Name: rna secondary structure prediction using high-throughput shape
Uploaded: 2013-05-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE at JoVE.com

S. Lusvarghi, J. Sztuba-Solinska, KJ Purzycka, JW Rausch en SFJ Le Grice worden ondersteund door de Intramurale Research Program van de National Cancer Institute, National Institutes of Health, USA.

Primerontwerp en uitbreiding van de RNA 3 &#39;terminus Om lange RNA analyse door high-throughput SHAPE, moet een reeks van primer hybridisatie sites dat ze (i) worden gescheiden door ~ 300 nt, (ii) 20-30 nt in lengte, en (iii) dat RNA / worden geselecteerd DNA hybriden gemaakt door het gloeien DNA om deze sites een verwachte smelttemperatuur van&gt; 50 ° C. Bovendien moeten segmenten van RNA die voorspeld hoge mate bepaald worden vermeden, maar die constatering vereist enige voorkennis van de...

<ol>
	<li>Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+regulatory+RNA+elements:+ribozymes+that+regulate+gene+expression.">Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).</li><li>Moore, P. B., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+RNA+in+the+synthesis+of+protein.">The roles of RNA in the synthesis of protein.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003780 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+SHAPE+analysis+reveals+structures+in+HIV-1+genomic+RNA+strongly+conserved+across+distinct+biological+states.">High-throughput SHAPE analysis reveals structures in HIV-1 genomic RNA strongly conserved across distinct biological states.</a> Plos Biol. 6, 883-899 (2008).</li><li>Merino, E. J., Wilkinson, K. A., Coughlan, J. L., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution+by+selective+2+'-hydroxyl+acylation+and+primer+extension+(SHAPE).">RNA structure analysis at single nucleotide resolution by selective 2 '-hydroxyl acylation and primer extension (SHAPE).</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4223-4231 (2005).</li><li>Watts, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+secondary+structure+of+an+entire+HIV-1+RNA+genome.">Architecture and secondary structure of an entire HIV-1 RNA genome.</a> Nature. 460, 711-716 (2009).</li><li>Xu, W., Bolduc, F., Hong, N., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+combination+of+computer-assisted+structure+prediction+and+SHAPE+probing+to+elucidate+the+secondary+structures+of+five+viroids.">The use of a combination of computer-assisted structure prediction and SHAPE probing to elucidate the secondary structures of five viroids.</a> Mol. Plant Pathol. , (2012).</li><li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+architecture+of+the+human+long+non-coding+RNA,+steroid+receptor+RNA+activator.">Structural architecture of the human long non-coding RNA, steroid receptor RNA activator.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5034-5051 (2012).</li><li>Leshin, J. A., Heselpoth, R., Belew, A. T., Dinman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+structural+analysis+of+yeast+ribosomes+using+hSHAPE.">High-throughput structural analysis of yeast ribosomes using hSHAPE.</a> RNA Biol. 8, 478-487 (2011).</li><li>Souliere, M. F., Haller, A., Rieder, R., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+approach+for+the+selection+of+2-aminopurine+substitution+sites+to+investigate+RNA+folding.">A powerful approach for the selection of 2-aminopurine substitution sites to investigate RNA folding.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 16161-16167 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2 '-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nat. Protoc. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D. S., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Shape+and+Hydroxyl+Radical+Analysis+of+Rna+Structure+and+Ribonucleoprotein+Assembly.">High-Throughput Shape and Hydroxyl Radical Analysis of Rna Structure and Ribonucleoprotein Assembly.</a> Method Enzymol. 468, 67-89 (2009).</li><li>Low, J. T., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE-directed+RNA+secondary+structure+prediction.">SHAPE-directed RNA secondary structure prediction.</a> Methods. 52, 150-158 (2010).</li><li>Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. S. A. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+footprinting+analysis+software+for+high-throughput+quantification+of+nucleic+acid+footprinting+experiments.">Semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11, 344-354 (2005).</li><li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast.">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467, 103-107 (2010).</li><li>Underwood, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FragSeq:+transcriptome-wide+RNA+structure+probing+using+high-throughput+sequencing.">FragSeq: transcriptome-wide RNA structure probing using high-throughput sequencing.</a> Nat. Methods. 7, 995-1001 (2010).</li><li>Mauger, D. M., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+global+RNA+structure+analysis.">Toward global RNA structure analysis.</a> Nat. Biotechnol. 28, 1178-1179 (2010).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11063-11068 (2011).</li><li>Vasa, S. M., Guex, N., Wilkinson, K. A., Weeks, K. M., Giddings, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShapeFinder:+a+software+system+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+nucleic+acid+reactivity+information+resolved+by+capillary+electrophoresis.">ShapeFinder: a software system for high-throughput quantitative analysis of nucleic acid reactivity information resolved by capillary electrophoresis.</a> RNA. 14, 1979-1990 (2008).</li><li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAstructure:+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis.">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).</li><li>Pang, P. S., Elazar, M., Pham, E. A., Glenn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+RNA+secondary+structure+mapping+by+automation+of+SHAPE+data+analysis.">Simplified RNA secondary structure mapping by automation of SHAPE data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 39, e151 (2011).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 97-102 (2009).</li><li>Darty, K., Denise, A., Ponty, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VARNA:+Interactive+drawing+and+editing+of+the+RNA+secondary+structure.">VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure.</a> Bioinformatics. 25, 1974-1975 (2009).</li><li>Byun, Y., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PseudoViewer:+web+application+and+web+service+for+visualizing+RNA+pseudoknots+and+secondary+structures.">PseudoViewer: web application and web service for visualizing RNA pseudoknots and secondary structures.</a> Nucleic Acids Res. 34, 416-422 (2006).</li><li>Brown, T., Brown, D. J. S., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach. , 20 (1990).</li><li>Legiewicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+Transport+Element+of+the+Murine+musD+Retrotransposon+Requires+Long-range+Intramolecular+Interactions+for+Function.">The RNA Transport Element of the Murine musD Retrotransposon Requires Long-range Intramolecular Interactions for Function.</a> J. Biol. Chem. 285, 42097-42104 (2010).</li><li>Steen, K., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntheis+of+1-methyl-8-nitroisatoic+anhydride+(1M7).">Syntheis of 1-methyl-8-nitroisatoic anhydride (1M7).</a> Protocol Exchange. , (2011).</li><li>Mortimer, S. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast-acting+reagent+for+accurate+analysis+of+RNA+secondary+and+tertiary+structure+by+SHAPE+chemistry.">A fast-acting reagent for accurate analysis of RNA secondary and tertiary structure by SHAPE chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 4144-4145 (2007).</li><li>Mitra, S., Shcherbakova, I. V., Altman, R. B., Brenowitz, M., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-nucleotide+structural+mapping+by+capillary+automated+footprinting+analysis.">High-throughput single-nucleotide structural mapping by capillary automated footprinting analysis.</a> Nucleic Acids Res. 36, e63 (2008).</li><li>Giddings, M. C., Severin, J., Westphall, M., Wu, J., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+software+system+for+data+analysis+in+automated+DNA+sequencing.">A software system for data analysis in automated DNA sequencing.</a> Genome Res. 8, 644-665 (1998).</li><li>Aviran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+automation+of+sequencing-based+characterization+of+RNA+structure.">Modeling and automation of sequencing-based characterization of RNA structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11069-11074 (2011).</li></ol>

