Name: rna secondary structure prediction using high-throughput shape
Uploaded: 2013-05-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE at JoVE.com

S. Lusvarghi, J. Sztuba-Solinska, KJ Purzycka, JW Rausch och SFJ Le Grice stöds av Interna forskningsprogram av National Cancer Institute, National Institutes of Health, USA.

Primer design och förlängning av RNA-3&#39;-terminalen För att analysera långa RNA av hög genomströmning FORM, måste en rad platser primerhybridisering väljas så att de (i) är åtskilda av ~ 300 nt, (ii) är från 20 till 30 nt i längd, och (iii) att RNA / DNA-hybrider framställda genom glödgning DNA till dessa platser har en förväntad smälttemperatur&gt; 50 ° C. Dessutom bör segment av RNA som förutsägs vara mycket strukturerad undvikas, även om ett sådant fastställande ...

<ol>
	<li>Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+regulatory+RNA+elements:+ribozymes+that+regulate+gene+expression.">Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).</li><li>Moore, P. B., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+RNA+in+the+synthesis+of+protein.">The roles of RNA in the synthesis of protein.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003780 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+SHAPE+analysis+reveals+structures+in+HIV-1+genomic+RNA+strongly+conserved+across+distinct+biological+states.">High-throughput SHAPE analysis reveals structures in HIV-1 genomic RNA strongly conserved across distinct biological states.</a> Plos Biol. 6, 883-899 (2008).</li><li>Merino, E. J., Wilkinson, K. A., Coughlan, J. L., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution+by+selective+2+'-hydroxyl+acylation+and+primer+extension+(SHAPE).">RNA structure analysis at single nucleotide resolution by selective 2 '-hydroxyl acylation and primer extension (SHAPE).</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4223-4231 (2005).</li><li>Watts, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+secondary+structure+of+an+entire+HIV-1+RNA+genome.">Architecture and secondary structure of an entire HIV-1 RNA genome.</a> Nature. 460, 711-716 (2009).</li><li>Xu, W., Bolduc, F., Hong, N., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+combination+of+computer-assisted+structure+prediction+and+SHAPE+probing+to+elucidate+the+secondary+structures+of+five+viroids.">The use of a combination of computer-assisted structure prediction and SHAPE probing to elucidate the secondary structures of five viroids.</a> Mol. Plant Pathol. , (2012).</li><li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+architecture+of+the+human+long+non-coding+RNA,+steroid+receptor+RNA+activator.">Structural architecture of the human long non-coding RNA, steroid receptor RNA activator.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5034-5051 (2012).</li><li>Leshin, J. A., Heselpoth, R., Belew, A. T., Dinman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+structural+analysis+of+yeast+ribosomes+using+hSHAPE.">High-throughput structural analysis of yeast ribosomes using hSHAPE.</a> RNA Biol. 8, 478-487 (2011).</li><li>Souliere, M. F., Haller, A., Rieder, R., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+approach+for+the+selection+of+2-aminopurine+substitution+sites+to+investigate+RNA+folding.">A powerful approach for the selection of 2-aminopurine substitution sites to investigate RNA folding.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 16161-16167 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2 '-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nat. Protoc. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D. S., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Shape+and+Hydroxyl+Radical+Analysis+of+Rna+Structure+and+Ribonucleoprotein+Assembly.">High-Throughput Shape and Hydroxyl Radical Analysis of Rna Structure and Ribonucleoprotein Assembly.</a> Method Enzymol. 468, 67-89 (2009).</li><li>Low, J. T., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE-directed+RNA+secondary+structure+prediction.">SHAPE-directed RNA secondary structure prediction.</a> Methods. 52, 150-158 (2010).</li><li>Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. S. A. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+footprinting+analysis+software+for+high-throughput+quantification+of+nucleic+acid+footprinting+experiments.">Semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11, 344-354 (2005).</li><li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast.">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467, 103-107 (2010).</li><li>Underwood, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FragSeq:+transcriptome-wide+RNA+structure+probing+using+high-throughput+sequencing.">FragSeq: transcriptome-wide RNA structure probing using high-throughput sequencing.</a> Nat. Methods. 7, 995-1001 (2010).</li><li>Mauger, D. M., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+global+RNA+structure+analysis.">Toward global RNA structure analysis.</a> Nat. Biotechnol. 28, 1178-1179 (2010).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11063-11068 (2011).</li><li>Vasa, S. M., Guex, N., Wilkinson, K. A., Weeks, K. M., Giddings, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShapeFinder:+a+software+system+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+nucleic+acid+reactivity+information+resolved+by+capillary+electrophoresis.">ShapeFinder: a software system for high-throughput quantitative analysis of nucleic acid reactivity information resolved by capillary electrophoresis.</a> RNA. 14, 1979-1990 (2008).</li><li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAstructure:+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis.">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).</li><li>Pang, P. S., Elazar, M., Pham, E. A., Glenn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+RNA+secondary+structure+mapping+by+automation+of+SHAPE+data+analysis.">Simplified RNA secondary structure mapping by automation of SHAPE data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 39, e151 (2011).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 97-102 (2009).</li><li>Darty, K., Denise, A., Ponty, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VARNA:+Interactive+drawing+and+editing+of+the+RNA+secondary+structure.">VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure.</a> Bioinformatics. 25, 1974-1975 (2009).</li><li>Byun, Y., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PseudoViewer:+web+application+and+web+service+for+visualizing+RNA+pseudoknots+and+secondary+structures.">PseudoViewer: web application and web service for visualizing RNA pseudoknots and secondary structures.</a> Nucleic Acids Res. 34, 416-422 (2006).</li><li>Brown, T., Brown, D. J. S., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach. , 20 (1990).</li><li>Legiewicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+Transport+Element+of+the+Murine+musD+Retrotransposon+Requires+Long-range+Intramolecular+Interactions+for+Function.">The RNA Transport Element of the Murine musD Retrotransposon Requires Long-range Intramolecular Interactions for Function.</a> J. Biol. Chem. 285, 42097-42104 (2010).</li><li>Steen, K., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntheis+of+1-methyl-8-nitroisatoic+anhydride+(1M7).">Syntheis of 1-methyl-8-nitroisatoic anhydride (1M7).</a> Protocol Exchange. , (2011).</li><li>Mortimer, S. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast-acting+reagent+for+accurate+analysis+of+RNA+secondary+and+tertiary+structure+by+SHAPE+chemistry.">A fast-acting reagent for accurate analysis of RNA secondary and tertiary structure by SHAPE chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 4144-4145 (2007).</li><li>Mitra, S., Shcherbakova, I. V., Altman, R. B., Brenowitz, M., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-nucleotide+structural+mapping+by+capillary+automated+footprinting+analysis.">High-throughput single-nucleotide structural mapping by capillary automated footprinting analysis.</a> Nucleic Acids Res. 36, e63 (2008).</li><li>Giddings, M. C., Severin, J., Westphall, M., Wu, J., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+software+system+for+data+analysis+in+automated+DNA+sequencing.">A software system for data analysis in automated DNA sequencing.</a> Genome Res. 8, 644-665 (1998).</li><li>Aviran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+automation+of+sequencing-based+characterization+of+RNA+structure.">Modeling and automation of sequencing-based characterization of RNA structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11069-11074 (2011).</li></ol>

