Name: rna secondary structure prediction using high-throughput shape
Uploaded: 2013-05-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE at JoVE.com

S. Lusvarghi, J. Sztuba-Solinska, KJ Purzycka, JW Rausch et SFJ Le Grice sont pris en charge par le Programme de recherche intra-muros de l&#39;Institut national du cancer, National Institutes of Health, USA.

conception d&#39;amorce et l&#39;extension du terminal de l&#39;ARN 3 &#39; Pour analyser les longs ARN par le SHAPE à haut débit, une série de sites d&#39;hybridation des amorces doit être choisi de telle sorte qu&#39;ils (i) sont séparés par environ 300 nt, (ii) sont 20-30 nt en longueur, et (iii) que l&#39;ARN / hybrides d&#39;ADN produites par un recuit d&#39;ADN à ces sites ont une température de fusion prévue de&gt; 50 ° C. En outre, des segments d&#39;ARN qui sont prévus pour ...

<ol>
	<li>Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+regulatory+RNA+elements:+ribozymes+that+regulate+gene+expression.">Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).</li><li>Moore, P. B., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+RNA+in+the+synthesis+of+protein.">The roles of RNA in the synthesis of protein.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003780 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+SHAPE+analysis+reveals+structures+in+HIV-1+genomic+RNA+strongly+conserved+across+distinct+biological+states.">High-throughput SHAPE analysis reveals structures in HIV-1 genomic RNA strongly conserved across distinct biological states.</a> Plos Biol. 6, 883-899 (2008).</li><li>Merino, E. J., Wilkinson, K. A., Coughlan, J. L., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution+by+selective+2+'-hydroxyl+acylation+and+primer+extension+(SHAPE).">RNA structure analysis at single nucleotide resolution by selective 2 '-hydroxyl acylation and primer extension (SHAPE).</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4223-4231 (2005).</li><li>Watts, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+secondary+structure+of+an+entire+HIV-1+RNA+genome.">Architecture and secondary structure of an entire HIV-1 RNA genome.</a> Nature. 460, 711-716 (2009).</li><li>Xu, W., Bolduc, F., Hong, N., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+combination+of+computer-assisted+structure+prediction+and+SHAPE+probing+to+elucidate+the+secondary+structures+of+five+viroids.">The use of a combination of computer-assisted structure prediction and SHAPE probing to elucidate the secondary structures of five viroids.</a> Mol. Plant Pathol. , (2012).</li><li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+architecture+of+the+human+long+non-coding+RNA,+steroid+receptor+RNA+activator.">Structural architecture of the human long non-coding RNA, steroid receptor RNA activator.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5034-5051 (2012).</li><li>Leshin, J. A., Heselpoth, R., Belew, A. T., Dinman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+structural+analysis+of+yeast+ribosomes+using+hSHAPE.">High-throughput structural analysis of yeast ribosomes using hSHAPE.</a> RNA Biol. 8, 478-487 (2011).</li><li>Souliere, M. F., Haller, A., Rieder, R., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+approach+for+the+selection+of+2-aminopurine+substitution+sites+to+investigate+RNA+folding.">A powerful approach for the selection of 2-aminopurine substitution sites to investigate RNA folding.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 16161-16167 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2 '-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nat. Protoc. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D. S., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Shape+and+Hydroxyl+Radical+Analysis+of+Rna+Structure+and+Ribonucleoprotein+Assembly.">High-Throughput Shape and Hydroxyl Radical Analysis of Rna Structure and Ribonucleoprotein Assembly.</a> Method Enzymol. 468, 67-89 (2009).</li><li>Low, J. T., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE-directed+RNA+secondary+structure+prediction.">SHAPE-directed RNA secondary structure prediction.</a> Methods. 52, 150-158 (2010).</li><li>Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. S. A. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+footprinting+analysis+software+for+high-throughput+quantification+of+nucleic+acid+footprinting+experiments.">Semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11, 344-354 (2005).</li><li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast.">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467, 103-107 (2010).</li><li>Underwood, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FragSeq:+transcriptome-wide+RNA+structure+probing+using+high-throughput+sequencing.">FragSeq: transcriptome-wide RNA structure probing using high-throughput sequencing.</a> Nat. Methods. 7, 995-1001 (2010).</li><li>Mauger, D. M., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+global+RNA+structure+analysis.">Toward global RNA structure analysis.</a> Nat. Biotechnol. 28, 1178-1179 (2010).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11063-11068 (2011).</li><li>Vasa, S. M., Guex, N., Wilkinson, K. A., Weeks, K. M., Giddings, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShapeFinder:+a+software+system+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+nucleic+acid+reactivity+information+resolved+by+capillary+electrophoresis.">ShapeFinder: a software system for high-throughput quantitative analysis of nucleic acid reactivity information resolved by capillary electrophoresis.</a> RNA. 14, 1979-1990 (2008).</li><li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAstructure:+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis.">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).</li><li>Pang, P. S., Elazar, M., Pham, E. A., Glenn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+RNA+secondary+structure+mapping+by+automation+of+SHAPE+data+analysis.">Simplified RNA secondary structure mapping by automation of SHAPE data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 39, e151 (2011).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 97-102 (2009).</li><li>Darty, K., Denise, A., Ponty, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VARNA:+Interactive+drawing+and+editing+of+the+RNA+secondary+structure.">VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure.</a> Bioinformatics. 25, 1974-1975 (2009).</li><li>Byun, Y., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PseudoViewer:+web+application+and+web+service+for+visualizing+RNA+pseudoknots+and+secondary+structures.">PseudoViewer: web application and web service for visualizing RNA pseudoknots and secondary structures.</a> Nucleic Acids Res. 34, 416-422 (2006).</li><li>Brown, T., Brown, D. J. S., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach. , 20 (1990).</li><li>Legiewicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+Transport+Element+of+the+Murine+musD+Retrotransposon+Requires+Long-range+Intramolecular+Interactions+for+Function.">The RNA Transport Element of the Murine musD Retrotransposon Requires Long-range Intramolecular Interactions for Function.</a> J. Biol. Chem. 285, 42097-42104 (2010).</li><li>Steen, K., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntheis+of+1-methyl-8-nitroisatoic+anhydride+(1M7).">Syntheis of 1-methyl-8-nitroisatoic anhydride (1M7).</a> Protocol Exchange. , (2011).</li><li>Mortimer, S. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast-acting+reagent+for+accurate+analysis+of+RNA+secondary+and+tertiary+structure+by+SHAPE+chemistry.">A fast-acting reagent for accurate analysis of RNA secondary and tertiary structure by SHAPE chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 4144-4145 (2007).</li><li>Mitra, S., Shcherbakova, I. V., Altman, R. B., Brenowitz, M., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-nucleotide+structural+mapping+by+capillary+automated+footprinting+analysis.">High-throughput single-nucleotide structural mapping by capillary automated footprinting analysis.</a> Nucleic Acids Res. 36, e63 (2008).</li><li>Giddings, M. C., Severin, J., Westphall, M., Wu, J., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+software+system+for+data+analysis+in+automated+DNA+sequencing.">A software system for data analysis in automated DNA sequencing.</a> Genome Res. 8, 644-665 (1998).</li><li>Aviran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+automation+of+sequencing-based+characterization+of+RNA+structure.">Modeling and automation of sequencing-based characterization of RNA structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11069-11074 (2011).</li></ol>

Nous présentons ici un protocole détaillé pour la forme à haut débit, une technique qui permet de déterminer la structure secondaire de la résolution d&#39;un nucléotide simple pour des ARN de toute taille. En outre, le couplage des données du SHAPE expérimentales avec secondaires algorithmes de prédiction de structure facilite la génération de modèles 2D ARN avec un degré de précision plus élevé que ce qui est possible avec soit seule méthode. La combinaison d&#39;amorces marquées par fluorescence e...