We presenteren hier een gedetailleerd protocol voor high-throughput SHAPE, een techniek die secundaire structuur wordt het mogelijk om single-nucleotide resolutie voor RNA&#39;s van elke omvang. Bovendien koppeling SHAPE experimentele data met secundaire structuurvoorspelling algoritmen vergemakkelijkt generatie RNA 2D modellen met een hogere nauwkeurigheid dan mogelijk is met deze methoden alleen is. De combinatie van fluorescent gemerkte primers en geautomatiseerde CE biedt aanzienlijke voordelen boven de traditionele...

Om de functies van katalytische en niet-coderende RNA&#39;s die betrokken zijn bij de regulatie van splicing, vertaling, virusreplicatie en kanker te begrijpen, is een gedetailleerde kennis van RNA structuur vereist 1,2. Helaas, nauwkeurige voorspelling van RNA vouwen vormt een enorme uitdaging. Klassieke indringende agenten lijden veel nadelen, zoals toxiciteit, onvolledige nucleotide dekking en / of doorvoer beperkt tot 100-150 nucleotiden per experiment. Zonder hulp secundaire structuurvoorspelling algoritmen zijn eveneens nadelig, vanwege onnauwkeurigheden als gevolg van hun onvermogen om effectief onderscheid tussen energetisch soortgelijke structuren. Grote RNAs in het bijzonder zijn vaak ongevoelig methoden 3D structuurbepaling zoals röntgenkristallografie en nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie, door hun conformationele flexibiliteit en grote hoeveelheden zeer zuivere monsters voor deze technieken. HIGH-throughput SHAPE lost veel van deze problemen door een effectieve, eenvoudige benadering sonderen van de structuur van grote RNA in single-nucleotide resolutie. Bovendien, de reagentia voor SHAPE veilig, gemakkelijk te hanteren en in tegenstelling tot de meeste andere chemische sonderen reagentia reageren met alle vier ribonucleotiden. Deze reagentia kunnen doordringen celmembranen, waardoor het mogelijk RNAs in hun in vivo omgeving sonde (s) 3. Oorspronkelijk ontwikkeld in het laboratorium Weken 4 is SHAPE gebruikt voor het analyseren van een breed scala van RNA, het meest opmerkelijke voorbeeld is de bepaling van de totale secundaire structuur van het ~ 9 kb HIV-1 RNA-genoom 5. Andere opmerkelijke prestaties met SHAPE omvatten opheldering van de structuur van besmettelijke viroïden 6, menselijk lange niet-coderende RNA&#39;s 7, gist ribosomen 8 en 9 riboswitches alsook identificeren eiwit bindingsplaatsen virion geassocieerde HIV-1 RNA 3. While de originele en high-throughput variaties van het SHAPE-protocol zijn elders 10-12 gepubliceerd, het huidige werk geeft een gedetailleerde beschrijving van de secundaire structuur van RNA bepaling door high-throughput SHAPE met fluorescerende oligonucleotiden, de Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer, en SHAPEfinder en RNAStructure (v5.3) software. Niet eerder gepubliceerde technische details en advies voor problemen zijn ook inbegrepen. Variaties van de SHAPE De essentie van SHAPE en variaties blootstelling van RNA in waterige oplossing elektrofiele anhydriden die selectief acyleren 2&#39;-hydroxyl (2&#39;-OH) groepen ribose, waardoor omvangrijke adducten op de plaatsen van modificatie. Deze chemische reactie dient als een middel ondervragen lokale RNA structurele dynamica enkelstrengs nucleotiden zijn meer vatbaar voor conformaties bevorderlijk elektrofiele aanval van deze reagentia aannemen, terwijl base gepaarde of architectonisch constrained nucleotiden zijn minder reactief of 10. Sites van adduct worden gedetecteerd door reverse transcriptie initiëren van fluorescerend of radioactief gemerkte primers gehybridiseerd met een bepaalde plek op de gemodificeerde RNA (de &quot;(+)&quot; primerverlengingsreactie). Bij reverse transcriptase (RT) nalaat de geacyleerde ribonucleotiden doorkruisen, wordt een pool van cDNA-producten geproduceerd waarvan de lengten samenvallen met sites van de wijziging. A control, &quot;(-)&quot; primerverlengingsreactie gebruik RNA dat niet is blootgesteld aan reagens is bovendien zo uitgevoerd, dat voortijdige beëindiging van DNA-synthese (bijvoorbeeld &quot;stops&quot;) door structuur-specifieke RNA-streng breuk, etc, kan RNA. worden onderscheiden van pauze te vervaardigd door chemische modificatie. Tenslotte worden twee dideoxy-sequentie-initiëren van dezelfde primers als merkers reactief nucleotiden correleren met het RNA primaire sequentie na elektroforese. In de oorspronkelijke aanvraag van SHAPE, dezelfde 32 P-end-gelabelde primer wordt gebruikt voor het (+), (-), en twee sequencing reacties. De in deze reacties worden geladen in aangrenzende putjes in een 5-8% Polyacrylamide slab-gel, en gefractioneerd door denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE, figuur 1). Kwantitatieve analyse van de gel beelden die door conventionele SHAPE kan worden uitgevoerd met SAFA, een semi-automatische footprinting analyse software 13. In contrast, high-throughput SHAPE gebruik fluorescerend gemerkte primers en geautomatiseerde capillaire elektroforese. Specifiek, voor elk gebied van RNA onderzochte een viertal DNA primers met een sequentie gemeenschappelijk, maar verschillende 5 &#39;fluorescerende labels worden gesynthetiseerd of gekocht. Deze verschillend gemerkte oligonucleotiden dienen om eerste twee SHAPE reacties en twee sequencing reacties waarvan de producten zijn samengevoegd en gefractioneerd / gedetecteerd door geautomatiseerde capillaire elektroforese (CE). Whereas het reactiviteitsprofiel van nt 100-150 van RNA kunnen worden verkregen uit een reeks van vier reacties met de oorspronkelijke benadering, high-throughput SHAPE resolutie van 300-600 nt uit een samengevoegd monster 3. Tot 8 sets van reacties kunnen gelijktijdig worden gefractioneerd, terwijl liefst 96 monsters bereid voor fractionering in de loop van 12 opeenvolgende CE runs (figuur 2). Bovendien, de SHAPEfinder software ontwikkeld om gegevens die uit de CEQ en andere genetische analysatoren bewerkt en geanalyseerd, is geautomatiseerd en vereisen minder gebruikersinterventie dan SAFA 13 of andere gel-analysepakketten. Meer geavanceerde high-throughput methodologieën zijn onlangs ontstaan ​​zoals PARS (parallelle analyse van RNA structuur) 14 en Frag-Seq (fragment-sequencing) 15, welke structuur-specifieke enzymen in plaats van alkylering reagentia in combinatie met de volgende generatie sequencing technieken te verkrijgen informatin over RNA-structuur. Ondanks de aantrekkelijkheid van deze technieken, de vele