Name: separation of mouse embryonic facial ectoderm and mesenchyme
Uploaded: 2013-04-12T13:00:00
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Die Autoren bedanken sich bei Irene Choi zur Veranschaulichung Embryos Köpfe in Abb. 1 und den anderen Mitgliedern des Labors für Hilfe und Diskussion danken. Diese Arbeit wird durch NIH DE012728 (TW) unterstützt

Ein. Planen Dispase II <ol><li> Ansetzen Hepes-gepufferter Kochsalzlösung (HBS) (50 mM Hepes / KOH, pH 7,4, 150 mM NaCl). 2 ml 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 und 1,2 ml 2,5 M NaCl in 16,8 ml Reinstwasser H 2 O. </li><li> Machen Sie 10 mg / ml Dispase II. Wiegen 0,2 g Dispase II (Roche, Kat. Nr. 4942078001) und löst in 20 ml HBS. Bereiten Sie 1,0 ml Aliquots in einzelnen Eppendorf-Röhrchen und bei -20 ° C für die langfristige Lagerung. </li><li> Verdünnte 10 mg / ml Dispase II 1:10 in PBS vor der Verwendung....

<ol>
	<li>Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+craniofacial+development+and+malformation.">Genetics of craniofacial development and malformation.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).</li><li>Gritli-Linde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2+-+The+Etiopathogenesis+of+cleft+lip+and+cleft+palate:+usefulness+and+caveats+of+mouse+models.">Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models.</a> Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).</li><li>Schutte, B. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+and+factors+of+orofacial+clefts.">The many faces and factors of orofacial clefts.</a> Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).</li><li>Chai, Y., Maxson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+craniofacial+morphogenesis.">Recent advances in craniofacial morphogenesis.</a> Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).</li><li>Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+upper+lip:+Morphogenetic+and+molecular+mechanisms.">Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms.</a> Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).</li><li>Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodermal+WNT/&#946;-catenin+signaling+shapes+the+mouse+face.">Ectodermal WNT/&#946;-catenin signaling shapes the mouse face.</a> Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+analysis+of+gene+expression+during+growth+and+fusion+of+the+mouse+facial+prominences.">Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences.</a> PLoS ONE. 4, e8066 (2009).</li><li>Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+uses+of+mouse+outbred+stocks.">The origins and uses of mouse outbred stocks.</a> Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).</li><li>Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+the+mouse+Zic1,+Zic2,+and+Zic3+gene+suggests+an+essential+role+for+Zic+genes+in+body+pattern+formation.">The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation.</a> Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).</li><li>Britsch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Sox10+is+a+key+regulator+of+peripheral+glial+development.">The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development.</a> Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).</li></ol>

Dieses Protokoll bietet eine einfache Methode, um embryonale Maus Gesichts Ektoderm und Mesenchym auf einer anfänglichen Dispase II Behandlungsschritt Basis zu trennen. In früheren Studien haben wir Dissektion der Gesichtsmuskeln Protuberanzen vor Dispase II Behandlung durchgeführt, aber wir haben immer wieder festgestellt, dass das Mesenchym &quot;klebrig&quot; und schwieriger zu manipulieren wird. Unser neues Protokoll vermeidet dieses Problem. Kombination Dispase II Behandlung mit sanfte körperliche Gewalt durch ...

<table>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4942078001</td>
 <td>Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 &deg;C . </td>
 </tr>
 <td>RNAlater</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM7021</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
</table>

