Name: measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions
Uploaded: 2013-04-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM50322 לPM קיין. המחברים מודים לד&quot;ר ראג&#39;יני ראו, אוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס למתן פלסמידים pHluorin שמרים ועצה על מדידות pH ratiometric, וד&quot;ר א &#39;גלוריה מרטינז מוניוס לעבודה מתוך פרוטוקולים אלה למעבדה שלנו.

1. מדידה של pH vacuolar In Vivo שימוש BCECF-AM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות נוזלית 50 מ&quot;ל של זן השמרים שיש למדוד במדיום הרצוי למשך הלילה. המטרה היא לקבל את תאים בשלב אמצע יומן (OD600 (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר) מדידה של כ 0.8 להשעיה). </li><li style=";text-align:ri...

<ol>
	<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensors+and+regulators+of+intracellular+pH.">Sensors and regulators of intracellular pH.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).</li><li>Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+is+a+tightly+controlled+signal+in+yeast.">Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).</li><li>Diakov, T. T., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+activity+and+assembly+by+extracellular+pH.">Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH.</a> J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).</li><li>Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+and+plasma+membrane+proton+pumps+collaborate+to+achieve+cytosolic+pH+homeostasis+in+yeast.">Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast.</a> J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).</li><li>Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+loss+of+Vph1+protein-containing+vacuolar+ATPases+(V-ATPases)+for+overall+cellular+pH+homeostasis.">Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).</li><li>Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+of+vacuolar+acidification+in+H(+)-ATPase-deficient+yeast.">Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast.</a> J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).</li><li>Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+sodium/proton+exchange+by+a+Rab-GTPase-activating+protein+regulates+endosomal+traffic+in+yeast.">Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast.</a> J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endosomal+Na+K+/H++exchanger+Nhx1+regulates+cellular+pH+to+control+vesicle+trafficking.">The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).</li><li>Owen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+spectrum-shifting+intracellular+pH+probes+5'(and+6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7,+1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one+and+2',7'-biscarboxyethyl-5(and+6)-carboxyfluorescein.">Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein.</a> Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).</li><li>Dechant, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+pH+is+a+second+messenger+for+glucose+and+regulates+the+PKA+pathway+through+V-ATPase.">Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase.</a> Embo J. 29, 2515-2526 (2010).</li><li>Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+of+monensin+sensitivity+in+yeast:+implications+for+post-Golgi+traffic+and+vacuolar+H+-ATPase+function.">Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function.</a> Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).</li><li>Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionophores+and+intact+cells.+I.+Valinomycin+and+nigericin+act+preferentially+on+mitochondria+and+not+on+the+plasma+membrane+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).</li><li>Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+CLC+protein+counteracts+vesicular+acidification+during+iron+starvation.">The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation.</a> J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).</li><li>Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+cytosolic+and+mitochondrial+pH+using+a+pH-sensitive+GFP+derivative+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+relation+between+intracellular+pH+and+growth.">In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth.</a> Microbiology. 155, 268-278 (2009).</li><li>Zhang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+ergosterol+in+V-ATPase+function+underlies+antifungal+activity+of+azole+drugs.">Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).</li><li>Brett, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+the+vacuolar+pH-stat+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 6, e17619 (2011).</li><li>Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+yeast+vacuole.">Methods for studying the yeast vacuole.</a> Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).</li><li>Chan, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+V-ATPase+proton+transport+reveal+uncoupling+functions+of+tether+linking+cytosolic+and+membrane+domains+of+V0+subunit+a+(Vph1p).">Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p).</a> J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).</li><li>Johnson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+inhibitors+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+pumps+in+yeast+by+high-throughput+screening+flow+cytometry.">Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry.</a> Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).</li></ol>

יש לנו פרוטוקולים אלה מנוצלים כדי לטפל במספר היבטים של הומאוסטזיס-pH. לדוגמה, יש לנו לעומת תגובות cytosolic וה-pH של תאים שעברו מוטציה ופראי מסוג V-ATPase לקוי 4,5. גם אנחנו בדקנו את ההשפעות של תנאים שהשתנו צמיחה, במיוחד pH תאי, בתגובה לגלוקוז vacuolar pH 3. חשוב מכך, את התגובו...

