Name: rna secondary structure prediction using high-throughput shape
Uploaded: 2013-05-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE at JoVE.com

ס Lusvarghi, ג&#39;Sztuba-סולינסקי, KJ Purzycka, ג&quot;ו ראוש וSFJ Le גרייס נתמך על ידי תכנית המחקר העירונית של המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומי לבריאות, ארה&quot;ב.

עיצוב פריימר והרחבה של תחנה סופית &#39;רנ&quot;א 3 כדי לנתח RNAs הארוך על ידי צורת תפוקה גבוהה, סדרה של אתרי הכלאה פריימר צריכה להיות כזה שהם בחרו (אני) מופרדים על ידי ~ 300 NT, (ii) הם 20-30 NT באורך, וכן (iii) כי RNA / הכלאיים DNA המיוצרים על ידי חישול DNA לא?...

<ol>
	<li>Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+regulatory+RNA+elements:+ribozymes+that+regulate+gene+expression.">Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).</li><li>Moore, P. B., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+RNA+in+the+synthesis+of+protein.">The roles of RNA in the synthesis of protein.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003780 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+SHAPE+analysis+reveals+structures+in+HIV-1+genomic+RNA+strongly+conserved+across+distinct+biological+states.">High-throughput SHAPE analysis reveals structures in HIV-1 genomic RNA strongly conserved across distinct biological states.</a> Plos Biol. 6, 883-899 (2008).</li><li>Merino, E. J., Wilkinson, K. A., Coughlan, J. L., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution+by+selective+2+'-hydroxyl+acylation+and+primer+extension+(SHAPE).">RNA structure analysis at single nucleotide resolution by selective 2 '-hydroxyl acylation and primer extension (SHAPE).</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4223-4231 (2005).</li><li>Watts, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+secondary+structure+of+an+entire+HIV-1+RNA+genome.">Architecture and secondary structure of an entire HIV-1 RNA genome.</a> Nature. 460, 711-716 (2009).</li><li>Xu, W., Bolduc, F., Hong, N., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+combination+of+computer-assisted+structure+prediction+and+SHAPE+probing+to+elucidate+the+secondary+structures+of+five+viroids.">The use of a combination of computer-assisted structure prediction and SHAPE probing to elucidate the secondary structures of five viroids.</a> Mol. Plant Pathol. , (2012).</li><li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+architecture+of+the+human+long+non-coding+RNA,+steroid+receptor+RNA+activator.">Structural architecture of the human long non-coding RNA, steroid receptor RNA activator.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5034-5051 (2012).</li><li>Leshin, J. A., Heselpoth, R., Belew, A. T., Dinman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+structural+analysis+of+yeast+ribosomes+using+hSHAPE.">High-throughput structural analysis of yeast ribosomes using hSHAPE.</a> RNA Biol. 8, 478-487 (2011).</li><li>Souliere, M. F., Haller, A., Rieder, R., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+approach+for+the+selection+of+2-aminopurine+substitution+sites+to+investigate+RNA+folding.">A powerful approach for the selection of 2-aminopurine substitution sites to investigate RNA folding.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 16161-16167 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2 '-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nat. Protoc. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D. S., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Shape+and+Hydroxyl+Radical+Analysis+of+Rna+Structure+and+Ribonucleoprotein+Assembly.">High-Throughput Shape and Hydroxyl Radical Analysis of Rna Structure and Ribonucleoprotein Assembly.</a> Method Enzymol. 468, 67-89 (2009).</li><li>Low, J. T., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE-directed+RNA+secondary+structure+prediction.">SHAPE-directed RNA secondary structure prediction.</a> Methods. 52, 150-158 (2010).</li><li>Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. S. A. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+footprinting+analysis+software+for+high-throughput+quantification+of+nucleic+acid+footprinting+experiments.">Semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11, 344-354 (2005).</li><li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast.">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467, 103-107 (2010).