Name: measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions
Uploaded: 2013-04-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH R01 GM50322 til PM Kane. Forfatterne takker Dr. Rajini Rao, Johns Hopkins University til at give gær pHluorin plasmider og rådgivning om ratiometrisk pH-målinger, og Dr. Gloria A. Martinez Munoz for at arbejde ud af disse protokoller for vores lab.

1. Måling af vacuolær pH in vivo under anvendelse BCECF-AM <ol><li> Dyrk en 50 ml flydende kultur af gærstammen, der skal måles i det ønskede medium natten over. Målet er at have celler i midten-log-fase (OD600 (optisk tæthed ved 600 nm) måling af cirka 0,8 til suspensionen). </li><li> Pellet gærcellerne ved centrifugering. Pellet resuspenderes i 0,6 ml af vækstmediet og overførsel til et mikrocentrifugerør, der er blevet vejet tidligere. Pellet cellerne igen i en mikrocentrifuge ved 2.000 xg i 60...

<ol>
	<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensors+and+regulators+of+intracellular+pH.">Sensors and regulators of intracellular pH.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).</li><li>Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+is+a+tightly+controlled+signal+in+yeast.">Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).</li><li>Diakov, T. T., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+activity+and+assembly+by+extracellular+pH.">Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH.</a> J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).</li><li>Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+and+plasma+membrane+proton+pumps+collaborate+to+achieve+cytosolic+pH+homeostasis+in+yeast.">Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast.</a> J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).</li><li>Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+loss+of+Vph1+protein-containing+vacuolar+ATPases+(V-ATPases)+for+overall+cellular+pH+homeostasis.">Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).</li><li>Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+of+vacuolar+acidification+in+H(+)-ATPase-deficient+yeast.">Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast.</a> J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).</li><li>Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+sodium/proton+exchange+by+a+Rab-GTPase-activating+protein+regulates+endosomal+traffic+in+yeast.">Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast.</a> J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endosomal+Na+K+/H++exchanger+Nhx1+regulates+cellular+pH+to+control+vesicle+trafficking.">The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).</li><li>Owen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+spectrum-shifting+intracellular+pH+probes+5'(and+6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7,+1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one+and+2',7'-biscarboxyethyl-5(and+6)-carboxyfluorescein.">Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein.</a> Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).</li><li>Dechant, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+pH+is+a+second+messenger+for+glucose+and+regulates+the+PKA+pathway+through+V-ATPase.">Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase.</a> Embo J. 29, 2515-2526 (2010).</li><li>Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+of+monensin+sensitivity+in+yeast:+implications+for+post-Golgi+traffic+and+vacuolar+H+-ATPase+function.">Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function.</a> Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).</li><li>Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionophores+and+intact+cells.+I.+Valinomycin+and+nigericin+act+preferentially+on+mitochondria+and+not+on+the+plasma+membrane+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).</li><li>Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+CLC+protein+counteracts+vesicular+acidification+during+iron+starvation.">The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation.</a> J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).</li><li>Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+cytosolic+and+mitochondrial+pH+using+a+pH-sensitive+GFP+derivative+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+relation+between+intracellular+pH+and+growth.">In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth.</a> Microbiology. 155, 268-278 (2009).</li><li>Zhang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+ergosterol+in+V-ATPase+function+underlies+antifungal+activity+of+azole+drugs.">Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).</li><li>Brett, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+the+vacuolar+pH-stat+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 6, e17619 (2011).</li><li>Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+yeast+vacuole.">Methods for studying the yeast vacuole.</a> Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).</li><li>Chan, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+V-ATPase+proton+transport+reveal+uncoupling+functions+of+tether+linking+cytosolic+and+membrane+domains+of+V0+subunit+a+(Vph1p).">Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p).</a> J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).</li><li>Johnson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+inhibitors+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+pumps+in+yeast+by+high-throughput+screening+flow+cytometry.">Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry.</a> Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).</li></ol>

