Name: separation of mouse embryonic facial ectoderm and mesenchyme
Uploaded: 2013-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme at JoVE.com

Författarna vill tacka Irene Choi för att illustrera embryo huvuden i figur 1 och de övriga medlemmarna i laboratoriet för att få hjälp och diskussion. Detta arbete stöds av NIH bidrag DE012728 (TW)

1. Förbered Dispase II <ol><li> Bered färsk Hepes-buffrad saltlösning (HBS) (50 mM Hepes / KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Tillsätt 2 ml 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 och 1,2 ml 2,5 M NaCl i 16,8 ml Ultrapure H 2 O </li><li> Gör 10 mg / ml Dispase II. Väg 0,2 g Dispase II (Roche, Cat # 4942078001) och lös upp i 20 ml HBS. Förbered 1,0 ml portioner i enskilda Eppendorf-rör och förvara vid -20 ° C för långtidsförvaring. </li><li> Späd 10 mg / ml Dispase II 1:10 i PBS före användning. Sätt den utspädda...

<ol>
	<li>Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+craniofacial+development+and+malformation.">Genetics of craniofacial development and malformation.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).</li><li>Gritli-Linde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2+-+The+Etiopathogenesis+of+cleft+lip+and+cleft+palate:+usefulness+and+caveats+of+mouse+models.">Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models.</a> Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).</li><li>Schutte, B. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+and+factors+of+orofacial+clefts.">The many faces and factors of orofacial clefts.</a> Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).</li><li>Chai, Y., Maxson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+craniofacial+morphogenesis.">Recent advances in craniofacial morphogenesis.</a> Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).</li><li>Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+upper+lip:+Morphogenetic+and+molecular+mechanisms.">Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms.</a> Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).</li><li>Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodermal+WNT/&#946;-catenin+signaling+shapes+the+mouse+face.">Ectodermal WNT/&#946;-catenin signaling shapes the mouse face.</a> Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+analysis+of+gene+expression+during+growth+and+fusion+of+the+mouse+facial+prominences.">Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences.</a> PLoS ONE. 4, e8066 (2009).</li><li>Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+uses+of+mouse+outbred+stocks.">The origins and uses of mouse outbred stocks.</a> Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).</li><li>Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+the+mouse+Zic1,+Zic2,+and+Zic3+gene+suggests+an+essential+role+for+Zic+genes+in+body+pattern+formation.">The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation.</a> Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).</li><li>Britsch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Sox10+is+a+key+regulator+of+peripheral+glial+development.">The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development.</a> Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).</li></ol>

Detta protokoll ger en enkel metod för att separera embryonala mus ansiktet ektoderm och mesenkym baserat på en initial Dispase II behandling steg. I tidigare studier har vi utfört dissektion av ansikts protuberanser före Dispase II behandling, men vi har konsekvent funnit att mesenkym blir &quot;klibbiga&quot; och svårare att manipulera. Vår nya protokollet undviker detta problem. Kombination Dispase II behandling med mild fysisk kraft genom att pipettera upp och ned gör separation av ektoderm och mesenkym lätt...

<table>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4942078001</td>
 <td>Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 &deg;C . </td>
 </tr>
 <td>RNAlater</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM7021</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
</table>

separation of mouse embryonic facial ectoderm and mesenchyme

Orofaciala klyftor är de vanligaste kraniofaciala defekter som påverkar 1,5 i 1000 nyfödda i världen 1,2. Orofacial clefting orsakas av onormal ansikts utveckling 3. I människa och mus, första tillväxt och mönstring av ansiktet är beroende av flera små knoppar av vävnad, ansikts protuberanser 4,5. Ansiktet kommer från sex stora protuberanser: parade frontal näsan processer (FNP), maxillary protuberanser (MXP) och mandibular protuberanser (MDP). Dessa protuberanser består av svullnader i mesenkym som är inneslutna i ett överliggande epitel. Studier i flera arter har visat att signalering överhörning mellan ansiktet ektoderm och mesenkym är avgörande för att forma ansiktet 6. Ändå är mekanistiska uppgifter om de gener som är involverade i dessa signalreläerna saknas. Ett sätt att få en övergripande förståelse av genuttryck, transkriptionsfaktor bindande och märken kromatin i samband med utveckping ansiktet ektoderm och mesenkym är att isolera och karakterisera de separerade teoretiska vävnader. Här presenterar vi en metod för att separera ansiktet ektoderm och mesenkym på embryonala dag (E) 10,5, en kritisk utvecklingsstadium i mus ansiktet formation som föregår sammansmältning av protuberanser. Vår metod är anpassad från den strategi som vi har tidigare använts för dissekera ansiktet protuberanser 7. I denna tidigare studie hade vi anställda inavlade C57BL / 6 möss som denna stam har blivit en standard för genetik, genomik och ansikts morfologi 8. Här, men på grund av de mer begränsade mängder vävnad finns, har vi utnyttjat utavlat CD-1-stam som är billigare att köpa, mer robust för djurhållning, och tenderar att producera mer embryon (12-18) per kull än något inavlad musstammen 8. Efter embryo isolering, var neutralt proteas Dispase II används för att behandla hela embryot. Därefter var de ansikts protuberanser dissekeraed ut och ansiktet ektodermet separerades från mesenkym. Denna metod håller både ansiktet ektoderm och mesenkym intakt. De prover som erhölls med denna metod kan användas för tekniker inklusive protein upptäckt, kromatin immunoprecipitation (chip)-analys, microarray studier och RNA-seq.

Efter Dispase II behandling tenderar ektoderm av embryot vara lös. Ansikts protuberanser bör vara intakt efter dissektion (Figur 2A). Den isolerade ansiktet ektoderm är klar och fri från mesenkym vävnad (Figur 2B). För att bestämma effektiviteten av protokollet och att upptäcka korskontaminering vi analyserades för framhjärnan uttryckte Zic3 9, ektodermal specifika cdh1 5 och mesenkymala specifika sox10 10 med omvänt transkriptas-PCR. Våra st...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme at JoVE.com

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Ett protokoll för separering av embryo ansiktet ektoderm och mesenkym beskrivs. Vi använder Dispase II för att behandla hela embryon först dissekera hela ansiktet protuberanser ut, och sedan separera ansiktet ektoderm och mesenkym.

Separation av mus Embryonala Facial ektoderm och mesenkym

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

Elektrofores separation av proteiner

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolering och Härledning av Mouse Embryonala Germinal celler

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging och terapeutiska behandlingar i en Orthotopic musmodell av äggstockscancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-medierad genetisk Borttagning av signalmolekyler i odlade primära musknappen Embryonala fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolering och odling av celler från Nefrogen Zonen av embryonala Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polariserade flyttning av fluorescerande proteiner i Xenopus Ektoderm som svar på Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Elektroporation av Craniofacial mesenkym

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Beredning av mus Embryonala Fibroblastceller Lämplig för odling av humana embryonala och inducerade pluripotenta stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Ett system för<em&gt; Ex vivo</em&gt; Odling av embryonala Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Ett explantat analys för bedömning Cellular Beteende för Kranial mesenkym

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...