</li><li>Underwood, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FragSeq:+transcriptome-wide+RNA+structure+probing+using+high-throughput+sequencing.">FragSeq: transcriptome-wide RNA structure probing using high-throughput sequencing.</a> Nat. Methods. 7, 995-1001 (2010).</li><li>Mauger, D. M., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+global+RNA+structure+analysis.">Toward global RNA structure analysis.</a> Nat. Biotechnol. 28, 1178-1179 (2010).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11063-11068 (2011).</li><li>Vasa, S. M., Guex, N., Wilkinson, K. A., Weeks, K. M., Giddings, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShapeFinder:+a+software+system+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+nucleic+acid+reactivity+information+resolved+by+capillary+electrophoresis.">ShapeFinder: a software system for high-throughput quantitative analysis of nucleic acid reactivity information resolved by capillary electrophoresis.</a> RNA. 14, 1979-1990 (2008).</li><li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAstructure:+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis.">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).</li><li>Pang, P. S., Elazar, M., Pham, E. A., Glenn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+RNA+secondary+structure+mapping+by+automation+of+SHAPE+data+analysis.">Simplified RNA secondary structure mapping by automation of SHAPE data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 39, e151 (2011).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 97-102 (2009).</li><li>Darty, K., Denise, A., Ponty, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VARNA:+Interactive+drawing+and+editing+of+the+RNA+secondary+structure.">VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure.</a> Bioinformatics. 25, 1974-1975 (2009).</li><li>Byun, Y., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PseudoViewer:+web+application+and+web+service+for+visualizing+RNA+pseudoknots+and+secondary+structures.">PseudoViewer: web application and web service for visualizing RNA pseudoknots and secondary structures.</a> Nucleic Acids Res. 34, 416-422 (2006).</li><li>Brown, T., Brown, D. J. S., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach. , 20 (1990).</li><li>Legiewicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+Transport+Element+of+the+Murine+musD+Retrotransposon+Requires+Long-range+Intramolecular+Interactions+for+Function.">The RNA Transport Element of the Murine musD Retrotransposon Requires Long-range Intramolecular Interactions for Function.</a> J. Biol. Chem. 285, 42097-42104 (2010).</li><li>Steen, K., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntheis+of+1-methyl-8-nitroisatoic+anhydride+(1M7).">Syntheis of 1-methyl-8-nitroisatoic anhydride (1M7).</a> Protocol Exchange. , (2011).</li><li>Mortimer, S. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast-acting+reagent+for+accurate+analysis+of+RNA+secondary+and+tertiary+structure+by+SHAPE+chemistry.">A fast-acting reagent for accurate analysis of RNA secondary and tertiary structure by SHAPE chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 4144-4145 (2007).</li><li>Mitra, S., Shcherbakova, I. V., Altman, R. B., Brenowitz, M., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-nucleotide+structural+mapping+by+capillary+automated+footprinting+analysis.">High-throughput single-nucleotide structural mapping by capillary automated footprinting analysis.</a> Nucleic Acids Res. 36, e63 (2008).</li><li>Giddings, M. C., Severin, J., Westphall, M., Wu, J., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+software+system+for+data+analysis+in+automated+DNA+sequencing.">A software system for data analysis in automated DNA sequencing.</a> Genome Res. 8, 644-665 (1998).</li><li>Aviran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+automation+of+sequencing-based+characterization+of+RNA+structure.">Modeling and automation of sequencing-based characterization of RNA structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11069-11074 (2011).</li></ol>

אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט עבור צורה של תפוקה גבוהה, טכניקה המאפשרת קביעת מבנה משנית לרזולוצית נוקלאוטיד יחידה לRNAs בכל גודל. יתר על כן, צימוד נתוני צורה ניסיונית עם אלגוריתמים לחיזוי מבנה משניים מאפשר יצירת המודלים 2D RNA עם רמה גבוהה יותר של דיוק מאשר אפשרי עם כל אח?...

