Name: measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions
Uploaded: 2013-04-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions at JoVE.com

この作品は、PMケインにNIH R01 GM50322によってサポートされていました。著者は、私たちの研究室のために、これらのプロトコルを扱うための博士Rajiniラオ、酵母pHluorinプラスミドを提供するとレシオメトリックpH測定に関するアドバイスジョンズホプキンス大学、博士とグロリアA.マルティネスムニョスに感謝します。

1。 BCECF-AMを用いたin vivo において、液胞のpHの測定<ol><li>一夜希望の媒体中で測定する酵母菌株を50mlの液体培養を育てる。目標は、中期対数期（OD600（600nmでの光学密度）が約0.8サスペンション用の測定）で細胞を有することである。 </li><li>遠心分離によりペレット酵母細胞。増殖培地、以前に秤量されたマイクロチューブへの転送0.6ミリリットルでペレットを再懸濁します。...

<ol>
	<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensors+and+regulators+of+intracellular+pH.">Sensors and regulators of intracellular pH.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).</li><li>Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+is+a+tightly+controlled+signal+in+yeast.">Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).</li><li>Diakov, T. T., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+activity+and+assembly+by+extracellular+pH.">Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH.</a> J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).</li><li>Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+and+plasma+membrane+proton+pumps+collaborate+to+achieve+cytosolic+pH+homeostasis+in+yeast.">Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast.</a> J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).</li><li>Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+loss+of+Vph1+protein-containing+vacuolar+ATPases+(V-ATPases)+for+overall+cellular+pH+homeostasis.">Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).</li><li>Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+of+vacuolar+acidification+in+H(+)-ATPase-deficient+yeast.">Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast.</a> J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).</li><li>Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+sodium/proton+exchange+by+a+Rab-GTPase-activating+protein+regulates+endosomal+traffic+in+yeast.">Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast.</a> J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endosomal+Na+K+/H++exchanger+Nhx1+regulates+cellular+pH+to+control+vesicle+trafficking.">The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).</li><li>Owen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+spectrum-shifting+intracellular+pH+probes+5'(and+6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7,+1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one+and+2',7'-biscarboxyethyl-5(and+6)-carboxyfluorescein.">Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein.</a> Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).</li><li>Dechant, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+pH+is+a+second+messenger+for+glucose+and+regulates+the+PKA+pathway+through+V-ATPase.">Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase.</a> Embo J. 29, 2515-2526 (2010).</li><li>Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+of+monensin+sensitivity+in+yeast:+implications+for+post-Golgi+traffic+and+vacuolar+H+-ATPase+function.">Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function.</a> Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).</li><li>Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionophores+and+intact+cells.+I.+Valinomycin+and+nigericin+act+preferentially+on+mitochondria+and+not+on+the+plasma+membrane+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).</li><li>Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+CLC+protein+counteracts+vesicular+acidification+during+iron+starvation.">The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation.</a> J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).</li><li>Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+cytosolic+and+mitochondrial+pH+using+a+pH-sensitive+GFP+derivative+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+relation+between+intracellular+pH+and+growth.">In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth.</a> Microbiology. 155, 268-278 (2009).</li><li>Zhang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+ergosterol+in+V-ATPase+function+underlies+antifungal+activity+of+azole+drugs.">Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).</li><li>Brett, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+the+vacuolar+pH-stat+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 6, e17619 (2011).</li><li>Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+yeast+vacuole.">Methods for studying the yeast vacuole.</a> Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).</li><li>Chan, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+V-ATPase+proton+transport+reveal+uncoupling+functions+of+tether+linking+cytosolic+and+membrane+domains+of+V0+subunit+a+(Vph1p).">Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p).</a> J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).</li><li>Johnson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+inhibitors+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+pumps+in+yeast+by+high-throughput+screening+flow+cytometry.">Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry.</a> Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).</li></ol>

我々は、pHホメオスタシスの態様の数に対処するために、これらのプロトコルを利用している。例えば、我々は、4,5野生型およびV-ATPアーゼ欠損変異体細胞の細胞質およびpH応答を比較した。我々はまた、グルコース、3〜胞のpH応答に改変された成長条件、特に外pHの影響を調べた。重要なことは、我々が観察応答が量的pH測定する他の方法と、プロトンポンプ活動の変化を説?...

