Name: measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions
Uploaded: 2013-04-19T12:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01 GM50322 a PM Kane. Gli autori ringraziano il Dr. Rajini Rao, Johns Hopkins University per la fornitura di le di lievito pHluorin plasmidi e di per un consiglio su misure di pH raziometriche, e di il Dr. Gloria A. Martinez Munoz per lavorare fuori questi protocolli per il nostro laboratorio.

1. Misurazione del pH vacuolare In Vivo Uso di BCECF-AM <ol><li> Grow un 50 ml coltura liquida del il ceppo di lievito per essere misurato in il supporto desiderato durante la notte. L&#39;obiettivo è di avere le cellule in di fase mid-log (OD600 (densità ottica a 600 nm) la misurazione di approssimativamente 0,8 per la sospensione). </li><li> A pellet le cellule di lievito per centrifugazione. Risospendere il pellet in 0,6 ml del terreno crescita e trasferimento ad un provetta microcentrifuga che è stato ...

<ol>
	<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensors+and+regulators+of+intracellular+pH.">Sensors and regulators of intracellular pH.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).</li><li>Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+is+a+tightly+controlled+signal+in+yeast.">Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).</li><li>Diakov, T. T., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+activity+and+assembly+by+extracellular+pH.">Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH.</a> J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).</li><li>Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+and+plasma+membrane+proton+pumps+collaborate+to+achieve+cytosolic+pH+homeostasis+in+yeast.">Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast.</a> J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).</li><li>Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+loss+of+Vph1+protein-containing+vacuolar+ATPases+(V-ATPases)+for+overall+cellular+pH+homeostasis.">Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).</li><li>Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+of+vacuolar+acidification+in+H(+)-ATPase-deficient+yeast.">Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast.</a> J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).</li><li>Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+sodium/proton+exchange+by+a+Rab-GTPase-activating+protein+regulates+endosomal+traffic+in+yeast.">Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast.</a> J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endosomal+Na+K+/H++exchanger+Nhx1+regulates+cellular+pH+to+control+vesicle+trafficking.">The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).</li><li>Owen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+spectrum-shifting+intracellular+pH+probes+5'(and+6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7,+1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one+and+2',7'-biscarboxyethyl-5(and+6)-carboxyfluorescein.">Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein.</a> Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).</li><li>Dechant, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+pH+is+a+second+messenger+for+glucose+and+regulates+the+PKA+pathway+through+V-ATPase.">Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase.</a> Embo J. 29, 2515-2526 (2010).</li><li>Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+of+monensin+sensitivity+in+yeast:+implications+for+post-Golgi+traffic+and+vacuolar+H+-ATPase+function.">Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function.</a> Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).</li><li>Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionophores+and+intact+cells.+I.+Valinomycin+and+nigericin+act+preferentially+on+mitochondria+and+not+on+the+plasma+membrane+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).</li><li>Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+CLC+protein+counteracts+vesicular+acidification+during+iron+starvation.">The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation.</a> J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).</li><li>Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+cytosolic+and+mitochondrial+pH+using+a+pH-sensitive+GFP+derivative+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+relation+between+intracellular+pH+and+growth.">In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth.</a> Microbiology. 155, 268-278 (2009).</li><li>Zhang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+ergosterol+in+V-ATPase+function+underlies+antifungal+activity+of+azole+drugs.">Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).</li><li>Brett, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+the+vacuolar+pH-stat+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 6, e17619 (2011).</li><li>Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+yeast+vacuole.">Methods for studying the yeast vacuole.</a> Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).</li><li>Chan, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+V-ATPase+proton+transport+reveal+uncoupling+functions+of+tether+linking+cytosolic+and+membrane+domains+of+V0+subunit+a+(Vph1p).">Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p).</a> J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).</li><li>Johnson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+inhibitors+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+pumps+in+yeast+by+high-throughput+screening+flow+cytometry.">Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry.</a> Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).</li></ol>