Vi presenterar här ett detaljerat protokoll för high-throughput SHAPE, en teknik som tillåter sekundär strukturbestämning till enkelsträngad nukleotid upplösning för RNA av alla storlekar. Dessutom koppling experimentella formdata med sekundära algoritmer struktur förutsägelse underlättar generering av RNA 2D-modeller med en högre grad av exakthet än vad som är möjligt med antingen enbart metoden. Kombinationen av fluorescensmärkta primrar och automatiserad CE ger betydande fördelar jämfört med tradi...

För att förstå funktionerna i katalytiska och icke-kodande RNA är inblandade i regleringen av splitsning, översättning, virusreplikation och cancer, är en detaljerad kunskap om RNA-struktur som krävs 1,2. Tyvärr visar exakt förutsägelse av RNA vikning en formidabel utmaning. Klassiska utforskande medel lider många nackdelar, såsom toxicitet, ofullständig nukleotid täckning och / eller genomströmning begränsad till 100-150 nukleotider per försök. Blotta sekundära struktur förutsägelse algoritmer är lika ofördelaktigt på grund av felaktigheter till följd av deras oförmåga att effektivt skilja mellan energiskt liknande strukturer. Stora RNA i synnerhet är också ofta är refraktära mot metoder för 3D strukturbestämning såsom röntgenkristallografi och kärnmagnetisk resonans (NMR), på grund av deras konformationell flexibilitet och stora mängder av höggradigt rena prov som behövs för dessa tekniker. HIGH-genomströmning FORM löser många av dessa problem genom att tillhandahålla ett effektivt och enkelt sätt att sondera strukturerna för stora RNA vid singel-nukleotid upplösning. Dessutom, de reagens som används för FORM är säkra, lätta att hantera och, i motsats till de flesta andra kemiska sondering reagenser, reagera med alla fyra ribonukleotider. Dessa reagens kan också penetrera cellulära membran, vilket gör det möjligt att sondera RNA i deras in vivo sammanhang (er) 3. Ursprungligen utvecklades under veckorna laboratorium 4, har SHAPE använts för att analysera en mängd olika RNA, det mest anmärkningsvärda exemplet är bestämning av fullständig sekundär struktur ~ 9 kb HIV-1 RNA-genom 5. Andra noterbara prestationer använder SHAPE omfattar klarläggande av strukturerna för smittsamma viroider 6, humana långa icke-kodande RNA 7, ribosomer jäst 8, och riboswitches 9 samt att identifiera proteinbindningsställena i virion-associerat HIV-1 RNA 3. While de ursprungliga och hög genomströmning variationer av formen-protokollet har publicerats på annat håll 10 till 12 tillhandahåller föreliggande arbete en detaljerad beskrivning av RNA-sekundärstruktur bestämning med hög genomströmning FORM använda fluorescerande oligonukleotider, Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer, och SHAPEfinder och RNAStructure (v5.3) mjukvara. Tidigare opublicerade tekniska detaljer och felsökning rådgivning ingår också. Variationer av FORM Kärnan i formen och dess varianter är exponering av RNA i vattenlösning för att elektrofila anhydrider som selektivt acylera 2&#39;-hydroxyl-(2&#39;-OH) ribos grupper, som producerar skrymmande addukter vid ställena för modifiering. Denna kemiska reaktion fungerar som ett medel för att förhöra lokala RNA strukturella dynamiken, såsom enkelsträngade nukleotider är mer benägna att anta konformationer som främjar elektrofilt angrepp av dessa reagens, medan basparad eller arkitektoniskt Constrained nukleotider är mindre eller icke reaktiva 10. Sites of adduktbildning detekteras genom omvänd transkription initiera från fluorescerande eller radiomärkt primrar hybridiserade till ett specifikt ställe på modifierat RNA (den &quot;(+)&quot; primerförlängningsreaktion). När omvänt transkriptas (RT) underlåter att korsa acylerade ribonukleotiderna, är en pool av cDNA produkter produceras vars längd sammanfaller med områden av modifiering. En kontroll, &quot;(-)&quot; primerförlängningsreaktion utnyttjar RNA som inte har exponerats för reagens utförs också så att för tidig avslutning av DNA-syntes (dvs. &quot;stopp&quot;) på grund av RNA-struktur, icke-specifik RNA-sträng går sönder, etc. kan. skiljas från pausa framställts genom kemisk modifiering. Slutligen är två dideoxi-sekvenseringsreaktioner initierande från samma primrar användas som markörer för att korrelera reaktiva nukleotider med RNA primära sekvensen efter elektrofores. I den ursprungliga ansökan av SHAPE, samma 32 P-ändmärkt primer utnyttjas för de (+), (-), och två sekvenseringsreaktioner. Produkter av dessa reaktioner är laddades i intilliggande brunnar på en 5-8% polyakrylamid slab gel och fraktioneras genom denaturerande polyakrylamidgelelektrofores (PAGE; Figur 1). Kvantitativ analys av gelén bilder som produceras av konventionell form kan utföras med användning SAFA, ett halvautomatiskt footprints analysprogram 13. I motsats härtill använder hög genomströmning FORM fluorescensmärkta primrar och automatiserad kapillärelektrofores. Specifikt för varje region av RNA under utredning, en uppsättning av fyra DNA-primers som har en gemensam sekvens men olika 5 &#39;fluorescerande markörer måste syntetiseras eller köpas. Dessa annorlunda-märkta oligonukleotider tjänar till prime två SHAPE reaktioner och två reaktioner sekvensering, de produkter som är sammanförda och fraktionerade / detekteras genom automatiserad kapillärelektrofores (CE). WherEAS reaktiviteten profil 100-150 nt av RNA kan erhållas från en uppsättning av fyra reaktioner med den ursprungliga metoden, gör high-throughput SHAPE upplösning på 300-600 nt från en poolad enda prov 3. Upp till 8 uppsättningar av reaktioner kan fraktioneras samtidigt, medan så många som 96 prover kan förberedas för fraktionering under loppet av 12 på varandra följande CE körningar (Figur 2). Dessutom är SHAPEfinder mjukvara, utvecklad för att bearbeta och analysera data som framkommit i CEQ och andra genetiska analysatorer, mer automatiserad och kräver mycket mindre åtgärder från användaren än SAFA 13 eller andra gel-analys paket. Mer avancerade high-throughput metoder har nyligen dykt upp som PARS (parallell analys av RNA struktur) 14 och Frag-Seq (fragment-sekvensering) 15, som använder struktur-specifika enzymer i stället reagenser alkyleringsprodukter i samband med nästa generations sekvensering tekniker för att erhålla INFORMATIOn om RNA-struktur. Trots intresset för dessa tekniker, de många inneboende begränsningar till nukleas sondering fortfarande 16. Dessa problem kan kringgås i form sekvensering (FORMEN-Seq) 17 protokoll, där nästa generations sekvensering föregås av kemisk modifiering och omvänd transkription av RNA på ett sätt liknande det som utförs i konventionell form. Även om dessa metoder kan representera framtiden för RNA-strukturbestämning, är det viktigt att komma ihåg att nästa generations sekvensering är mycket dyrt, och förblir otillgänglig för många laboratorier. FORM Dataanalys Data produceras i den genetiska analysatorn presenteras i form av ett elektroferogram, varvid fluorescensintensiteten hos provet (proven), som strömmar genom kapillären detektorn är avsatt mot ett index för migration tid. Denna kurva sker i form av överlappande spår som motsvarar de fyra fluorescenskanals används för att detektera de olika fluoroforer, och där varje spår består av toppar motsvarande enskilda cDNA-eller sekvensering produkter. Electropherogram data exporteras från den genetiska analysatorn som en tab-avgränsad textfil och importeras till ShapeFinder transformation och analys 18. ShapeFinder initialt används för att utföra en serie av matematiska transformationer på uppgifter att se till att migrationen gånger och topp volymer korrekt återspeglar identiteten och mängden av de reaktionsprodukter, respektive. Peaks är inriktas därefter och integreras, och resultaten tabuleras tillsammans med den primära RNA-sekvens. A &quot;reaktivitetsprofil&quot; för det relevanta segmentet av RNA erhålls genom att subtrahera kontrollvärden från (+) värden associeras med varje RNA nukleotid, och normalisera data som beskrivs nedan. Denna profil importeras till RNAstructure (v5.3) mjukvara 19,20, vilket omvandlar den normaliserade reaktivitet valderingar i pseudo-energi begränsningar som ingår i RNA sekundära strukturen fällbara algoritm. Kombinera kemisk sondering och vikning algoritmer på detta sätt avsevärt förbättrar noggrannheten hos strukturen förutsägelse jämfört med antingen enbart metoden 12,21. Utsignalen från RNAstructure (v5.3) innefattar bilder av den lägsta energin RNA sekundära strukturer färgkodade med formen reaktivitetsprofil (er), liksom samma strukturer i textform dot-hakparenteser. Det senare kan därefter exporteras till programvara avsedd för den grafiska visningen av RNA sekundär struktur såsom Varna 22 och PseudoViewer 23. <img alt="Figur 1" fo:content-width="4.8in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1.jpg" /> Figur 1. Flödesschema av RNA struktur beslutsamhet via SHAPE 4,10. (A) RNA may erhållas från biologiska prover eller genom in vitro transkription. (B) Beroende på källan, är RNA vikas eller på annat sätt bearbetas och modifieras med SHAPE reagens. (C) Omvänd transkription med fluorescerande eller radioaktivt märkta primers. (D) cDNA produkter fraktionerad via antingen kapillär eller platta gelbaserad elektrofores. (E) Fragment analys. (F) RNA struktur prediktion. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2.jpg" /> Figur 2. Den hög genomströmning karaktären hos CE-baserad FORM tillåter snabb analys av flera RNA, och / eller flera segment av samma RNA. (A) </strong&gt; Beskriver hur en RNA kan delas upp i 300-600 nt sektioner (färgkodade i grönt, blått och rött) (B) Delar av RNA sonderas självständigt med olika uppsättningar av fluorescerande primers (svarta pilar) (C) uppsättningar reaktioner poolas och laddas i brunnar A1, B1, C1, etc, respektive, vilket ger fullständig täckning för det ungefär 3 kb RNA1. Reaktionsprodukter från RNA 2, 3, 4, etc. kan framställas på liknande sätt för fraktionering i rad elektroforetiska körningar. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild.</a>

