Name: separation of mouse embryonic facial ectoderm and mesenchyme
Uploaded: 2013-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Irene Choi for å illustrere embryo hoder i Fig 1 og de andre medlemmene av laboratoriet for å få hjelp og diskusjon. Dette arbeidet støttes av NIH stipend DE012728 (TW)

1. Forbered Dispase II <ol><li> Tilberede ferske Hepes-bufret saltvann (HBS) (50 mM Hepes / KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Tilsett 2 ml 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 og 1,2 ml 2,5 M NaCl i 16,8 ml Ultrapure H 2 O. </li><li> Gjør 10 mg / ml Dispase II. Vei 0,2 g Dispase II (Roche, Cat # 4942078001) og oppløses i 20 ml HBS. Forbered 1,0 ml alikvoter i enkelte Eppendorf-rør og oppbevar ved -20 ° C for langtidslagring. </li><li> Fortynn 10 mg / ml Dispase II 1:10 i PBS før bruk. Sett utvannet Dispase II på isen. </...

<ol>
	<li>Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+craniofacial+development+and+malformation.">Genetics of craniofacial development and malformation.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).</li><li>Gritli-Linde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2+-+The+Etiopathogenesis+of+cleft+lip+and+cleft+palate:+usefulness+and+caveats+of+mouse+models.">Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models.</a> Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).</li><li>Schutte, B. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+and+factors+of+orofacial+clefts.">The many faces and factors of orofacial clefts.</a> Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).</li><li>Chai, Y., Maxson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+craniofacial+morphogenesis.">Recent advances in craniofacial morphogenesis.</a> Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).</li><li>Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+upper+lip:+Morphogenetic+and+molecular+mechanisms.">Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms.</a> Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).</li><li>Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodermal+WNT/&#946;-catenin+signaling+shapes+the+mouse+face.">Ectodermal WNT/&#946;-catenin signaling shapes the mouse face.</a> Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+analysis+of+gene+expression+during+growth+and+fusion+of+the+mouse+facial+prominences.">Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences.</a> PLoS ONE. 4, e8066 (2009).</li><li>Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+uses+of+mouse+outbred+stocks.">The origins and uses of mouse outbred stocks.</a> Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).</li><li>Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+the+mouse+Zic1,+Zic2,+and+Zic3+gene+suggests+an+essential+role+for+Zic+genes+in+body+pattern+formation.">The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation.</a> Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).</li><li>Britsch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Sox10+is+a+key+regulator+of+peripheral+glial+development.">The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development.</a> Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).</li></ol>

Denne protokollen gir en grei metode for å skille embryonale mus ansikts ektoderm og mesenchyme basert på en første Dispase II behandling trinn. I tidligere studier har vi utført disseksjon av ansikts prominenser før Dispase II behandling, men vi har stadig funnet at mesenchyme blir &quot;sticky&quot; og vanskeligere å manipulere. Vår nye protokollen eliminerer dette problemet. Kombinasjon Dispase II behandling med mild fysisk makt ved å pipettere opp og ned gjør separasjon av ektoderm og mesenchyme enklere. Vi...

<table>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4942078001</td>
 <td>Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 &deg;C . </td>
 </tr>
 <td>RNAlater</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM7021</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
</table>

separation of mouse embryonic facial ectoderm and mesenchyme

Orofacial kløfter er de hyppigste kraniofaciale defekter som påvirker 1,5 i 1000 nyfødte på verdensbasis 1,2. Orofacial clefting er forårsaket av unormal ansikts utvikling 3. Hos menneske og mus, innledende vekst og mønster av ansiktet avhengig flere små knopper av vev, ansikts prominenser 4,5. Ansiktet er avledet fra seks viktigste prominenser: sammenkoblede frontal nasal prosesser (FNP), overkjevens prominenser (MXP) og underkjevens prominenser (MDP). Disse prominenser består av hevelser i mesenchyme som er innkapslet i en overliggende epitel. Studier i flere arter har vist at signaliserer crosstalk mellom ansikts ektoderm og mesenchyme er kritisk for å forme ansiktet 6. Likevel er mekanistiske detaljer om gener som er involvert i disse signaliserer releer mangler. En måte å få en helhetlig forståelse av genekspresjon, transkripsjonsfaktor bindende, og kromatin merker forbundet med utvikledeping ansikts ektoderm og mesenchyme er å isolere og karakterisere de atskilte vev avdelinger. Her presenterer vi en metode for å skille ansikts ektoderm og mesenchyme på embryonale dag (E) 10,5, en kritisk utviklingsstadiet i mus ansikts formasjon som står foran fusjon av prominenser. Vår metode er tilpasset fra den tilnærmingen vi tidligere har brukt for å dissekere ansikts prominenser 7. I denne tidligere studie hadde vi ansatt innavlet C57BL / 6 mus som denne belastningen har blitt en standard for genetikk, genomikk og ansikts morfologi 8. Her, skjønt, på grunn av mer begrensede mengder vev tilgjengelig, har vi utnyttet outbred CD-en belastning som er billigere å kjøpe, mer robust for reindrift, og tending å produsere flere embryoer (12-18) per kull enn noen innavlede mus stamme 8. Etter embryo isolasjon, ble nøytral protease Dispase II brukes til å behandle hele embryo. Deretter ble ansikts prominenser dissekereed ut, og ansikts ektoderm ble skilt fra mesenchyme. Denne metoden holder både ansikts ektoderm og mesenchyme intakt. Prøvene oppnådd ved hjelp av denne metodikken kan brukes for teknikker inkludert protein deteksjon, kromatin immunoutfelling (chip) assay, mikromatriser studier, og RNA-seq.

Etter Dispase II behandling, har en tendens ektoderm av embryoet å være løs. Ansikts prominenser skal være intakt etter disseksjon (figur 2A). Den isolerte ansikts ektoderm er klar og fri for mesenchyme vev (figur 2B). Å bestemme effekten av protokollen, og å oppdage krysskontaminering vi analysert for forebrain uttrykt Zic3 9, ectodermal spesifikk cdh1 5 og mesenchymale spesifikk sox10 10 bruker revers transkriptase PCR. Våre studier bekreftet at...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme at JoVE.com

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

En protokoll for separasjon av embryo ansikts ektoderm og mesenchyme er beskrevet. Vi bruker Dispase II til å behandle hele embryoer først, dissekere hele ansikts prominenser ut, og deretter skille ansikts ektoderm og mesenchyme.

Separasjon av Mouse Embryonic Facial ektoderm og mesenchyme

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation av kraniofaciale Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Utarbeidelse av mus embryonale fibroblast celler Egnet for dyrking humane embryonale og Induced pluripotent stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Et system for<em&gt; Ex vivo</em&gt; Dyrking av Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

En Eksplantasjon Assay for å vurdere Cellular Behavior av Cranial mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...