Vi har udnyttet disse protokoller for at løse en række aspekter af pH homeostase. For eksempel har vi sammenlignet cytosol og pH reaktioner vildtype og V-ATPase-mutant celler 4,5. Vi har også undersøgt virkningerne af ændrede vækstbetingelser, især ekstracellulære pH, om vakuolær pH respons på glukose 3.. Vigtigere er det, de svar vi observerer er både i overensstemmelse med andre metoder til kvantitativ måling af pH og biokemiske data, der beskriver ændrede aktiviteter protonpumperne....

pH homeostase er en dynamisk og stærkt reguleret proces i alle organismer 1,2. Biokemiske processer er stramt reguleret af pH, og intracellulære miljøer er tunet til smalle pH-områder for at tillade optimal aktivitet af de residente enzymer. Dog kan intracellulær pH ​​homeostase blive udfordret af hurtige ændringer i miljøet pH, metaboliske forskydninger, samt visse signalveje. Desuden kan intracellulær pH ​​i sig selv tjene som et vigtigt signal. Endelig har mange organeller opretholde luminale pH-værdier, som er forskellige fra den omgivende cytosolen og afgørende for organel-specifikke funktioner. Gær Saccharomyces cerevisiae deler en række pH homeostase mekanismer med højere eukaryoter 2. I de sure organeller i endocytiske / lysosomale vejen er pH primært styret af højkonserveret vakuolær proton-translocating ATPase (V-ATPase), der optræder sammen med mange exchangers afhængige af pH-gradienten. Alle eukaryote celler også proton eksport mekanismer. I svampe og planter, et sekund, der adskiller proton pumpe på plasmamembranen, Pma1, eksport metaboliske protoner og menes at være den afgørende faktor for cytosol pH og plasma membran potentiale. Den genetiske fleksibilitet S. cerevisiae og dens kommercielle betydning, har gjort det til en meget interessant og vigtig model for at studere pH homeostase 2.. Ud over at være de primære drivkræfter for organel forsuring, er V-ATPaser stærkt reguleret enzymer og vores lab er interesseret i at forstå mekanismerne i V-ATPase regulering. Til dette mål, har vi brugt in vivo pH målinger af vacuolær og cytosol pH: 1) at overvåge reaktioner på skiftende ekstracellulære forhold, såsom glucose afsavn og readdition, 2) at undersøge virkningerne af mutationer, der kompromitterer V-ATPase aktivitet, og 3) at udforske koordinering af organel og plasma membran protonpumperne 3-5. Disse eksperimenter blev kun mulig gennem udvikling af robuste ratiometrisk pH indikatorer medgørlig at bruge i gærceller. . Plant m.fl. først viste at BCECF (2&#39;7&#39;-bis-(2-carboxyethyl) -5 - (og 6)-carboxyfluorescein), der har været anvendt bredt til at måle cytosolisk pH i pattedyrceller, ophobes i gær vakuolen i stedet for cytosol 6.. Denne forskel i BCECF lokalisering er blevet tilskrevet de mange hydrolytiske enzymer i vakuolet, som sandsynligvis er ansvarlig for spaltning af acetoxy-methylester fra BCECF-AM (acetoxymethyl ester af BCECF) og vacuolær tilbageholdelse 6.. Ali et al. 7. videreudviklet vacuolær pH-måling med BCECF og tilpasset disse målinger til en fluorescenspladelæser format. Brett et al. Indført gær pHluorin som et middel til at måle cytosolisk pH i gær ved at udtrykke en plasmidbåret ratiometric pH-følsom GFP 8 under styring af en gær-promotor 9. Excitation spektre af både BCECF og gær pHluorin er følsomme over for pH, så de anvendes som ratiometrisk pH indikatorer, hvor forholdet af fluorescens ved to excitationsbølgelængder, målt på en enkelt emissionsbølgelængde, giver et mål for pH 8,10. Disse gær vakuolære og cytosol pH-sensorer er blevet brugt til både encellede og populations-baserede målinger. Encellede målinger 6,11 udføres af fluorescens mikroskopi og billedanalyse. Vacuolær eller cytosoliske fluorescens ved to bølgelængder måles for hver celle. De populationsbaserede Målingerne er udført i enten en mikropladeaflæser med passende fluorescens evner eller i et fluorimeter. Vi har generelt gjort vores målinger i et fluorimeter, fordi det giver nem adgang for tilsætning af komponenter såsom glucose under conbende kinetiske målinger. Vores nuværende lab protokoller for måling af vacuolær og cytosoliske pH er listet nedenfor, begge er også let tilpasses til mikroplatte assays.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spectrofluorometer</td>
 <td>Horiba Jobin Yvon</td>
 <td>Model Fluoromax-4</td>
 <td>Temperature control and stirring capability are desirable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCECF-AM</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>B1150</td>
 <td>Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 &deg;C </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>monensin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M5273</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>nigericin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N7143</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M8250</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions

Vacuolær og cytosoliske pH er stærkt reguleret i gærceller og indtager en central rolle i den samlede pH homøostase. Vi beskriver protokoller til ratiometrisk måling af pH i vivo under anvendelse af pH-følsomme fluoroforer lokaliseret til vakuolen eller cytosolen. Vacuolær pH ​​måles med BCECF, som lokaliseres til vakuolen i gær, når den indføres i celler i sin acetoxymethylester formular. Cytosolisk pH måles med en pH-følsom GFP udtrykkes under kontrol af en gærpromotor, gær pHluorin. Metoder til måling af fluorescens nøgletal i gær celle suspensioner i et fluorimeter beskrevet. Gennem disse protokoller, enkeltdoser tidspunkt målinger af pH under forskellige forhold eller i forskellige gærmutanter blevet sammenlignet, og ændringer i pH over tid er blevet overvåget. Disse metoder er også blevet tilpasset til en fluorescenspladelæser format for høj-throughput eksperimenter. Fordele ved ratiometrisk pH målinger over andre APindfaldsvinkler bruges i øjeblikket, potentielle eksperimentelle problemer og løsninger, og udsigterne til fremtidig brug af disse teknikker er også beskrevet.

Figur 1 viser vakuolære pH fremkomne data om vildtype gærceller dyrket i rigt medium (gærekstrakt-peptonagtig dextran, YEPD) til pH 5 med 50 mM MES. Vi ofte vokser cellerne i pufret medium, da pH-værdien af mediet kan ændre sig dramatisk i løbet af natten vækst, navnlig for minimalmedium, og vi har fundet, at pH af vækstmediet kan påvirke vakuolære pH reaktioner 3.. Men det er også acceptabelt for mange eksperimenter at dyrke cellerne i bufferet medium. 1A viser en...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions at JoVE.com

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolær og cytosol pH kan måles i levende gær (<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;) Celler under anvendelse af ratiometrisk fluorescerende farvestoffer lokaliseret til specifikke cellulære rum. Vi beskriver procedurerne for måling vacuolær pH ​​med BCECF-AM, som lokaliseres til vakuolen i gær, og cytosolisk pH med en cytosolisk ratiometrisk pH-følsom GFP (gær pHluorin).

Måling af vacuolær og cytosoliske pH<em&gt; In Vivo</em&gt; I Gær cellesuspensioner

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Kvantitativ måling af Invadopodia-medieret ekstracellulær matrix Proteolyse i Single og flercellede Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Simpel og effektiv teknik til Udarbejdelse af Testikel blodlegemesuspensioner

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Samtidig pH-måling i Endocytic og Cytosoliske Rum i levende celler ved hjælp af konfokal mikroskopi

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Måling af hæmoglobinsyntese Niveauer i pattedyrceller

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analyse af Cellesuspensioner isoleret fra Solid Væv af Spectral flowcytometri

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Høj opløsning Imaging og analyse af de enkelte Astral mikrotubulusdynamik i Spirende Gær

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

4D Microscopy of Yeast

4D-mikroskopi af gær

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

Effekten af fluorescerende proteiner på Fusion partnere ved hjælp af polyglutamin toksicitet Assays i gær

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Måling af ilt forbrug satser i intakt Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...