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylisatoic anhydride (NMIA)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>M25</td>
			<td>Dissolve in anhydrous DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7)</td>
			<td>see ref. 22</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>18080044</td>
			<td>10,000 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo sequenase cycle sequencing kit</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>78500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Materials provided by the user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA of interest</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6 pmol per reaction (the limit of detection will be determined by the instrument)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sets of four 5' labeled primers (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 and WellRed D1/Licor IR800)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Primers are complementary to the RNA and are used in reverse transcription and sequencing reactions. The listed fluorophores are optimal for the Beckman Coulter 8000 CEQ. Primers may be purchased or synthesized in house.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA template</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DNA is used for sequencing reactions, and must contain the sequence of the RNA being studied - including any 3'terminal extension, if present. Where applicable, it is often convenient to use the RNA transcription template.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x RNA renaturation buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X RNA folding buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (This buffer might be changed depending on the case (e.g. pH, EDTA, Mg, RNase inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5X RT mix</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 &mu;l 5X buffer, 1 &mu;l 100 mM DTT, 1.5 &mu;l water,1 &mu;l 10 mM dNTPs, 0.5 &mu;l SuperScript III. Note that the 5X buffer and 100 mM DTT are provided with purchase of SuperScript III (Invitrogen).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Sample Loading Solution (Beckman Coulter)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Attention: Avoid multiple freeze-thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>CEQ8000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>varies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna secondary structure prediction using high-throughput shape