Pour comprendre les fonctions des ARN catalytiques et non-codantes impliquées dans la régulation de l&#39;épissage, la traduction, la réplication du virus et le cancer, une connaissance détaillée de la structure d&#39;ARN est nécessaire 1,2. Malheureusement, la prédiction exacte du repliement des ARN constitue un formidable défi. Agents de sondage classiques souffrent de nombreux inconvénients tels que la toxicité, la couverture de nucléotides incomplètes et / ou le débit limité à 100-150 nucléotides par expérience. Secondaires algorithmes de prédiction de structure spontanées sont tout aussi désavantageux, en raison d&#39;inexactitudes résultant de leur incapacité à distinguer efficacement entre les structures énergiquement similaires. Grand ARN, en particulier, sont également souvent réfractaires aux procédés de détermination de la structure 3D telle que la cristallographie aux rayons X et par résonance magnétique nucléaire (RMN), en raison de leur flexibilité conformationnelle et de grandes quantités d&#39;échantillons de grande pureté nécessaires à ces techniques. HSHAPE aute-débit permet de résoudre nombre de ces problèmes en fournissant une approche efficace, simple à sonder les structures des grands ARN à la résolution d&#39;un nucléotide simple. En outre, les réactifs utilisés pour la forme sont sûrs, faciles à manipuler et, contrairement à la plupart des autres produits chimiques sondage réactifs, réagissent avec les quatre ribonucléotides. Ces réactifs peuvent aussi pénétrer dans les membranes cellulaires, ce qui permet de sonder ARN dans leur contexte in vivo (s) 3. Initialement développé dans les semaines laboratoire 4, SHAPE a été utilisée pour analyser une grande variété d&#39;ARN, l&#39;exemple le plus notable étant la détermination de la structure secondaire complète du ~ 9 kb ARN du VIH-1 du génome 5. Autres réalisations notables en utilisant SHAPE comprennent élucidation des structures de viroïdes infectieuses 6, ARN humains longs non codants 7, les ribosomes de levure 8 et 9 riboswitches ainsi que d&#39;identifier les sites de liaison de protéines à virion associée à ARN VIH-1 3. While aux variations originales et haut débit du protocole du SHAPE ont été publiés ailleurs 10-12, le présent ouvrage fournit une description détaillée de l&#39;ARN détermination de la structure secondaire par le SHAPE à haut débit en utilisant des oligonucléotides fluorescents, le Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer Beckman, et (v5.3) Logiciel de ShapeFinder et RNAStructure. Détails techniques inédites et des conseils de dépannage sont également inclus. Variations de forme L&#39;essence de forme et de ses variations est une exposition de l&#39;ARN en solution aqueuse à des anhydrides électrophiles qui acyler sélectivement 2&#39;-hydroxyle (2&#39;-OH), groupes ribose, produisant des produits d&#39;addition encombrants dans les sites de modification. Cette réaction chimique est un moyen d&#39;interroger la dynamique des structures d&#39;ARN locales, nucléotides simple brin sont plus enclins à adopter des conformations favorables à une attaque électrophile par ces réactifs, tandis que la base jumelé ou architectural constructionnucléotides ained sont moins ou pas réactif 10. Sites de la formation d&#39;adduits sont détectés par transcription inverse à partir d&#39;amorces initier par fluorescence ou radioactif hybridées à un site spécifique sur l&#39;ARN modifié (le &quot;(+)&quot; réaction d&#39;extension d&#39;amorce). Lorsque la transcriptase inverse (RT) ne parvient pas à traverser les ribonucléotides acylés, un pool de produits d&#39;ADNc est produit dont les longueurs coïncider avec les sites de modification. Un contrôle &quot;(-)&quot; primer extension de réaction en utilisant l&#39;ARN qui n&#39;a pas été exposé à un réactif est également effectuée de sorte que la résiliation prématurée de la synthèse d&#39;ADN (par exemple, «arrêts») en raison de structure de l&#39;ARN, non spécifique bris à ARN, etc, mai. être distinguée de faire une pause produite par modification chimique. Enfin, deux réactions séquençage didésoxy initiateurs des mêmes amorces sont utilisés comme marqueurs de corréler nucléotides réactifs avec la séquence primaire d&#39;ARN après électrophorèse. Dans la demande initiale de ShapE, le même 32P-fin-amorce marquée est utilisée pour la (+) - et les deux réactions de séquençage (). Les produits de ces réactions sont chargés dans des puits adjacents dans un gel de polyacrylamide de la dalle de 5-8%, et fractionné par électrophorèse dénaturante en gel de polyacrylamide (PAGE; figure 1). L&#39;analyse quantitative des images de gel produites par forme classique peut être réalisée en utilisant SAFA, un logiciel d&#39;analyse de l&#39;empreinte semi-automatique 13. En contraste, la forme à haut débit utilise des amorces marquées par fluorescence et électrophorèse capillaire automatisé. Plus précisément, pour chaque région d&#39;ARN sous enquête, une série de quatre amorces d&#39;ADN ayant une séquence commune mais différente 5 &#39;marqueurs fluorescents doivent être synthétisés ou achetés. Ces oligonucléotides différemment marquées premiers servent à deux réactions de forme et deux réactions de séquençage, dont les produits sont regroupés et fractionné / détectés par électrophorèse capillaire automatisée (CE). WherEAS le profil de réactivité de 100-150 nt de l&#39;ARN peut être obtenue à partir