beperkingen die inherent zijn aan nuclease indringende nog steeds 16. Deze problemen kunnen worden omzeild in het SHAPE sequencing (SHAPE-Seq) 17 ontworpen waarbij next generation sequencing wordt voorafgegaan door chemische modificatie en reverse transcriptie van RNA in een soortgelijke wijze uitgevoerd in conventionele SHAPE. Hoewel deze methoden de toekomst van RNA structuurbepaling vertegenwoordigen, is het belangrijk om te onthouden dat de volgende generatie sequencing is zeer duur, en blijft beschikbaar voor vele laboratoria. SHAPE Data Analysis Gegevens die in de genetische analysator wordt gepresenteerd in de vorm van een elektroferogram, waarbij de fluorescentie-intensiteit van het monster (s) die door de capillaire detector wordt uitgezet tegen een index van migratietijd. Dit perceel heeft de vorm van overlappende sporen overeenkomen met de vier fluorescentiekanaals met de verschillende fluoroforen detecteren, en waarbij elk spoor bestaat uit pieken die overeenkomen met individuele cDNA sequentie of producten. Elektroferogram gegevens worden geëxporteerd uit de genetische analyse als een tab-gescheiden tekstbestand en in ShapeFinder transformatie en analysesoftware 18 geïmporteerd. ShapeFinder wordt eerst gebruikt om een ​​reeks van wiskundige transformaties op de gegevens zodat migratietijden en piekvolumes nauwkeurig de identiteit en hoeveelheid van de reactieproducten, respectievelijk. Pieken worden vervolgens uitgelijnd en geïntegreerd, en de resultaten in tabellen genoteerd met de primaire RNA-sequentie. Een &quot;reactiviteitsprofiel&quot; de relevante segment van RNA wordt verkregen door controlewaarden van de (+) waarden die bij elke nucleotide RNA, en het normaliseren van de gegevens hieronder beschreven. Dit profiel wordt geïmporteerd in RNAstructure (v5.3) software 19,20, waarbij de genormaliseerde reactiviteit val converteertwaarden in pseudo-energie beperkingen die zijn opgenomen in de secundaire structuur van RNA vouwen algoritme. Een combinatie van chemische en indringende vouwen algoritmen op deze wijze de nauwkeurigheid van structuurvoorspelling opzichte elke methode alleen 12,21 verbetert. De uitgang van RNAstructure (v5.3) bevat afbeeldingen van de laagste energie RNA secundaire structuren kleurcodering met SHAPE reactiviteitsprofiel (s), alsmede dezelfde structuren in tekstuele dot-haakjesnotering. Dit laatste kan vervolgens worden geëxporteerd naar software gewijd aan de grafische weergave van de secundaire structuur van RNA, zoals Varna 22 en PseudoViewer 23. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="4.8in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1.jpg" /> Figuur 1. Stroomschema van RNA structuurbepaling via SHAPE 4,10. (A) RNA may worden verkregen uit biologische monsters of door in vitro transcriptie. (B) Afhankelijk van de bron wordt RNA gevouwen of op andere wijze verwerkt en bewerkt met SHAPE reagens. (C) Reverse transcriptie met behulp van fluorescent of radioactief gelabelde primers. (D) cDNA-producten zijn gefractioneerde via ofwel capillaire of slab gel gebaseerde elektroforese. (E) Fragment analyse. (F) RNA structuur voorspelling. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2.jpg" /> Figuur 2. Het hoog-vermogen van CE-SHAPE snelle analyse van meerdere RNA en / of segmenten van hetzelfde RNA. (A) </strong&gt; Vertegenwoordigt hoe een RNA kan worden opgedeeld in 300-600 nt secties (kleurcode in groen, blauw en rood) (B) afdelingen van het RNA worden onafhankelijk gesondeerd met behulp van verschillende sets van fluorescente primers (zwarte pijlen) (C) Sets reacties worden samengevoegd en geladen in putten A1, B1, C1, etc, respectievelijk, het verstrekken van volledige dekking voor de ~ 3 kb RNA1. Reactieproducten van RNA&#39;s 2, 3, 4, enz. kunnen op dezelfde manier worden bereid voor fractionering in opeenvolgende elektroforetische runs. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylisatoic anhydride (NMIA)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>M25</td>
			<td>Dissolve in anhydrous DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7)</td>
			<td>see ref. 22</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>18080044</td>
			<td>10,000 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo sequenase cycle sequencing kit</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>78500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Materials provided by the user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA of interest</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6 pmol per reaction (the limit of detection will be determined by the instrument)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sets of four 5' labeled primers (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 and WellRed D1/Licor IR800)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Primers are complementary to the RNA and are used in reverse transcription and sequencing reactions. The listed fluorophores are optimal for the Beckman Coulter 8000 CEQ. Primers may be purchased or synthesized in house.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA template</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DNA is used for sequencing reactions, and must contain the sequence of the RNA being studied - including any 3'terminal extension, if present. Where applicable, it is often convenient to use the RNA transcription template.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x RNA renaturation buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X RNA folding buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (This buffer might be changed depending on the case (e.g. pH, EDTA, Mg, RNase inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5X RT mix</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 &mu;l 5X buffer, 1 &mu;l 100 mM DTT, 1.5 &mu;l water,1 &mu;l 10 mM dNTPs, 0.5 &mu;l SuperScript III. Note that the 5X buffer and 100 mM DTT are provided with purchase of SuperScript III (Invitrogen).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Sample Loading Solution (Beckman Coulter)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Attention: Avoid multiple freeze-thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>CEQ8000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>varies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna secondary structure prediction using high-throughput shape

