Name: separation of mouse embryonic facial ectoderm and mesenchyme
Uploaded: 2013-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme at JoVE.com

Los autores desean agradecer a Irene Choi para ilustrar las cabezas de embriones en la figura 1 y los otros miembros del laboratorio en busca de ayuda y discusión. Este trabajo es apoyado por el NIH subvención DE012728 (TW)

1. Preparar Dispasa II <ol><li> Preparar fresco Hepes-solución salina tamponada (HBS) (50 mM HEPES / KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Añadir 2 ml de 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 y 1,2 ml de NaCl 2,5 M en 16,8 ml ultrapura H 2 O. </li><li> Hacer 10 mg / ml Dispasa II. Pesar 0,2 g Dispase II (Roche, Cat # 4942078001) y disolver en 20 ml de HBS. Preparar alícuotas de 1,0 ml en tubos individuales de Eppendorf y se almacena a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo. </li><li> Diluir 10 mg / ml Dispasa II 1:10 en PBS ...

<ol>
	<li>Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+craniofacial+development+and+malformation.">Genetics of craniofacial development and malformation.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).</li><li>Gritli-Linde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2+-+The+Etiopathogenesis+of+cleft+lip+and+cleft+palate:+usefulness+and+caveats+of+mouse+models.">Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models.</a> Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).</li><li>Schutte, B. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+and+factors+of+orofacial+clefts.">The many faces and factors of orofacial clefts.</a> Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).</li><li>Chai, Y., Maxson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+craniofacial+morphogenesis.">Recent advances in craniofacial morphogenesis.</a> Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).</li><li>Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+upper+lip:+Morphogenetic+and+molecular+mechanisms.">Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms.</a> Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).</li><li>Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodermal+WNT/&#946;-catenin+signaling+shapes+the+mouse+face.">Ectodermal WNT/&#946;-catenin signaling shapes the mouse face.</a> Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+analysis+of+gene+expression+during+growth+and+fusion+of+the+mouse+facial+prominences.">Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences.</a> PLoS ONE. 4, e8066 (2009).</li><li>Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+uses+of+mouse+outbred+stocks.">The origins and uses of mouse outbred stocks.</a> Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).</li><li>Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+the+mouse+Zic1,+Zic2,+and+Zic3+gene+suggests+an+essential+role+for+Zic+genes+in+body+pattern+formation.">The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation.</a> Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).</li><li>Britsch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Sox10+is+a+key+regulator+of+peripheral+glial+development.">The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development.</a> Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).</li></ol>

Este protocolo proporciona un método sencillo para separar ectodermo embrionario del ratón facial y el mesénquima basado en una etapa de tratamiento inicial Dispase II. En estudios anteriores, hemos realizado la disección de las prominencias faciales antes del tratamiento Dispasa II, pero hemos encontrado consistentemente que el mesénquima se vuelve &quot;pegajoso&quot; y más difícil de manipular. Nuestro nuevo protocolo evita este problema. Combinación Dispase II tratamiento con la fuerza física suave pipetean...

<table>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4942078001</td>
 <td>Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 &deg;C . </td>
 </tr>
 <td>RNAlater</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM7021</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
</table>

separation of mouse embryonic facial ectoderm and mesenchyme

Hendiduras orofaciales son los defectos craneofaciales más frecuentes, que afectan a 1,5 de cada 1.000 recién nacidos en todo el mundo 1,2. Hendidura orofacial es causada por el desarrollo facial anormal 3. En, humanos y de ratón de crecimiento inicial y el patrón de la cara se basa en varios brotes pequeños de tejido, las prominencias 4,5 faciales. La cara se deriva de seis pares de prominencias frontales principales: procesos nasales (FNP), prominencias maxilares (MXP) y prominencias mandibulares (MdP). Estas protuberancias consisten en hinchazones de mesénquima que se encajonan en un epitelio suprayacente. Los estudios en múltiples especies han mostrado que la señalización a la diafonía entre el ectodermo y el mesénquima facial es crítica para dar forma a la cara 6. Sin embargo, los detalles mecanicistas sobre los genes implicados en estos relés de señalización son insuficientes. Una forma de obtener una comprensión completa de la expresión génica, factor de transcripción de unión, y las marcas asociadas a la cromatina con el desarrollo de ciertasmesa de ping ectodermo y el mesénquima facial es aislar y caracterizar los compartimentos de tejido separados. Aquí presentamos un método para separar ectodermo y el mesénquima facial en el día embrionario (E) 10,5, una etapa crítica en el desarrollo en la formación de ratón facial que precede a la fusión de las prominencias. Nuestro método es una adaptación del enfoque que hemos utilizado anteriormente para disecar las prominencias faciales 7. En este estudio anterior que había empleado C57BL consanguínea / 6 ratones como esta variedad se ha convertido en un estándar para la genética, la genómica y la morfología facial 8. Aquí, sin embargo, debido a las cantidades más limitadas de tejido disponible, hemos utilizado el outbred cepa CD-1 que es más barato para comprar, más robusto para la cría, y que tiende a producir más embriones (12-18) por camada que cualquier endogámica ratón cepa 8. Después del aislamiento del embrión, proteasa neutra dispasa II se utiliza para tratar el embrión. Entonces, las prominencias faciales fueron diseccionared a cabo, y el ectodermo facial se separó a partir del mesénquima. Este método evita que tanto el ectodermo y el mesénquima facial intacto. Las muestras obtenidas utilizando esta metodología se puede utilizar para técnicas que incluyen la detección de proteínas, la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de ensayo, los estudios de microarrays, ARN y ss-.

Después Dispasa tratamiento II, el ectodermo del embrión tiende a ser flojo. Las prominencias faciales deben estar intactos después de la disección (Figura 2A). El ectodermo facial aislada es clara y libre de tejido mesénquima (Figura 2B). Para determinar la eficacia del protocolo y para detectar la contaminación cruzada que ensayaron para prosencéfalo expresó ZIC3 9, ectodérmica específico 5 CDH1 y mesenquimales específico SOX10 10 usando la ...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme at JoVE.com

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Un protocolo para la separación de ectodermo y el mesénquima facial embrión se describe. Utilizamos Dispasa II para el tratamiento de embriones enteros en primer lugar, analizar las prominencias faciales completas, y luego separar el ectodermo facial y mesénquima.

La separación de Ratón Facial ectodermo embrionario y mesénquima

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

Separación electroforética de las proteínas

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Investigación

Biología

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Mediada por adenovirus eliminación de moléculas de señalización genética en cultivos de fibroblastos de embriones de ratón primaria

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Aislamiento y cultivo de células de la zona nefrogénica del riñón de embriones de ratón

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Translocación polarizado de proteínas fluorescentes en Xenopus Ectodermo en respuesta a la señalización de Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporación de mesénquima craneofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparación de las células embrionarias de fibroblastos de ratón adecuados para el cultivo de células estaminales embrionarias humanas pluripotentes inducidas, y

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Un ensayo de explante para evaluar el comportamiento celular del mesénquima craneal

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...