הומאוסטזיס pH הוא תהליך דינמי ופיקוח הדוק בכל 1,2 אורגניזמים. תהליכים ביוכימיים מוסדרים היטב על ידי חומציות, וסביבות תאיות מכוונים לטווחי pH צרים כדי לאפשר פעילות אופטימלית של אנזימי התושב. עם זאת, ניתן יהיה לערער על הומאוסטזיס pH תאי על ידי שינויים מהירים בחומציות סביבתית, משמרות מטבוליים, ומסלולי איתות מסוימים. בנוסף, ה-pH תאי יכול עצמו לשמש כאות חשובה. לבסוף, אברונים רבים לשמור על ערכי pH lumenal הנבדלים מסביבת cytosol וחיוניים לתפקודי אברון ספציפיים. מניות cerevisiae Saccharomyces שמרי מספר מנגנוני הומאוסטזיס pH עם אאוקריוטים גבוהים יותר 2. באברונים חומציים של מסלול endocytic / lysosomal, pH נשלט בעיקר על ידי vacuolar פרוטון translocating-ATPase השמור ביותר (V-ATPase), הפועל במקביל עם רבים exchanGers תלויה בשיפוע PH. כל התאים אוקריוטים גם מנגנוני יצוא פרוטון. הוא האמינו בפטריות וצמחים, משאבת מימן שנייה, ברורה בקרום הפלזמה, Pma1, פרוטונים מטבוליות יצוא ולהיות הקובע העיקרי של ה-pH cytosolic ופוטנציאל קרום פלזמה. הגמישות הגנטית של ס &#39; cerevisiae והחשיבות המסחרית שלה, הפכו אותו למודל מאוד מעניין וחשוב ללימוד pH הומאוסטזיס 2. בנוסף להיותו מניעים העיקריים של החמצת אברון, V-ATPases מאוד מוסדר אנזימים והמעבדה שלנו היא מעוניינת בהבנת מנגנוני ויסות V-ATPase. למען מטרה זו, יש לנו כבר משתמשים במדידות pH vivo של pH vacuolar וcytosolic: 1) לעקוב אחר תגובות לתנאים תאיים משתנים, כגון גלוקוז וקיפוח readdition, 2) כדי לבחון את ההשפעות של מוטציות שפשרת פעילות V-ATPase, ו 3) לחקור coordination של אברון ופלזמת משאבות פרוטונים בממברנה 3-5. ניסויים אלה התאפשרו רק באמצעות הפיתוח של אינדיקטורים pH ratiometric חזקים המתאימים לשימוש בתאי שמרים. . צמח ואח&#39; הראשון הראה כי BCECF (2&#39;7&#39;-Bis (2-carboxyethyl) -5 - (ו 6), carboxyfluorescein), שכבר בשימוש נרחב למדידת חומציות cytosolic בתאי יונקים, מצטבר בvacuole השמרים במקום 6 cytosol. הבדל זה בלוקליזציה BCECF יוחס לאנזימים הרבים hydrolytic בvacuole, אשר עשוי אחראים למחשוף של תיל אסטר acetoxy מBCECF-AM (אסתר acetoxymethyl של BCECF) וvacuolar שימור 6. עלי ואח&#39;. 7 מפותח יותר מדידת חומציות vacuolar באמצעות BCECF ומותאם מדידות אלה לפורמט קורא צלחת פלואורסצנטי. ברט ואח&#39;. הציג pHluorin שמרים כאמצעי למדידת חומציות cytosolic בשמרים בהבעת R פלסמיד שמקורןGFP atiometric pH רגיש 8 תחת שליטה של אמרגן שמרים ספציפי 9. ספקטרום העירור של שני BCECF ושמרי pHluorin רגיש לחומציות, ולכן הם משמשים כאינדיקטורים pH ratiometric שבה היחס של הקרינה בשני אורכי גל עירור, הנמדדים באורך גל פליטה יחידה, מספק מדד לרמת חומציות 8,10. חיישני pH vacuolar וcytosolic אלה שמרים שמשו במשך שתי מדידות התא בודדות ומבוססות אוכלוסייה. מדידות תא בודד 6,11 מבוצעות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וניתוח תמונה. הקרינה vacuolar או cytosolic בשני אורכי הגל נמדדת לכל תא. המדידות מבוססות אוכלוסייה מבוצעות בשני קורא microplate עם יכולות הקרינה מתאימות או בfluorimeter. בדרך כלל יש לנו לעשות מדידות שלנו בfluorimeter, משום שהיא מספקת גישה קלה לתוספת של רכיבים כגון גלוקוז בקוןמדידות הקינטית tinuous. פרוטוקולי המעבדה הנוכחיים שלנו למדידת חומציות vacuolar וcytosolic מפורטים להלן; הן מותאמים גם למבחנים בקלות microplate.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spectrofluorometer</td>
 <td>Horiba Jobin Yvon</td>
 <td>Model Fluoromax-4</td>
 <td>Temperature control and stirring capability are desirable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCECF-AM</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>B1150</td>
 <td>Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 &deg;C </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>monensin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M5273</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>nigericin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N7143</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M8250</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions

Vacuolar וcytosolic pH הם מאוד מוסדר בתאי שמרים ותופס תפקיד מרכזי באיזון חומציות בכללותה. אנו מתארים פרוטוקולים למדידת ratiometric של pH in vivo באמצעות pH רגיש fluorophores המקומי לvacuole או cytosol. pH vacuolar נמדד באמצעות BCECF, שlocalizes לvacuole בשמרים כאשר הוכנסו לתאים בצורת אסתר acetoxymethyl שלה. pH cytosolic נמדד עם GFP pH רגיש הביע תחת שליטה של ​​אמרגן שמרים, שמרי pHluorin. שיטות למדידת יחס הקרינה בהשעיות תא שמרים בfluorimeter מתוארות. באמצעות פרוטוקולים אלה, מדידות נקודת זמן יחידה של ה-pH בתנאים שונים או בשמרי מוטנטים שונים כבר השוואה ושינויים ב-pH לאורך הזמן היו במעקב. שיטות אלה גם הותאמו לפורמט קורא צלחת הקרינה לניסויי תפוקה גבוהה. יתרונות של מדידות pH ratiometric מעל AP האחרproaches כיום בשימוש, בעיות פוטנציאליות ניסיוניות ופתרונות, וסיכויים לשימוש עתידי של טכניקות אלה גם תאר.

איור 1 מציג את הנתונים המתקבלים על pH vacuolar wild-type תאי שמרים גודלו במדיום עשיר (שמרי תמצית-peptone-dextran; YEPD) נאגרו לחומציות 5 עם 50 מ&quot;מ MES. לעתים קרובות אנו מגדלים את התאים במדיום שנאגרו בגלל החומציות של המדיום יכולה לשנות באופן דרמטי למדי במהלך צמיחה בין לילה, במיוחד ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions at JoVE.com

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

pH vacuolar וcytosolic ניתן למדוד בשמרי חיים (<em&gt; ס cerevisiae</em&gt;) תאים באמצעות צבעי ניאון ratiometric המקומיים לתאים סלולריים מסוימים. אנו מתארים נהלים למדידת חומציות vacuolar עם BCECF-AM, שlocalizes לvacuole בשמרים, וה-pH cytosolic עם GFP pH רגיש ratiometric cytosolic (שמרי pHluorin).

מדידה של pH vacuolar וCytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; בהשעיות תא שמרים

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

במדידה Micro-vivo מחזור בשרירי השלד על ידי מיקרוסקופית תוך חיוני

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

מדידת pH בו זמנית בendocytic ותאי Cytosolic בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה confocal

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

4D Microscopy of Yeast

4D מיקרוסקופ של שמרים

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...