pHの恒常性は、すべての生物1,2の動的かつ高度に調整されたプロセスである。生化学的プロセスは厳密にpH値によって規制されており、細胞内の環境が常駐酵素の最適な活性を可能にするために狭いpH範囲に同調される。しかし、細胞内pHの恒常性は、環境pHの急激な変化、代謝シフト、および特定のシグナル伝達経路によって挑戦することができます。また、細胞内のpHが重要なシグナルとしての地位を提供することができます。最後に、多くの細胞小器官は、周囲の細胞質は異なるとオルガネラ固有の機能に不可欠である内腔pH値を維持します。 酵母サッカロミセス·セレビシエ株高等真核生物2でpHの恒常性メカニズムの数。リソソーム/エンドサイトーシス経路の酸性オルガネラにおいて、pHは、主に多くのexchanと連携して作用する、高度に保存された液胞プロトンATPアーゼ転位（V-ATPアーゼ）によって制御されるpH勾配に依存ジェール。すべての真核細胞は、またプロトンエクスポートメカニズムを持っています。菌類や植物、形質膜の第二、別個のプロトンポンプ、PMA1、輸出プロトン代謝および細胞質のpHおよび細胞膜電位の主要な決定要因であると考えられている。 S.の遺伝的柔軟性出芽酵母とその商業的重要性は、それのpHホメオスタシス2を研究するための非常に興味深く、重要なモデルました。 オルガネラの酸性化の主な要因であることに加えて、V-ATPアーゼは、高度に規制された酵素であり、私たちの研究室では、V-ATPaseの調節のメカニズムを理解することに興味があります。この目標に向かって、私たちは、液胞と細胞質のpHの生体内 pH測定に使用してきました：1）変異の影響その妥協V-ATPアーゼ活性を調べるためにこのようなグルコース欠乏とreaddition、2などの変化外条件）への応答を監視するために、及び3）COORを探索するオルガネラと細胞膜プロトンポンプ3-5 dination。これらの実験は、酵母細胞での使用に適して堅牢なレシオメトリックpH指示薬の開発によって可能になった。 （ - （および6） -カルボキシフルオレセイン2&#39;7&#39;-ビス- （2 -カルボキシエチル）-5）、哺乳動物細胞において細胞質ゾルのpHを測定するために広く使用されている、酵母液胞に蓄積植物らは最初BCECFことを示した代わりに、細胞質ゾル6。 BCECFのローカライズにおけるこの差はおそらくBCECF-AM（BCECFのアセトキシメチルエステル）と液胞の保持6からアセトキシメチルエステルの開裂を担当する液胞の多くの加水分解酵素、に起因している。アリら 7は、さらに、BCECFを使用して、液胞pH測定を開発し、蛍光プレートリーダー形式にこれらの測定値を適合。プラスミド媒介Rを発現させることにより酵母の細胞質のpHを測定する手段としてブレットら導入された酵母pHluorinatiometric pH感受性酵母特異的プロモーター9の制御下にGFP 8。 BCECFおよび酵母pHluorin両方の励起スペクトルは、pHに敏感であるので、それらは単一の発光波長で測定された2つの励起波長での蛍光の割合でレシオメトリックpH指示薬として使用され、pHが8,10の尺度を提供する。これらの酵母液胞および細胞質ゾルのpHセンサは、シングルセルおよび人口ベースの測定のために使用されている。単一セルの測定は6,11蛍光顕微鏡と画像解析によって行われる。二つの波長における液胞または細胞質蛍光はセル毎に測定する。集団ベースの測定は、適切な蛍光機能を備えたマイクロプレートリーダーのいずれかで、または蛍光で実行されます。それは詐欺中グルコースなどのコンポーネントを追加するための簡単​​なアクセスを提供するため、我々は一般的に、蛍光で我々の測定を行っている連続運動測定。液胞および細胞質ゾルのpHの測定のための我々の現在の実験プロトコルは以下の通りです。両方も容易にマイクロプレートアッセイに適合される。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spectrofluorometer</td>
 <td>Horiba Jobin Yvon</td>
 <td>Model Fluoromax-4</td>
 <td>Temperature control and stirring capability are desirable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCECF-AM</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>B1150</td>
 <td>Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 &deg;C </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>monensin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M5273</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>nigericin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N7143</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M8250</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions

液胞および細胞質ゾルのpHは非常酵母細胞で規定さおよび全体のpHホメオスタシスにおいて中心的な役割を占めるている。私たちは、液胞や細胞質に局在するpH感受性蛍光プローブを用いたin vivoでのpHのレシオメトリック測定のためのプロトコルを記述します。液胞pHは、そのアセトキシメチルエステルの形態で細胞に導入する際に、酵母液胞に局在BCECFを用いて測定される。細胞質ゾルのpHは、酵母プロモーターの制御下で発現pH感受性GFP、酵母pHluorinで測定される。蛍光中の酵母細胞懸濁液中の蛍光比の測定のための方法が記載されている。これらのプロトコルを介して、さまざまな条件の下で、または異なる酵母変異体のpHの単一時点の測定が比較され、経時的なpHの変化が監視されている。これらの方法は、高スループット実験のための蛍光プレートリーダーフォーマットに適応されている。他のAP上のレシオメトリックpH測定の利点現在使用され、潜在的な実験的な問題と解決策、およびこれらの技術の将来の使用のための見通しに近づくにつれても記載されている。

50mMのMESでpH5に緩衝、 図1には、リッチメディア（YEPD酵母エキスペプトン-デキストラン）で栽培された野生型酵母細胞上で得られる液胞pHのデータを提示します。培地のpHは、特に最少培地のために、一晩成長中に非常に劇的に変化することができるので、我々は、多くの場合、緩衝培地で細胞を増殖し、我々は増殖培地のpHは液胞のpH応答3に影響を与えることが?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions at JoVE.com

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

液胞と細胞質のpHは生酵母で測定することができる（<em&gt; S.セレビ</em&gt;）特定の細胞区画に局在レシオメトリック蛍光色素を用いて細胞。我々は、酵母における液胞に局在BCECF-AM、および細胞質レシオメトリックpH感受性GFP（酵母pHluorin）と細胞質のpHと液胞のpHを測定するための手順について説明します。

液胞と細胞質のpHの測定<emインビボで&gt;</em&gt;酵母細胞懸濁液に

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

イントラ不可欠な顕微鏡による骨格筋のin vivo微小循環測定における

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

シングルおよび多細胞コンテキストでInvadopodia媒介細胞外マトリックスタンパク分解の定量測定

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡を用いた生細胞におけるエンドサイトーシスおよび細胞質区画における同時pH測定

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

哺乳動物細胞におけるヘム合成レベルの測定

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

出芽酵母における高解像度画像と個人アストラル微小管動態の解析

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

4D Microscopy of Yeast

酵母の4D顕微鏡検査

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

酵母におけるポリグルタミン毒性の試金を使用して融合パートナーの蛍光タンパク質の効果

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

そのまま線虫の酸素消費量の測定

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...