d&#39;un ensemble de quatre réactions en utilisant l&#39;approche originale, SHAPE à haut débit permet une résolution de 300-600 nt partir d&#39;un seul échantillon composite 3. Jusqu&#39;à 8 séries de réactions peut être fractionné en même temps, alors que pas moins de 96 échantillons peuvent préparé pour le fractionnement au cours de 12 séries consécutives CE (Figure 2). En outre, le logiciel de ShapeFinder, développé pour traiter et analyser les données issues de la CEQ et autres analyseurs génétiques, est plus automatisé et requiert beaucoup moins d&#39;intervention de l&#39;utilisateur que SAFA 13 ou d&#39;autres paquets gel-analyse. Méthodologies à haut débit les plus avancées ont récemment émergé comme PARS (analyse parallèle de structure de l&#39;ARN) 14 et Frag-Seq (fragment de séquençage) 15, qui utilisent des enzymes structure spécifique plutôt que réactifs d&#39;alkylation en conjonction avec la prochaine génération de techniques de séquençage à obtenir information sur la structure d&#39;ARN. Malgré l&#39;attrait de ces techniques, les nombreuses limitations inhérentes à la nucléase sondage demeurent 16. Ces problèmes peuvent être contournés dans le séquençage du SHAPE (SHAPE-Seq) 17 protocole, où le séquençage de prochaine génération est précédée par modification chimique et la transcription inverse de l&#39;ARN d&#39;une manière similaire à celle réalisée en forme classique. Bien que ces méthodes peuvent représenter l&#39;avenir de la détermination de la structure de l&#39;ARN, il est important de se rappeler que le séquençage de prochaine génération est très coûteux, et reste disponible pour de nombreux laboratoires. Analyse de données de forme Les données produites dans l&#39;analyseur génétique est présenté sous la forme d&#39;un électrophérogramme, dans lequel l&#39;intensité de la fluorescence de l&#39;échantillon (S) s&#39;écoulant à travers le détecteur capillaire est tracée en fonction d&#39;un index de temps de migration. Cette parcelle prend la forme de traces superposées correspondant au canal de quatre fluorescences utilisé pour détecter les fluorophores différents, et où chaque trace est constituée de pics correspondant à des produits de séquençage d&#39;ADNc ou individuels. données Electrophorégramme sont exportées de l&#39;analyseur génétique comme un fichier texte délimité par des tabulations et importés dans la transformation de ShapeFinder et des logiciels d&#39;analyse 18. ShapeFinder est initialement utilisé pour effectuer une série de transformations mathématiques sur les données afin de s&#39;assurer que les temps de migration et les volumes de pointe reflètent avec précision les identités et les quantités de produits de réaction, respectivement. Les pics sont alors alignés et intégrés, et les résultats compilés avec la séquence d&#39;ARN primaire. Un &quot;profil de réactivité&quot; pour le segment pertinent de l&#39;ARN est obtenue en soustrayant les valeurs de contrôle à partir des valeurs (+) associé à chaque nucléotide d&#39;ARN, et normaliser les données comme décrit ci-dessous. Ce profil est importé dans RNAstructure (v5.3) 19,20 logiciels, qui convertit le val de réactivité normaliséeues en contraintes pseudo-énergie qui sont incorporés dans l&#39;algorithme de pliage de la structure secondaire de l&#39;ARN. La combinaison chimique de sondage et de pliage algorithmes de cette manière améliore considérablement la précision de la prédiction de la structure par rapport à chaque méthode seule 12,21. La sortie de RNAstructure (v5.3) comporte des images de la plus basse énergie structures secondaires d&#39;ARN codés par couleur avec le profil du SHAPE de réactivité (s), ainsi que les mêmes structures en notation point-support textuel. Celui-ci peut ensuite être exporté vers un logiciel dédié à l&#39;affichage graphique de la structure secondaire de l&#39;ARN tels que Varna 22 et PseudoViewer 23. <img alt="Figure 1" fo:content-width="4.8in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1.jpg" /> Figure 1. Organigramme de la détermination de la structure de l&#39;ARN via SHAPE 4,10. (A) ARN may être obtenue à partir d&#39;échantillons biologiques ou par transcription in vitro. (B) Selon la source, l&#39;ARN est plié ou autrement traité et modifié avec le réactif du SHAPE. (C) La transcription inverse en utilisant des amorces fluorescente ou radioactive étiquetés. (d) les produits d&#39;ADNc sont fractionné soit par électrophorèse en gel capillaire ou de la dalle. (E) l&#39;analyse de fragments. (F) ARN prédiction de la structure. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2.jpg" /> Figure 2. Le caractère à haut débit de FORME CE à base permet l&#39;analyse rapide de plusieurs ARN, et / ou plusieurs segments de la même ARN. (A) </strong&gt; représente la façon dont un ARN peut être divisé en sections 300-600 NT (code couleur en vert, bleu et rouge) (b) les articles de l&#39;ARN sont détectés indépendamment en utilisant différents jeux d&#39;amorces fluorescentes (flèches noires) (C) ensembles de les réactions sont mises en commun et chargés dans les puits A1, B1, C1, etc, respectivement, en fournissant une couverture complète pour l&#39;ARN 1 ~ 3 kb. Les produits de réaction à partir d&#39;ARN 2, 3, 4, etc peuvent être préparés de manière similaire pour le fractionnement dans les courses électrophorétiques consécutifs. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure.</a>

