+controls+cell+cycle+timing.">Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing.</a> Cell. 117, 253-264 (2004).</li><li>Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+and+patterned+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+during+metamorphosis.">Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).</li><li>Schubiger, M., Palka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+spatial+patterns+of+DNA+replication+in+the+developing+wing+of+Drosophila.">Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila.</a> Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).</li><li>Theodosiou, N. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FLP/FRT+system+to+study+Drosophila+development.">Use of FLP/FRT system to study Drosophila development.</a> Methods. 14, 355-365 (1998).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.H+Exit+from+mitosis+in+Drosophila+syncytial+embryos+requires+proteolysis+and+cyclin+degradation,+and+is+associated+with+localized+dephosphorylation.">P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation.</a> Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).</li></ol>

Burada tarif edilen protokole, hücre döngüsü, göreli hücre boyutu ve nispi hücre sayısı, çeşitli gelişim aşamalarında Drosophila canlı dokularda analizi için olanak sağlar. Bu analiz hücre türüne özgü floresan protein ifade veya izleme soy bağlandığı zaman, detaylı bilgi gizli hücre döngüsü veya büyüme tedirginlikler hücresel yanıtları hakkında elde edilebilir. Beyin hücreleri tutuklandı 90% G1 üzerinde normal olduğunda ilkesinin kanıtı olarak, biz (3D Şekil)<...

Akış sitometri hücre canlılığı, nispi hücre boyutu, DNA içeriği ve canlı hücre popülasyonunda floresan proteini ifade ölçümü için kullanılabilir. S-fazı, bir hücre popülasyonunda DNA içeriği hakkında bilgi boyunca nükleer DNA çoğaltma bağlı olarak farklı hücre döngüsü faz 1-3 görece yüzdeleri belirlemek için de kullanılabilir. Bu yöntem, mayadan memelilere modeli sistemlerinde hücre döngüsü analizi bir taşı haline gelmiştir. Meyve sineği Drosophila melanogaster hücre döngüsünün düzenlenmesi in vivo analizlerde genetik için mükemmel bir model sistem haline gelmiştir. Sinekler mevcut geniş genetik araçları vivo floresan protein bazlı soy 4-6 izleme ile birlikte hücre döngüsü düzenleyicileri zarif doku özel ve geçici olarak düzenlenir manipülasyonlar için izin verir. Akış sitometri endorepl da dahil olmak üzere, Drosophila hücre tipleri arasında bir dizi DNA içeriği incelemek için kullanılmıştırhücreleri ve kültür mitotik hücreler 7,8 icating. In vivo hücre döngüsü çalışmalar için önemli bir ilerleme canlı diploid Drosophila hayali diskler 9,10 akış sitometrik analizi, birçok laboratuvar tarafından kullanılan ve adapte edilmiş bir protokol için bir protokol gelişimi ile, de la Cruz ve Edgar tarafından yapıldı. Indüklenebilir floresan protein ekspresyonu ve doku özel etiketleme ile izleme in vivo soy genetik ile birlikte bu teknik,, in vivo 9 bir genel hücre katına çıkma süresi, hücre boyutu gen manipülasyonu etkileri hakkında bilgi edinmek için ve hücre döngüsü aşamalarının hassas zamanlama belirlemenize olanak sağlar , 11. Bununla birlikte, bu yöntem, bugüne kadar kullanıcılar verici Hoechst boya yeteneğine sahip bir UV lazer sitometre akmaya sınırlı olan canlı hücreler, DNA leke ve ölçmek için hücrenin kullanımını geçirgen Hoechst 33.342 DNA intercalating boya dayanmıştır. Bunlar genellikle sadece seçmeler (yani BD FACS Vanta bulunurge, BD FACSAria) veya pahalı çok renkli masa üstü sistemleri (yani BD LSR), kurumsal akış çekirdek tesisleri tarafından genellikle gerektiren destek. Biz Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet yeni bir canlı hücre DNA boya kullanmak için Hoechst-tabanlı protokol değiştirdiniz. Bu boya daha küçük masa üstü analiz yaygın ve küçük bağımsız masa üstü analizörü, Sitometre Odaklama Attune Akustik mevcut bir mor 405 nm lazer ile uyumludur. Burada DyeCycle menekşe ve Akort kullanılarak çeşitli gelişim aşamalarında hücre tipi, hücre boyutu, hücre sayısı ve Drosophila dokularının çeşitli soy analizi ile akuple edilebilir hücre döngüsü analizi için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu protokol Drosophila dokuları ile bu analiz için uygun sitometrelerinde sayısı genişletir ve canlı hücre döngüsü analizi bu tür ek doku tipleri ve gelişim evreleri için değiştirilebilir nasıl örnekleri sağlar.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube </td>
 <td>BD Falcon </td>
 <td>352058 </td>
 <td>5 ml tubes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Acoustic Focusing Cytometer</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4445315</td>
 <td>Blue / Violet configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Cytometer Software (version 1.2.5)</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>Free </td>
 <td>PC only</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) </td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4449754 </td>
 <td>For daily performance test</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 Inox forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11251-20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embryo dishes 
 30 mm x 12mm </td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70543-30 </td>
 <td>Glass dissection dishes </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>022670051 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T4174 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vannas-T&uuml;bingen Spring Scissors </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15003-08 </td>
 <td>Straight 5mm Cutting Edge </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vybrant DyeCycle Violet Stain</td>
 <td>Life Technologies/ Invitrogen</td>
 <td>V35003 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Required reagents and instruments.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Live DNA Stain Solution (10 ml):
 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 
 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 
 5 &mu;l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)
 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
 </td>
</tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FSC</td>
 <td>SSC</td>
 <td>BL1</td>
 <td>VL1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Threshold (x1000)</td>
 <td>100</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Voltage (mV)</td>
 <td>2950</td>
 <td>4250</td>
 <td>1800</td>
 <td>1150</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain

Flow sitometri çok farklı hücre döngüsü aşamalarında göre yüzde anlaması için, bir hücre nüfus DNA içeriği hakkında bilgi edinmek için kullanılır olmuştur. Bu teknik başarılı in vivo hücre döngüsü düzenleme genetik çalışmalar için model organizma Drosophila melanogaster mitotik dokulara uzatıldı. Hücre türüne özgü floresan protein ekspresyonu ve genetik manipülasyonlar ile birleştiğinde, bir hücre sayısı, hücre boyutu ve in vivo olarak aşamalı hücre döngüsü üzerindeki etkileri hakkında ayrıntılı bilgi edinebilirsiniz. Ancak bu canlı hücre yöntemi UV lazer ile donatılmış akış sitometrelerinde kullanıcıları sınırlayıcı, hücre geçirgen Hoechst 33.342 DNA-intercalating boya kullanımı güvendi. Biz daha yaygın mor 405nm lazer ile uyumlu yeni bir canlı hücre DNA boya, Vybrant DyeCycle Violet, kullanmak için bu protokol değiştirdiniz. Burada sunulan protokol, hücre ile birlikte verimli bir hücre döngüsü analizi sağlarDrosophila dokularda çeşitli tip, göreli hücre boyutu ve hücre sayısı bilgiler. Bu protokol tek laboratuvar ölçekte çalışan ve korunabilir bir küçük masa üstü analiz için canlı Drosophila dokular için yararlı hücre döngüsü analizi tekniği, Attune Akustik Odaklama Sitometreyi, uzanır.

Şekil 2 sağlanan GFP şablonu kullanarak, doku arka yarısında GFP ifade, bir larva kanat örnek temsilcisi sonuçları gösterir. Benzer sonuçlar, aynı doku tipindeki ve verilen TTT şablon (Şekil 3A) kullanılarak TTT için ekspresyon modeli ile elde edilir. Resim şablonları ve gerilimleri (Tablo 2) larva gözde (Şekil 3B), beyin ve kanatların yanı sıra, pupa gözler, beyinleri (Şekil 3B) ve kanatların analizi için uygundur. Kapılar 5 ...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain at JoVE.com

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Canlı hücre döngüsü analizi için bir protokol<em&gt; Drosophila</emAkort Akustik Odaklama Sitometre kullanarak&gt; dokular açıklanmıştır. Bu protokol, eş zamanlı olarak ya da floresan nesilli izleme proteinlerin doku spesifik ifade yoluyla göreli hücre boyutu ile ilgili bilgi, hücre sayısı, DNA içeriği hücre tipi içerir<em&gt; In vivo</em&gt;.

Canlı Hücre Döngüsü Analizi<em&gt; Drosophila</emAkort Akustik Odaklama Sitometreyi ve Vybrant DyeCycle Violet DNA Leke kullanarak&gt; Dokular

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Hazırlanması Drosophila</emAsma Bırak Protokolü kullanarak Canlı Görüntüleme> Embriyolar

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP İfade ve Canlılık Değerlendirilmesi

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptör Hücreler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Prototip Minyatür Akış Sitometresi ve Companion mikroakışkan Karıştırma Teknoloji İndirimli-gravite Çevre Donanım Gösterileri

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL kolesterol alımını tahlil canlı hücre analizi ile hücre Imaging kullanarak sistem durumu izleme

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...