Name: separation of mouse embryonic facial ectoderm and mesenchyme
Uploaded: 2013-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme at JoVE.com

Yazarlar Şekil 1 ve yardım ve tartışma için laboratuvarın diğer üyeleri embriyonun kafaları göstermek için Irene Choi teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe DE012728 (TW) tarafından desteklenmektedir

1. Dispase II hazırlayın <ol><li> Hazırlama taze Hepes-tamponlu salin (HBS) (50 mM Hepes / KOH pH 7.4, 150 mM NaCl). 16.8 ml Ultra Saf H 2 O içine 2 ml 0,5 M Hepes / KOH pH 7.4 ve 1.2 ml 2.5 M NaCl ekle </li><li> 10 mg / ml dispase II olun. 0.2 g dispase II (Roche, Kedi # 4942078001) tartılır ve 20 ml HBS içinde çözülür. Uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;de bireysel Eppendorf tüpleri ve mağaza içinde 1.0 ml alikotları hazırlayın. </li><li> Kullanımdan önce PBS içinde 10 mg / ml di...

<ol>
	<li>Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+craniofacial+development+and+malformation.">Genetics of craniofacial development and malformation.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).</li><li>Gritli-Linde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2+-+The+Etiopathogenesis+of+cleft+lip+and+cleft+palate:+usefulness+and+caveats+of+mouse+models.">Chapter 2 - The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models.</a> Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).</li><li>Schutte, B. C., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+and+factors+of+orofacial+clefts.">The many faces and factors of orofacial clefts.</a> Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).</li><li>Chai, Y., Maxson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+craniofacial+morphogenesis.">Recent advances in craniofacial morphogenesis.</a> Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).</li><li>Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+upper+lip:+Morphogenetic+and+molecular+mechanisms.">Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms.</a> Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).</li><li>Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodermal+WNT/&#946;-catenin+signaling+shapes+the+mouse+face.">Ectodermal WNT/&#946;-catenin signaling shapes the mouse face.</a> Developmental Biology. 349, 261-269 (2011).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+analysis+of+gene+expression+during+growth+and+fusion+of+the+mouse+facial+prominences.">Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences.</a> PLoS ONE. 4, e8066 (2009).</li><li>Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+uses+of+mouse+outbred+stocks.">The origins and uses of mouse outbred stocks.</a> Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).</li><li>Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+the+mouse+Zic1,+Zic2,+and+Zic3+gene+suggests+an+essential+role+for+Zic+genes+in+body+pattern+formation.">The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation.</a> Developmental Biology. 182, 299-313 (1997).</li><li>Britsch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Sox10+is+a+key+regulator+of+peripheral+glial+development.">The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development.</a> Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).</li></ol>

Bu protokol, bir ilk dispase II işlenme adımını esas fare embriyonik yüz ektoderm ve mezenşim ayırmak için basit bir yöntem sağlamaktadır. Daha önceki çalışmalarda, önceden dispase II tedavi yüz çıkıntıları diseksiyonu uygulandı, ama biz sürekli mezenşimi &quot;yapışkan&quot; ve işlemek için daha zor hale gelmesidir bulduk. Bizim yeni protokol bu sorunu önler. Kombinasyon dispase II aşağı yukarı pipetleme ve tarafından nazik fiziksel gücü ile tedavi ektoderm ve kolay mezenşimi ayrı...