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylisatoic anhydride (NMIA)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>M25</td>
			<td>Dissolve in anhydrous DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7)</td>
			<td>see ref. 22</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>18080044</td>
			<td>10,000 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo sequenase cycle sequencing kit</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>78500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Materials provided by the user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA of interest</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6 pmol per reaction (the limit of detection will be determined by the instrument)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sets of four 5' labeled primers (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 and WellRed D1/Licor IR800)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Primers are complementary to the RNA and are used in reverse transcription and sequencing reactions. The listed fluorophores are optimal for the Beckman Coulter 8000 CEQ. Primers may be purchased or synthesized in house.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA template</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DNA is used for sequencing reactions, and must contain the sequence of the RNA being studied - including any 3'terminal extension, if present. Where applicable, it is often convenient to use the RNA transcription template.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x RNA renaturation buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X RNA folding buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (This buffer might be changed depending on the case (e.g. pH, EDTA, Mg, RNase inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5X RT mix</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 &mu;l 5X buffer, 1 &mu;l 100 mM DTT, 1.5 &mu;l water,1 &mu;l 10 mM dNTPs, 0.5 &mu;l SuperScript III. Note that the 5X buffer and 100 mM DTT are provided with purchase of SuperScript III (Invitrogen).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Sample Loading Solution (Beckman Coulter)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Attention: Avoid multiple freeze-thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>CEQ8000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>varies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna secondary structure prediction using high-throughput shape