כדי להבין את הפונקציות של RNAs קטליטיים וללא קידוד מעורב בויסות של שחבור, תרגום, שכפול נגיף וסרטן, ידע מפורט של מבנה RNA נדרש 1,2. לרוע המזל, חיזוי מדויק של רנ&quot;א מתקפל מציג אתגר עצום. סוכני חיטוט הקלסיים סובלים מחסרונות רבים כגון רעילות, כיסוי חלקי נוקליאוטידים ו / או תפוקה מוגבלת ל100-150 נוקלאוטידים לכל ניסוי. אלגוריתמים לחיזוי מבנה משניים בכוחות עצמו הם דומה נחות, בשל אי דיוקים הנובעים מחוסר היכולת שלהם להבחין ביעילות בין מבנים אנרגטי דומים. RNAs גדול בפרט הם לעתים קרובות גם עקשן לשיטות של קביעת מבנה 3D כגון קריסטלוגרפיה רנטגן ותהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה, בשל הגמישות שלהם קונפורמציה וכמויות גדולות של דגימות טהורות ביותר הנדרשות לטכניקות אלה. HSHAPE igh תפוקה פותר רבים מהבעיות הללו על ידי מתן גישה יעילה, פשוטה לחיטוט המבנים של RNAs גדול ברזולוציה נוקלאוטיד יחידה. יתר על כן, את חומרים כימיים המשמשים עבור צורה בטוח, קל לטפל ו, בניגוד לרוב כימי אחרות חיטוט ריאגנטים, מגיבים עם כל ארבע ribonucleotides. ריאגנטים אלה יכולים גם לחדור ממברנות תאים, מה שמאפשר לחקור RNAs בהם בהקשר vivo (ים) 3. פותח במקור בשבועות המעבדה 4, צורה נעשתה שימוש כדי לנתח מגוון רחב של RNAs, הדוגמא הבולטת ביותר היא קביעת המבנה המשני המלא של ~ 9 KB HIV-1 RNA הגנום 5. הישגים בולטים אחרים בשימוש בצורה כוללים הבהרה של המבנים של viroids זיהומיות 6, RNAs אדם הארוך ללא קידוד 7, שמרי ריבוזומים 8, וriboswitches 9, כמו גם לזהות אתרי קישור בחלבון virion הקשורים RNA HIV-1 3. מה עלי לעשותאיל הווריאציות המקוריות ותפוקה גבוהה של פרוטוקול SHAPE כבר פורסם במקומות אחרים 10-12, העבודה הנוכחית מספקת תיאור מפורט של קביעת מבנה המשנית RNA על ידי צורת תפוקה גבוהה באמצעות oligonucleotides ניאון, מנתח Beckman Coulter CEQ 8000 הגנטי, ו SHAPEfinder וRNAStructure תוכנה (V5.3). פרטים טכניים שלא פורסמו בעבר ועצות לפתרון בעיות כלולות גם. וריאציות של צורה המהות של צורה והווריאציות שלה היא חשיפה של רנ&quot;א בתמיסה מימית לפטאליק electrophilic כי סלקטיבי acylate קבוצות (2&#39;-OH) 2&#39;-הידרוקסיל ריבוז, ייצור adducts המגושם באתרים של שינוי. תגובה כימית זו משמשת כאמצעי לחקירת דינמיקה מבנית מקומית RNA, נוקלאוטידים כיחידים תקועים נוטים יותר לאמץ תצורות תורמות להתקפת electrophilic על ידי חומרים כימיים האלה, ואילו בסיס לזווג או ארכיטקטוני constrנוקלאוטידים ained הם פחות או unreactive 10. אתרים של היווצרות adduct מזוהים על ידי שעתוק לאחור ייזום מfluorescently או radiolabeled פריימרים הכלאה לאתר מסוים ברנ&quot;א השונה (&quot;(+)&quot; תגובת ההארכה תחל). כאשר רברס טרנסקריפטאז (RT) לא מצליח לחצות את ribonucleotides acylated, בריכת של מוצרים מיוצרת cDNA שאורכי קנה אחד עם אתרים של שינוי. שליטה, &quot;(-)&quot; פריימר סיומת תגובת ניצול RNA שלא נחשף למגיב מבוצעת גם כדי שהסיום המוקדם של סינתזת דנ&quot;א (&quot;תחנות&quot;, כלומר) בשל מבנה RNA, שבר ספציפי RNA גדיל, וכו &#39;, במאי. להבדיל ממשתהה מיוצר על ידי שינוי כימי. לבסוף, שתי תגובות dideoxy-רצף ייזום מאותם פריימרים משמשות כסמנים כדי לקשר בין נוקלאוטידים תגובתי עם רצף הרנ&quot;א הראשוני בעקבות אלקטרופורזה. ביישום המקורי של ShapE, אותו 32-P-שכותרתו סוף פריימר מנוצל ל( +), - ושתי תגובות רצף (). מוצרים של תגובות אלה נטענים לתוך בארות סמוכות בג&#39;ל לוח polyacrylamide 5-8%, ומופרדים על ידי denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide (דף; איור 1). ניתוח כמותי של דימויי ג&#39;ל מיוצרים על ידי צורה קונבנציונלית יכול להתבצע באמצעות סאפא, תוכנת ניתוח footprinting חצי אוטומטית 