<table>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4942078001</td>
 <td>Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 &deg;C . </td>
 </tr>
 <td>RNAlater</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM7021</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
</table>

separation of mouse embryonic facial ectoderm and mesenchyme

Orofasiyal yarıkların 1000 bebekten dünya çapında 1,2 1,5 etkileyen en sık kraniofasiyal defektlerin vardır. Orofasiyal yarıklaşmanın anormal yüz gelişme 3 neden olur. Yüz insan ve fare, ilk büyüme ve desenlendirme içindeki doku birkaç küçük tomurcukları, 4,5 yüz çıkıntıları dayanır. Eşleştirilmiş frontal burun süreçler (FNP), maksiller çıkıntıların (MXP) ve mandibular çıkıntıların (MdP): yüz altı ana çıkıntıların türetilmiştir. Bu çıkıntılar bir örten epitel kaplı bulunmaktadır mezenşimi ve şişlikler oluşur. Birden fazla tür çalışmalar yüz ektoderm ve mezenşimi arasındaki karışma sinyal yüzünü 6 şekillendirme için kritik olduğunu göstermiştir. Ancak, bu sinyal röleleri Genlerdeki ilgili mekanistik ayrıntıları eksiktir. Bir gen ekspresyonu kapsamlı bir anlayış kazanmak için bir yol, bağlayıcı transkripsiyon faktörü ve develo ile ilişkili kromatin işaretleriping yüz ektoderm ve mezenşimi ayrılmış doku kompartmanları izole ve karakterize etmektir. Burada embriyonik gün (E) 10.5, çıkıntıların füzyon öncesinde fare yüz oluşumunda kritik bir gelişimsel aşamada yüz ektoderm ve mezenşimi ayırmak için bir yöntem mevcut. Bizim yöntemi daha önce yüz çıkıntıları 7 diseksiyon için kullanmış yaklaşımı uyarlanmıştır. Bu önceki çalışmada kendilenmiş C57BL istihdam vardı / Bu zorlanma gibi 6 farelerin genetik, genomik ve yüz morfolojisi 8 için bir standart haline gelmiştir. Burada, buna rağmen, uygun bir doku daha sınırlı miktarlarda nedeniyle, biz hayvancılık için, daha sağlam satın almak daha ucuzdur outbred CD-1 suşu kullanılmıştır ve herhangi kendilenmiş daha çöp başına daha fazla embriyo (12-18) üretmek eğilimi var fare zorlanma 8. Embriyo izolasyon takiben, nötr proteaz dispase II bütün embriyo tedavi etmek için kullanılmıştır. Sonra, yüz çıkıntıları teşrih edildied dışarı ve yüz ektodermden mezenşimi ayrıldı. Bu yöntem, yüz ektoderm ve mezenşim her ikisi de bozulmadan muhafaza eder. Bu yöntemi kullanarak elde edilen örneklerin protein tespiti, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) tayini, mikroarray çalışmalar ve RNA-seq dahil teknikleri kullanılabilir.

Dispase II Tedaviden sonra, embriyonun ektoderm gevşek olma eğilimindedir. Yüz çıkıntıları diseksiyonu (Şekil 2A) sonra sağlam olmalıdır. İzole yüz ektoderm net ve mezenşimi doku (Şekil 2B) ücretsizdir. Protokolünün etkinliğini belirlemek için ve biz önbeyin için tahlil çapraz kontaminasyon tespit Zic3 9, ektodermal belirli cdh1 5 ve ters transkriptaz PCR kullanarak mezenkimal belirli sox10 10 dile getirdi. Çalışmalarımız yü...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme at JoVE.com

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Embriyo yüz ektoderm ve mezenşimi ayrılması için bir protokol tanımlanmıştır. Biz, ilk bütün embriyolar tedavisinde tüm yüz çıkıntıları üzerinden incelemek dispase II kullanın ve sonra yüz ektoderm ve mezenşimi ayırın.

Fare Embriyonik Yüz Ektoderm ve mesenchyme ayrılması

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Separation of Proteins

Proteinlerin Elektrogöçer Ayırma

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Kültür İlköğretim Fare Embriyonik Fibroblastlar Sinyal Molekülleri Adenovirüs aracılı Genetik Kaldırma

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embriyonik Fare Böbrek Nefrojenik Zone Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Floresan Proteinleri Polarize Translokasyon Xenopus Wnt Sinyalizasyonu Cevabı Ektoderm

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Kraniofasial mezenşimin, Elektroporasyon

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...