Comprendre la fonction de l&#39;ARN impliqués dans les processus biologiques requiert une connaissance approfondie de la structure de l&#39;ARN. À cette fin, la méthodologie baptisée «haut débit 2 sélectif &#39;acylation hydroxyle analysés par extension d&#39;amorce» ou la forme, permet de prédire la structure secondaire de l&#39;ARN avec une résolution au nucléotide. Cette approche utilise des agents chimiques de sondage qui ACYLATE préférentiellement régions câblé ou flexible simples d&#39;ARN en solution aqueuse. Sites de modification chimique sont détectés par transcription inverse de l&#39;ARN modifié, et les produits de cette réaction sont fractionnés par électrophorèse capillaire automatisé (CE). Depuis la transcriptase inverse s&#39;arrête à ces nucléotides d&#39;ARN modifiées par les réactifs de forme, la banque d&#39;ADNc résultant mappe indirectement ces ribonucléotides qui sont simple brin dans le contexte de l&#39;ARN repliées. Utiliser un logiciel de ShapeFinder, les électrophérogrammes produites par automatisé CE sont traités et transformés en nutables de réactivité cleotide qui sont eux-mêmes transformés en contraintes pseudo-énergie utilisée dans le RNAStructure (v5.3) de l&#39;algorithme de prédiction. Les structures d&#39;ARN à deux dimensions obtenues par combinaison d&#39;une forme de sondage avec in silico ARN prédiction de structure secondaire ont été trouvés à être beaucoup plus précis que les structures obtenues en utilisant soit la méthode utilisée seule.