13. לעומת זאת, צורת תפוקה גבוהה מעסיקה פריימרים שכותרתו fluorescently ואלקטרופורזה נימים אוטומטיות. באופן ספציפי, לכל אזור של רנ&quot;א תחת חקירה, סט של ארבעה פריימרים DNA בעלי רצף משותף אך שונה 5 &#39;תוויות ניאון חייבת להיות מסונתזים או נרכשו. oligonucleotides שונה שכותרתו אלה משמשים לשתי תגובות SHAPE הממשלה ושתי תגובות רצף, את המוצרים של אשר אספו ומופרד / זוהו על ידי אלקטרופורזה נימים אוטומטית (CE). WherEAS ניתן להשיג את פרופיל תגובתיות של 100-150 NT של רנ&quot;א מתוך סדרה של ארבע תגובות המשתמשות בגישה המקורית, צורת תפוקה גבוהה מאפשרת רזולוציה של 300-600 NT ממדגם 3 חד נקווה. עד 8 קבוצות של תגובות עשויים להיות מופרד בו זמנית, ואילו רבים כמו 96 דגימות יכולות מוכנות לחלוקה במהלך 12 ריצות לספירה רצופות (איור 2). יתר על כן, תוכנת SHAPEfinder, שפותחה כדי לעבד ולנתח נתונים העולים מתוך CEQ ומנתחים גנטיים אחרים, היא אוטומטית יותר ודורשת התערבות משתמש הרבה פחות מסאפא 13 או חבילות ג&#39;ל ניתוח אחרות. מתודולוגיות תפוקה גבוהה יותר מתקדמות שהתפתחו לאחרונה כגון PARS (ניתוח מקביל של מבנה RNA) 14 ו-Frag Seq (שבר-רצף) 15, המשתמש באנזימי מבנה ספציפיים ולא מגיבים לאלקילציה בשיתוף עם הדור הבא רצף טכניקות כדי להשיג information על מבנה RNA. למרות האטרקטיביות של טכניקות אלה, המגבלות רבות הגלומות לnuclease חיטוט עדיין יישארו 16. בעיות אלה ניתן לעקוף ברצף הצורה (SHAPE-Seq) 17 פרוטוקול, שבו הרצף של הדור הבא הוא קדמה שינוי כימי ושעתוק לאחור של RNAs באופן דומה לזה שבוצע בצורה קונבנציונלית. בעוד שיטות אלה עשויות לייצג את העתיד של קביעת מבנה RNA, חשוב לזכור שהרצף של הדור הבא הוא יקר מאוד, ונשאר זמין למעבדות רבות. ניתוח נתוני צורה נתונים שהופקו במנתח הגנטי מוצגים בצורה של electropherogram, שבו עוצמת הקרינה של הדוגמא (ו) זורמת דרך גלאי הנימים זממו נגד מדד של זמן הגירה. עלילה זו לובשת הצורה של עקבות חופפות המקבילה לערוץ הקרינה ארבעהים משמש כדי לזהות את fluorophores השונים, ובו כל עקבות מורכבת מפסגות מתאימות למוצרי cDNA או רצף בודדים. נתוני electropherogram מיוצאים מהמנתח הגנטי כקובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים ויובאו לשינוי ShapeFinder וניתוח תוכנה 18. ShapeFinder משמש בתחילה לבצע סדרה של טרנספורמציות מתמטיות על הנתונים כדי לוודא שפעמי הגירה והיקפי שיא משקפים במדויק את זהותם וכמויות של מוצרי התגובה, בהתאמה. פסגות הן אז מיושרות ומשולבים, ואת התוצאות נספרו יחד עם רצף הרנ&quot;א הראשוני. &quot;פרופיל תגובתיות&quot; למקטע הרלוונטי של רנ&quot;א מתקבל על ידי החסרת ערכי בקרה מ( +) ערכים הקשורים לכל רנ&quot;א נוקלאוטיד, ונרמול הנתונים כפי שיתואר להלן. פרופיל זה מיובא לRNAstructure (V5.3) 19,20 תוכנה, אשר ממירה val תגובתיות המנורמלues תוך אילוצים פסאודו אנרגיה שמשולבים באלגוריתם קיפול המבנה המשני RNA. שילוב כימי חיטוט וקיפול אלגוריתמים בדרך זו משפר באופן משמעותי את הדיוק של חיזוי מבנה בהשוואה לכל אחת מהשיטות לבד 12,21. הפלט של RNAstructure (V5.3) כולל תמונות של האנרגיה הנמוכה ביותר RNA מבנים משניים בצבעים עם צורת פרופיל תגובתיות (ים), כמו גם את אותם מבנים בסימון הדוט סוגר טקסטואלי. זו האחרונה עשויה להיות מיוצאות לתוכנה המיועדת לתצוגה הגרפית של מבנה המשני RNA כגון רנה 22 וPseudoViewer 23. <img alt="איור 1" fo:content-width="4.8in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה של קביעת מבנה RNA באמצעות SHAPE 4,10. () RNA מ &#39;איי יתקבלו מדגימות ביולוגיות או על ידי שעתוק במבחנה. (ב) בהתאם למקור, RNA הוא מקופל או מעובד בדרך אחרת ושונים עם מגיב SHAPE. (ג) שעתוק הפוך באמצעות פריימרים שכותרתו fluorescently או רדיואקטיבית. (D) מוצרי cDNA הם מופרדים באמצעות שתי אלקטרופורזה מבוססת ג&#39;ל נימים או לוח. (ה) ניתוח שבר. (F) ניבוי מבנה RNA. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2.jpg" /> איור 2. אופי התפוקה גבוהה של צורה מבוססת CE מאפשר ניתוח מהיר של RNAs מרובים, ו / או מקטעים מרובים של אותם רנ&quot;א. () </stרונג&gt; מייצג כיצד ניתן לחלק RNA לסעיפי 300-600 NT (מקודד לפי צבע בירוק, כחול ואדום) (ב) חלקים של RNA הם חקרו באופן עצמאי באמצעות סטים שונים של פריימרים ניאון (חיצים שחורים) (ג) סטים תגובות הם אספו והעמיסו לתוך בארות A1, B1, C1, וכו &#39;, בהתאמה, ומספקות כיסוי מלא ל~ 3 KB RNA1. תוצרי תגובה מRNAs 2, 3, 4, וכו &#39;יכול להיות מוכן באופן דומה לחלוקה בריצות electrophoretic רצופות. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylisatoic anhydride (NMIA)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>M25</td>
			<td>Dissolve in anhydrous DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7)</td>
			<td>see ref. 22</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>18080044</td>
			<td>10,000 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo sequenase cycle sequencing kit</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>78500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Materials provided by the user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA of interest</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6 pmol per reaction (the limit of detection will be determined by the instrument)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sets of four 5' labeled primers (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 and WellRed D1/Licor IR800)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Primers are complementary to the RNA and are used in reverse transcription and sequencing reactions. The listed fluorophores are optimal for the Beckman Coulter 8000 CEQ. Primers may be purchased or synthesized in house.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA template</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DNA is used for sequencing reactions, and must contain the sequence of the RNA being studied - including any 3'terminal extension, if present. Where applicable, it is often convenient to use the RNA transcription template.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x RNA renaturation buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X RNA folding buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (This buffer might be changed depending on the case (e.g. pH, EDTA, Mg, RNase inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5X RT mix</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 &mu;l 5X buffer, 1 &mu;l 100 mM DTT, 1.5 &mu;l water,1 &mu;l 10 mM dNTPs, 0.5 &mu;l SuperScript III. Note that the 5X buffer and 100 mM DTT are provided with purchase of SuperScript III (Invitrogen).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Sample Loading Solution (Beckman Coulter)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Attention: Avoid multiple freeze-thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>CEQ8000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>varies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna secondary structure prediction using high-throughput shape