separation of mouse embryonic facial ectoderm and mesenchyme

Orofazialen Spalten sind die häufigsten kraniofazialen Defekten, die 1,5 Einfluss von 1.000 Neugeborenen weltweit 1,2. Orofazialen Spaltbildung durch abnorme Entwicklung des Gesichtes 3 ​​verursacht. Im menschlichen und Maus, anfängliche Wachstum und Strukturieren des Gesichts basiert auf mehreren kleinen Knospen von Gewebe, die Gesichtszüge Protuberanzen 4,5. Gepaart frontal Nasenfortsätze (FNP), Kiefer Protuberanzen (MXP) und Unterkiefer Protuberanzen (MDP): Das Gesicht wird von sechs Protuberanzen abgeleitet. Diese Protuberanzen aus Schwellungen des Bindegewebes, die eingehüllt in eine darüberliegende Epithel sind. Studies in mehreren Arten haben gezeigt, dass Signalisierung Übersprechen zwischen Gesichts Ektoderm und Mesenchym ist entscheidend für die Gestaltung der Fläche 6. Dennoch sind mechanistische Details hinsichtlich der Gene in diesen Melderelais beteiligt fehlen. Ein Weg, um ein umfassendes Verständnis der Genexpression zu gewinnen, Transkriptionsfaktorbindungsstellen und Chromatin Marken mit dem entwickelte assoziiertping Gesichts Ektoderm und Mesenchym ist zu isolieren und zu charakterisieren, die getrennten Gewebegruppen. Hier stellen wir ein Verfahren zum Trennen Gesichts Ektoderm und Mesenchym am embryonalen Tag (E) 10.5, eine kritische Entwicklungsstadium in Maus Gesichts Formation, die Fusion der Protuberanzen vorausgeht. Unsere Methode wird aus dem Ansatz, den wir zuvor zum Präparieren Gesichts Protuberanzen 7 verwendet haben, angepasst. In dieser früheren Studie hatten wir Inzucht C57BL eingesetzt / 6 Mäusen als dieser Sorte hat sich zu einem Standard für Genetik, Genomik und Gesichtsmorphologie 8. Hier jedoch aufgrund der beschränkten Mengen mehr von Gewebe vorhanden, haben wir die outbred CD-1-Stamm, der billiger ist erhältlich, robuster für Tierhaltung genutzt, und die dazu neigt, mehr Embryonen (12-18) pro Wurf als jede Inzuchtlinie produzieren Mausstamm 8. Nach Embryos Isolierung wurde neutrale Protease Dispase II verwendet werden, um den gesamten Embryo zu behandeln. Dann wurden die Gesichts Protuberanzen sezierened aus, und die Gesichtszüge Ektoderm wurde aus dem Mesenchym getrennt. Diese Methode hält sowohl die Gesichts Ektoderm und Mesenchym intakt. Die Proben unter Verwendung dieser Methodik kann für Techniken einschließlich Protein-Erkennung, Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Assay, Microarray-Studien und RNA-seq verwendet werden.

Nach Dispase II Behandlung, neigt das Ektoderm des Embryos locker zu sein. Die Gesichtszüge Protuberanzen sollte intakt sein nach der Sektion (Abbildung 2A). Die isolierte Gesichts Ektoderm ist klar und frei von Mesenchym Gewebe (Abbildung 2B). Um die Wirksamkeit des Protokolls zu bestimmen und um eine Kreuzkontamination wir getestet Vorderhirn detektieren ausgedrückt Zic3 9, ektodermalen spezifischen CDH1 5 und mesenchymalen spezifischen Sox10 10 mitt...

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Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Ein Protokoll für die Trennung von Embryos Gesichts Ektoderm und Mesenchym beschrieben. Wir verwenden Dispase II ganzen Embryonen ersten Behandlung, sezieren gesamten Gesichtsbereich Protuberanzen aus, und trennen Sie dann den Gesichtsausdruck Ektoderm und Mesenchym.

Trennung von embryonalen Maus-Facial Ektoderm und Mesenchym

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

Elektrophoretische Trennung von Proteinen

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Forschung

Biologie

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem Nephrogene Zone der embryonalen Maus Niere

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translokation von fluoreszierenden Proteinen in Xenopus Ektoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Elektroporation von Craniofacial Mesenchym

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

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A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

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An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...