ARN contenant le VIH-1 élément rev de réponse (RRE), et une extrémité 3 &#39;de la cassette de la structure 4 est préparé à partir d&#39;un plasmide linéarisé par la transcription in vitro, après quoi elle a été plié par chauffage, de refroidissement, et l&#39;incubation à 37 ° C en présence de MgCl 2. L&#39;ARN a été exposé à NMIA puis une transcription inverse à partir d&#39;une amorce d&#39;ADN 5&#39;-fin-marquée hybridée à la borne cassette de structur...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE at JoVE.com

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Haut-débit sélectif 2 &#39;acylation hydroxyle analysés par extension d&#39;amorce (SHAPE) utilise une nouvelle chimique sonder la technologie, la transcription inverse, l&#39;électrophorèse capillaire et les logiciels de prédiction de structure secondaire pour déterminer les structures des ARN de plusieurs centaines à plusieurs milliers de nucléotides à une résolution au nucléotide.

ARN prédiction de la structure secondaire via SHAPE à haut débit

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Haut débit écran surexpression plasmide de levure

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Recherche

Biologie

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Un protocole pour la structure des protéines Computer-Based et prédiction de la fonction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

À haut débit de cartographie physique des chromosomes à l&#39;aide automatisée<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Criblage à haut débit fonctionnelle utilisant une maison double lueur de dosage de luciférase

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Un petit écran Molecule Manuel approchant à haut débit utilisant embryons de poissons zèbres

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

La ligature très efficace de petites molécules d&#39;ARN pour microARN quantification par séquençage à haut débit

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Détection de cibles miARN dans à haut débit utilisant le test de 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identification de paires Kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...