הבנת תפקידו של רנ&quot;א המעורב בתהליכים ביולוגיים דורשת ידע מעמיק של מבנה RNA. לשם כך, את המתודולוגיה המכונה &quot;acylation הידרוקסיל 2 סלקטיבית תפוקה גבוהה &#39;נותח על ידי הארכה תחל&quot;, או צורה, מאפשרת חיזוי של מבנה המשני RNA עם רזולוציה נוקלאוטיד יחידה. גישה זו מנצלת סוכני חיטוט כימיים שמעדיפים acylate אזורים תקועים או גמישים בודדות של רנ&quot;א בתמיסה מימית. אתרים של שינוי כימי מזוהים על ידי שעתוק הפוך של RNA השונה, ואת המוצרים של התגובה הזו הם מופרדים על ידי אלקטרופורזה נימים אוטומטית (CE). מאז רברס טרנסקריפטאז הפסקות באותם נוקלאוטידים RNA שונה על ידי חומרים כימיים צורה, ספריית cDNA כתוצאה בעקיפין ממפה האלה ribonucleotides שהם תקועים אחת בהקשר של RNA המקופל. באמצעות תוכנת ShapeFinder, המיוצר על ידי את electropherograms האוטומטית לספירה מעובד והוסב לנושולחנות תגובתיות cleotide שהם עצמם הפכו לאילוצים פסאודו אנרגיה בשימוש באלגוריתם חיזוי RNAStructure (V5.3). את מבני RNA דו ממדים המתקבלים על ידי שילוב של SHAPE חיטוט עם בחיזוי מבנה המשני סיליקון ורנ&quot;א כבר נמצא להיות הרבה יותר מדויק מאשר מבנים המתקבלים בשני שיטות לבד.

RNA המכיל את רכיב ה-HIV-1 rev התגובה (RRE) ו&#39;3 קלטת מבנה טרמינל 4 הוכנה מפלסמיד לינארית ידי שעתוק במבחנה, אחרי שהיא הייתה מקופלת על ידי חימום, קירור, ודגירה על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של MgCl 2. RNA נחשף לNMIA ולאחר מכן להפוך עיבד מ פריימר 5&#39;-DNA הסוף שכותרתו הכלאה לקל?...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE at JoVE.com

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

acylation הידרוקסיל &#39;2 סלקטיבית תפוקה גבוהה נותח על ידי הארכה תחל (SHAPE) מנצל כימי רומן חיטוט טכנולוגיה, שעתוק לאחור, אלקטרופורזה נימים ותוכנות לחיזוי מבנה משנית כדי לקבוע את המבנים של RNAs מכמה מאה עד כמה אלף נוקלאוטידים ברזולוציה נוקלאוטיד יחידה.

חיזוי מבנה המשני RNA באמצעות SHAPE תפוקה גבוהה

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

פרוטוקול מבנה מחשב מבוסס חלבון חיזוי פונקציה

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...