Noi abbiamo utilizzato questi protocolli per affrontare un certo numero di gli aspetti della pH omeostasi. Ad esempio, noi abbiamo confrontato le risposte citosoliche e di pH di cellule mutanti wild-type e V-ATPasi-carente 4,5. Abbiamo inoltre esaminato gli effetti delle condizioni di crescita alterati, di pH particolarmente extracellulare, sulla risposta del pH vacuolare al glucosio 3. È importante sottolineare che, le risposte che osserviamo sono entrambi coerenti con altri metodi di misurazione...

pH omeostasi è un processo dinamico e di altamente regolato in tutti gli organismi 1,2. Processi biochimici sono strettamente regolati da pH, e di ambienti di intracellulari sono sintonizzati ai range di di pH strette per consentire attività ottimale delle le enzimi residenti. Tuttavia, intracellulare pH omeostasi può essere contestata da rapidi cambiamenti in pH ambientale, turni di metabolici, e di alcuni vie di segnalazione. In aggiunta, pH intracellulare può servire di per sé come un segnale importante. Infine, molti organelli mantengono valori pH lumenal che sono distinti dal citosol circostante e essenziale per le funzioni organello-specifici. Le lieviti Saccharomyces condivide cerevisiae un certo numero di meccanismi omeostasi pH con con eucarioti superiori 2. In gli organelli acide del il pathway endocitica / lisosomiale, pH è controllato in primo luogo dalla altamente conservata vacuolare protone-translocating ATPasi (V-ATPasi), agendo in tandem con molti scamgers dipendenti dal gradiente di di pH. Tutte le cellule eucariotiche hanno anche meccanismi di esportazione protonica. In funghi e piante, un secondo, pompa di protonica distinto a livello della membrana plasmatica, Pma1, le esportazioni protoni metaboliche e si crede di essere il maggiore fattore determinante di pH citosolica e di potenziale di membrana plasmatica. La flessibilità genetica di S. cerevisiae e la sua importanza commerciale, hanno reso esso un modello molto interessante e importante per lo studio pH l&#39;omeostasi 2. In Oltre ad essere i driver di primari di organello acidificazione, V-ATPasi di sono altamente regolamentati enzimi di e la il nostro laboratorio di è interessato a meccanismi di regolazione V-ATPasi la comprensione. Verso questo obiettivo, abbiamo sono state utilizzando in misure di pH in vivo di pH vacuolare e di citosolica: 1) a monitorare le risposte al mutevoli condizioni extracellulari, come ad esempio deprivazione glucosio e readdition, 2) ai esaminare gli effetti di mutazioni che compromesso di attività V-ATPasi, e di 3) per esplorare la coordinamento di degli organelli e di al plasma a membrana pompe protoniche 3-5. Questi esperimenti divennero possibile solo attraverso lo sviluppo di solidi indicatori di pH raziometrici suscettibili di utilizzare in cellule di lievito. . Pianta et al primo luogo ha mostrato che BCECF (2&#39;7&#39;-Bis-(2-carbossietil) -5 - (e 6)-carbossifluoresceina), che è stato usato ampiamente per misurare il pH citosolico in cellule di di mammifero, accumula nel vacuolo lievito anziché il citosol 6. Questa differenza nella BCECF localizzazione è stata attribuita ad le molte enzimi idrolitici in il vacuolo, che sono probabilmente responsabile per il clivaggio dell&#39;estere metilico acetossi da BCECF-AM (estere acetossimetil di BCECF) e ritenzione vacuolare 6. Ali et al. 7 ulteriormente sviluppato di misura del pH vacuolare usando BCECF e adattati queste misurazioni per un formato di lettore di piastre di fluorescenza. Brett et al. Introdotta lievito pHluorin come un mezzo di misurare pH citosolico in lievito da esprimendo un r plasmide-borneatiometric GFP pH-sensibile al 8 sotto controllo di un lievito-specifico promotore 9. La spettri di eccitazione di entrambi BCECF e di lievito pHluorin sono sensibili ai pH, in modo da essi sono utilizzati come indicatori di pH raziometrici in cui il rapporto di di fluorescenza presso due lunghezze d&#39;onda di eccitazione, misurati ad una singola lunghezza d&#39;onda di emissioni, fornisce una misura di pH 8,10. Questi sensori di pH vacuolari e di citosolica di lievito sono stati utilizzati per entrambe le misurazioni a cella singola e di basato sulla popolazione. Misurazioni monocellulari 6,11 sono eseguite da microscopia a fluorescenza e analisi di immagine. Fluorescenza vacuolar o citosolico presso i due lunghezze d&#39;onda è misurato per ogni cella. Le misurazioni basati sulla popolazione vengono eseguite sia in un lettore di micropiastra con adeguate capacità di fluorescenza o in un fluorimetro. Noi abbiamo generalmente fatto i nostri misurazioni di in un fluorimetro, perché fornisce un facile accesso per aggiunta di componenti di come ad esempio glucosio durante condizionatamisurazioni di cinetiche continuo. I nostri protocolli di di laboratorio attuali per la misurazione di del pH vacuolare e di citosolica sono elencati di qui di seguito; entrambi sono anche facilmente adattati a saggi di per micropiastre.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spectrofluorometer</td>
 <td>Horiba Jobin Yvon</td>
 <td>Model Fluoromax-4</td>
 <td>Temperature control and stirring capability are desirable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCECF-AM</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>B1150</td>
 <td>Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 &deg;C </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>monensin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M5273</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>nigericin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N7143</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M8250</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions

Vacuolare e di pH citosolica sono altamente regolamentati in cellule di lievito e di occupano un ruolo centrale nella complessiva omeostasi pH. Noi descriviamo i protocolli per la la misurazione raziometrica di del pH in vivo usando di pH-sensibili fluorofori localizzate al il vacuolo o di citosol. PH vacuolar viene misurata usando BCECF, che localizza al la vacuolo in lievito quando introdotto in cellule nella sua forma estere acetossimetil. PH citosolico è misurata con un GFP pH-sensibile al espressa sotto controllo di un promotore lievito, lievito pHluorin. Metodi di misura della rapporti di fluorescenza in sospensioni cellulari lievito negli una fluorimetro sono descritte. Attraverso questi protocolli, le misurazioni singole punto di tempo di pH in condizioni diversi o in differenti mutanti di lievito sono stati confrontati e di le variazioni di pH nel corso del tempo sono stati monitorati. Questi metodi sono stati anche adattati a una formato di lettore di piastre di fluorescenza per gli esperimenti di ad alta-di throughput. Vantaggi di misure di pH raziometrici oltre altri apsono anche descritti procci attualmente in uso, i potenziali problemi sperimentali e soluzioni, e le prospettive per uso futuro di queste tecniche.

La Figura 1 presenta i dati di pH vacuolari ottenuti su cellule di lievito wild-type coltivate in ricco di medie (di lievito estratto di-peptone-destrano; YEPD) memorizzati nel buffer pH 5 con 50 mM MES. Abbiamo Spesso cresciamo le cellule in mezzo tamponato perché il pH del mezzo può cambiare abbastanza drammaticamente durante la crescita durante la notte, particolarmente per terreno minimo, e abbiamo trovato che il pH del mezzo di crescita può influenzare risposte di pH vacuolari 3. Tutt...

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Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

PH vacuolare e di citosolica può essere misurata in lieviti vivi (<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;) Cellule utilizzando tinture fluorescenti raziometrici localizzate a specifici compartimenti cellulari. Noi descriviamo procedure per la misurazione del pH vacuolare di con BCECF-AM, la quale localizza al la vacuolo nel lievito, e del pH citosolico con un citosolica raziometrico GFP pH-sensibile al (lievito pHluorin).

Misurazione di pH vacuolare e di Cytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; In Lievito Cell Sospensioni

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

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