Inzicht in de functie van RNA betrokken zijn bij biologische processen vereist een grondige kennis van de structuur van RNA. Voor dit doel wordt de methode genaamd &quot;high-throughput selectieve 2-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie&quot; of SHAPE, maakt voorspelling van secundaire structuur van RNA met enkele nucleotide resolutie. Deze aanpak maakt gebruik van chemische stoffen die bij voorkeur indringende acyleren enkelstrengs of flexibele gebieden van RNA in waterige oplossing. Sites van chemische modificatie worden gedetecteerd door reverse transcriptie van het gemodificeerde RNA en de producten van deze reactie worden gefractioneerd door geautomatiseerde capillaire elektroforese (CE). Aangezien reverse transcriptase onderbroken op de RNA nucleotiden gemodificeerd door de SHAPE reagentia, de resulterende cDNA-bibliotheek indirect mapping die ribonucleotiden die enkel zijn gestrand in de context van de gevouwen RNA. Gebruik ShapeFinder software, worden de elektroferogrammen door geautomatiseerde CE verwerkt en omgezet tot nucleotide reactiviteit tabellen die zich omgezet in pseudo-energie beperkingen die in de RNAStructure (v5.3) voorspelling algoritme. De tweedimensionale RNA structuren verkregen door het combineren SHAPE probing met in silico RNA secundaire structuur voorspelling is gevonden dat veel nauwkeuriger dan structuren verkregen bij procedure alleen.