Förstå funktionen hos RNA deltar i biologiska processer kräver en grundlig kunskap om RNA-struktur. För detta ändamål, den metod som kallas &quot;high-throughput selektiv 2 &#39;hydroxyl acylering analyseras av primerförlängning&quot;, eller form, möjliggör förutsägelse av RNA sekundär struktur med enda nukleotid upplösning. Detta tillvägagångssätt utnyttjar kemiska sondering agens som företrädesvis acylera enkelsträngade eller flexibla regioner i RNA i vattenlösning. Sites of kemisk modifiering detekteras genom omvänd transkription av modifierat RNA, och produkterna från denna reaktion är fraktioneras genom automatiserad kapillärelektrofores (CE). Eftersom omvänt transkriptas pausar vid dessa RNA nukleotider modifierade av formen reagenser, kartlägger resulterande cDNA-biblioteket indirekt de ribonucleotides som singel är strandsatta i samband med de vikta RNA. Använda ShapeFinder mjukvara, är de elektroferogrammen produceras av automatiserad CE bearbetas och omvandlas till nucleotide reaktivitet tabeller som är själva omvandlas till pseudo-energi begränsningar som används i RNAStructure (v5.3) förutsägelse algoritm. De tvådimensionella RNA-strukturer framställs genom att kombinera SHAPE sondering med in silico RNA förutsägelser av sekundär struktur har visat sig vara mycket mer exakta än strukturer erhållna med användning av endera metoden enbart.

RNA innehöll HIV-1 rev-svarselementet (RRE) och en 3&#39;-terminal struktur kassett 4 framställdes av en lineariserad plasmid genom transkription in vitro, varefter den viks för uppvärmning, kylning, och inkubering vid 37 ° C i närvaro MgCl2. RNA utsattes för NMIA och sedan omvänd transkription från en 5&#39;-ändmärkt DNA-primer hybridiserades till den 3&#39;-terminala strukturen kassett. Det resulterande FORM cDNA-biblioteket, tillsammans med styr-och sekvensering reaktioner, f...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE at JoVE.com

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Hög kapacitet selektiv 2-hydroxylen acylering analyserades genom primerförlängning (FORMEN) utnyttjar en ny kemisk sondering teknik, omvänd transkription, kapillärelektrofores och förutsägelser av sekundär struktur programvara för att bestämma strukturerna för RNA från flera hundra till flera tusen nukleotider vid enstaka nukleotid upplösning.

RNA förutsägelser av sekundär struktur med high-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Med hög kapacitet Jäst Plasmid Överuttryck skärm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Ett protokoll för datorbaserad proteiners struktur och funktion förutsägelse

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Hög genomströmning Kristallisering av membranproteiner Använda Lipidic Bicelle Metod

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Hög kapacitet fysisk Kartläggning av kromosomer med hjälp av automatiserad<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Hög kapacitet Funktionell Screening med hjälp av en hemmagjord Dual-glöd luciferas analys

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

En handbok Small Molecule Screen Närmar hög kapacitet Använda Zebrafish embryon

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Mycket effektiv Ligering av små RNA-molekyler för MicroRNA Kvantifiering av hög genomströmning sekvense

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Upptäckt av miRNA mål i hög kapacitet Använda 3&#39;LIFE analys

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identifiering av kinas-substrat par Använda högkapacitetsscreening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...