Name: separation of mouse embryonic facial ectoderm and mesenchyme
Uploaded: 2013-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme at JoVE.com

De auteurs willen graag Irene Choi bedanken voor het illustreren van embryo hoofden in figuur 1 en de andere leden van het laboratorium voor hulp en discussie. Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie ​​DE012728 (TW)

1. Bereid Dispase II <ol><li> Bereid Hepes-gebufferde zoutoplossing (HBS) (50 mM Hepes / KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Voeg 2 ml 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 en 1,2 ml 2,5 M NaCl in 16,8 ml Ultrapure H 2 O. </li><li> Maak 10 mg / ml Dispase II. Weeg 0,2 g Dispase II (Roche, Cat # 4942078001) en los op in 20 ml HBS. Bereid 1,0 ml aliquots in individuele Eppendorf buizen en bij -20 ° C voor lange termijn opslag. </li><li> Verdun 10 mg / ml Dispase II 1:10 in PBS voor gebruik. Zet de verdunde Dispase II op ijs. </li>...

<ol>
	<li>Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+craniofacial+development+and+malformation.">Genetics of craniofacial development and malformation.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).</li><li>Gritli-Linde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2+-+The+Etiopathogenesis+of+cleft+lip+and+cleft+palate:+usefulness+and+caveats+of+mouse+models.">Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models.</a> Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).</li><li>Schutte, B. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+and+factors+of+orofacial+clefts.">The many faces and factors of orofacial clefts.</a> Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).</li><li>Chai, Y., Maxson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+craniofacial+morphogenesis.">Recent advances in craniofacial morphogenesis.</a> Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).</li><li>Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+upper+lip:+Morphogenetic+and+molecular+mechanisms.">Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms.</a> Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).</li><li>Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodermal+WNT/&#946;-catenin+signaling+shapes+the+mouse+face.">Ectodermal WNT/&#946;-catenin signaling shapes the mouse face.</a> Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+analysis+of+gene+expression+during+growth+and+fusion+of+the+mouse+facial+prominences.">Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences.</a> PLoS ONE. 4, e8066 (2009).</li><li>Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+uses+of+mouse+outbred+stocks.">The origins and uses of mouse outbred stocks.</a> Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).</li><li>Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+the+mouse+Zic1,+Zic2,+and+Zic3+gene+suggests+an+essential+role+for+Zic+genes+in+body+pattern+formation.">The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation.</a> Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).</li><li>Britsch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Sox10+is+a+key+regulator+of+peripheral+glial+development.">The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development.</a> Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).</li></ol>

Dit protocol biedt een eenvoudige methode om embryonale muis gezicht ectoderm en mesenchym op basis van een eerste Dispase II behandeling stap te scheiden. In eerdere studies hebben we uitgevoerd ontleding van het gezicht verhevenheden vóór Dispase II behandeling, maar we hebben consistent gevonden dat het mesenchym wordt &quot;sticky&quot; en moeilijk te manipuleren. Onze nieuwe protocol voorkomt dit probleem. Combinatie Dispase II behandeling met zachte fysieke geweld door en neer te pipetteren maakt scheiding van e...

<table>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4942078001</td>
 <td>Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 &deg;C . </td>
 </tr>
 <td>RNAlater</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM7021</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
</table>

separation of mouse embryonic facial ectoderm and mesenchyme

Orofaciale schisis zijn de meest voorkomende craniofaciale defecten, waarvan 1,5 op 1.000 pasgeborenen wereldwijd 1,2. Orofaciale clefting wordt veroorzaakt door abnormale gezichtskenmerken ontwikkeling 3. Bij mens en muis, initiële groei en patroonvorming van het gezicht voert verschillende knopjes weefsel, het gezicht protuberansen 4,5. Het gezicht is afgeleid van zes grote protuberansen: gepaarde frontale neus processen (FNP), maxillaire protuberansen (MXP) en mandibulaire protuberansen (MDP). Deze uitsteeksels bestaan ​​uit zwellingen mesenchym die zijn ingekapseld in een bovenliggende epitheel. Studies in meerdere species is gebleken dat signalering overspraak tussen gezichts ectoderm en mesenchym is cruciaal voor het vormen van het vlak 6. Toch zijn mechanistische gegevens over de genen die betrokken zijn bij deze signalering relais ontbreekt. Een manier om een ​​beter begrip van gen-expressie te krijgen, transcriptiefactor binding en chromatine markeringen in verband met de ontwikping gezichts ectoderm en mesenchym is het isoleren en karakteriseren van de gescheiden weefselcompartimenten. Hier wordt een werkwijze voor het scheiden gezichts ectoderm en mesenchym op embryonale dag (E) 10.5 kritisch ontwikkelingsstadium muis gezicht formatie fusie van de uitsteeksels voorafgaat. Onze methode is een bewerking van de aanpak die we eerder hebben gebruikt voor het ontleden van het gezicht uitsteeksels 7. In deze eerdere studie hadden we werkzaam inteelt C57BL / 6 muizen als deze stam is uitgegroeid tot een standaard voor de genetica, genomics en gezicht morfologie 8. Hier echter, vanwege de beperktere hoeveelheden weefsel beschikbaar hebben we gebruik gemaakt van de outbred CD-1 stam die goedkoper in aanschaf, robuuster voor veeteelt, en de neiging om meer embryo (12-18) per nest dan inteelt produceren muizenstam 8. Na isolatie embryo werd neutraal protease Dispase II gebruikt om de hele embryo behandelen. Vervolgens werden de gezichts uitsteeksels ontledened uit en het gezicht ectoderm werd gescheiden van het mesenchym. Deze methode houdt zowel de gezichts ectoderm en mesenchym intact. Monsters die met deze methode kan worden gebruikt voor technieken zoals eiwitdetectie, chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assay, microarray studies en RNA-seq.

Na Dispase II behandeling, het ectoderm van het embryo meestal los. Het gezicht uitsteeksels moet intact na sectie (Figuur 2A). De geïsoleerde gezicht ectoderm is helder en vrij van mesenchym weefsel (figuur 2B). De werkzaamheid van het protocol bepalen en kruisbesmetting we getest voorhersenen detecteren uitgedrukt Zic3 9, ectodermale specifieke CDH1 5 en mesenchymale specifieke sox10 10 met reverse transcriptase PCR. Ons onderzoek bevestigde dat zowel...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme at JoVE.com

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Een protocol voor het scheiden van embryo gezichts ectoderm en mesenchym beschreven. We gebruiken Dispase II om eerst te behandelen hele embryo&#39;s, hele gezicht protuberansen ontleden, en dan scheiden de gezichts-ectoderm en mesenchym.

Scheiding van muis embryonale Facial ectoderm en mesenchym

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

Elektroforetische scheiding van eiwitten

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolatie en Afleiding van muis embryonale cellen Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo beeldvorming en therapeutische behandelingen in een orthotope Muis Model van eierstokkanker

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-gemedieerde Genetische Verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolatie en Cultuur van Cellen van de nefrogene Zone van de embryonale Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Gepolariseerde Translocatie van fluorescerende eiwitten in Xenopus Ectoderm in reactie op Wnt signalering

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Elektroporatie van Craniofaciale Mesenchym

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Voorbereiding van muis embryonale Fibroblast cellen die geschikt zijn voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Een systeem voor<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kweken van embryonale Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...