RNA die het HIV-1 rev-responselement (RRE) en een 3&#39;-eindstandige structuur cassette 4 werd bereid uit een gelineariseerd plasmide door in vitro transcriptie, waarna het werd gevouwen door verwarming, koeling, en incubatie bij 37 ° C in aanwezigheid MgCl2. RNA werd blootgesteld aan NMIA en vervolgens reverse getranscribeerd van een 5&#39;-eindstandig gemerkt DNA primer gehybridiseerd aan het 3 &#39;terminale structuur cassette. De resulterende cDNA-bibliotheek SHAPE, en controle-en se...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE at JoVE.com

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

High-throughput selectieve 2-hydroxyl acylering geanalyseerd door primerverlenging (SHAPE) gebruikt een nieuwe chemische indringende techniek, reverse transcriptie, capillaire elektroforese en secundaire structuur predictie software om de structuren van RNA bepalen van enkele honderden tot enkele duizenden nucleotiden aan nucleotide resolutie.

RNA secundaire structuur Voorspelling behulp van High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Een protocol voor Computer-Based Protein Structure en functie Voorspelling

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

A Manual Small Molecule Screen Naderend High-throughput Met behulp van zebravis embryo&#39;s

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Zeer efficiënte Ligatie van Kleine RNA-moleculen voor MicroRNA Kwantificering van High-throughput sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Detectie van miRNA Doelen in High-throughput Met de 3&#39;LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...