Name: measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions
Uploaded: 2013-04-19T12:00:00
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이 작품은 PM 케인에 NIH R01 GM50322에 의해 지원되었다. 저자는 우리의 실험실에 대한 이러한 프로토콜을 작업에 박사 Rajini 라오, 효모 pHluorin 플라스미드를 제공하고 비례 pH 측정에 대한 조언 존스 홉킨스 대학 박사 글로리아 A. 마르티네즈 무 노즈 감사합니다.

1. BCECF-AM을 사용하여 생체 내에서 액포의 pH 측정 <ol><li> 밤새 원하는 매체에 측정 할 효모 균주의 50 ML 액체 문화를 성장. 목표는 (OD600 (600 nm에서 흡광도) 서스펜션 약 0.8 측정) 중반 로그 단계에서 세포를 가지고있다. </li><li> 원심 분리하여 펠렛 효모 세포. 성장 매체 이전에 무게 된 microcentrifuge 관에 전송 0.6 ㎖에 펠렛을 resuspend을. 60 초 동안 2,000 XG에서의 microcentrifuge에 다시 펠렛은 세포. ?...

<ol>
	<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensors+and+regulators+of+intracellular+pH.">Sensors and regulators of intracellular pH.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).</li><li>Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+is+a+tightly+controlled+signal+in+yeast.">Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).</li><li>Diakov, T. T., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+activity+and+assembly+by+extracellular+pH.">Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH.</a> J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).</li><li>Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+and+plasma+membrane+proton+pumps+collaborate+to+achieve+cytosolic+pH+homeostasis+in+yeast.">Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast.</a> J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).</li><li>Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+loss+of+Vph1+protein-containing+vacuolar+ATPases+(V-ATPases)+for+overall+cellular+pH+homeostasis.">Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).</li><li>Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+of+vacuolar+acidification+in+H(+)-ATPase-deficient+yeast.">Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast.</a> J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).</li><li>Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+sodium/proton+exchange+by+a+Rab-GTPase-activating+protein+regulates+endosomal+traffic+in+yeast.">Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast.</a> J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endosomal+Na+K+/H++exchanger+Nhx1+regulates+cellular+pH+to+control+vesicle+trafficking.">The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).</li><li>Owen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+spectrum-shifting+intracellular+pH+probes+5'(and+6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7,+1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one+and+2',7'-biscarboxyethyl-5(and+6)-carboxyfluorescein.">Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein.</a> Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).</li><li>Dechant, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+pH+is+a+second+messenger+for+glucose+and+regulates+the+PKA+pathway+through+V-ATPase.">Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase.</a> Embo J. 29, 2515-2526 (2010).</li><li>Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+of+monensin+sensitivity+in+yeast:+implications+for+post-Golgi+traffic+and+vacuolar+H+-ATPase+function.">Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function.</a> Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).</li><li>Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionophores+and+intact+cells.+I.+Valinomycin+and+nigericin+act+preferentially+on+mitochondria+and+not+on+the+plasma+membrane+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).</li><li>Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+CLC+protein+counteracts+vesicular+acidification+during+iron+starvation.">The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation.</a> J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).</li><li>Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+cytosolic+and+mitochondrial+pH+using+a+pH-sensitive+GFP+derivative+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+relation+between+intracellular+pH+and+growth.">In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth.</a> Microbiology. 155, 268-278 (2009).</li><li>Zhang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+ergosterol+in+V-ATPase+function+underlies+antifungal+activity+of+azole+drugs.">Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).</li><li>Brett, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+the+vacuolar+pH-stat+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 6, e17619 (2011).</li><li>Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+yeast+vacuole.">Methods for studying the yeast vacuole.</a> Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).</li><li>Chan, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+V-ATPase+proton+transport+reveal+uncoupling+functions+of+tether+linking+cytosolic+and+membrane+domains+of+V0+subunit+a+(Vph1p).">Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p).</a> J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).</li><li>Johnson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+inhibitors+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+pumps+in+yeast+by+high-throughput+screening+flow+cytometry.">Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry.</a> Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).</li></ol>

우리의 pH 항상성 측면의 숫자를 해결하기 위해이 프로토콜을 이용했다. 예를 들어, 우리는 4,5 야생 형과 V-ATPase의 결핍 돌연변이 세포의 세포질과 산도 반응을 비교했다. 우리는 또한 포도당 3 액포의 pH 응답에 변경된 성장 조건, 특히 세포 산도의 효과를 조사했다. 중요한 것은, 우리가 관찰 응답은 양적 pH 측정의 다른 방법과와 양성자 펌프의 변경된 활동을 설명하는 생화 학적 ?...

의 pH 항상성은 모든 생물 1,2 역동적이고 고도로 통제 프로세스입니다. 생화학 적 과정은 밀접하게 산도에 의해 규제되고, 세포 환경은 주민 효소의 최적 활동을 할 수 있도록 좁은 산도 범위로 조정됩니다. 그러나 세포의 pH 항상성은 환경 산도, 대사 변화, 특정 신호 전달 경로의 급격한 변화에 도전 할 수 있습니다. 또한, 세포 내 pH는 중요한 신호로 자신을 제공 할 수 있습니다. 마지막으로, 많은 세포 소기관이 세포 소기관 특정 기능에 대한 주변의 세포질에서 독특하고 필수적인 lumenal의 pH 값을 유지합니다. 높은 진핵 생물 2의 pH 항상성 메커니즘의 효모 인 Saccharomyces cerevisiae의 주가는 숫자입니다. 리소좀 / endocytic 통로의 산성 세포 소기관으로, pH는 주로 많은 exchan와 협력하여 행동, 고도 보존 액포 양성​​자 translocating ATPase의 (V-ATPase의)에 의해 제어됩니다산도 기울기에 따라 제르. 모든 진핵 세포는 양성자 수출 메커니즘이 있습니다. 에 곰팡이와 식물, 플라즈마 막에서 두 번째, 독특한 프로톤 펌프, Pma1, 수출 신진 대사 양성자와는 세포질 pH와 세포막 전위의 주요 결정 요인이 될 것으로 생각됩니다. S.의 유전 적 유연성 cerevisiae의 및 상업적 중요성은, 그것의 pH 항상성이 공부를위한 매우 중요하고 흥미로운 모델을 만들었습니다. 세포 기관 산성화의 주요 드라이버 일뿐만 아니라, V-ATPases 매우 효소를 통제하고 우리의 실험실은 V-ATPase의 규제 메커니즘을 이해에 관심이 있습니다. 이 목표를 향해, 우리는 액포와 세포질의 pH 생체 pH 측정에 사용하고있다 : 1) 돌연변이의 효과 타협 V-ATPase의 활성을 조사하기 위해 포도당 박탈 및 readdition 2로 변경 세포 조건)에 대한 응답을 모니터링하는 데, 3) COOR를 탐험세포 소기관 및 플라즈마 막 양성자 펌프 3-5 조율 활동. 이러한 실험은 효모 세포에서 사용할 의무가 강력한 비례 산도 지표의 개발을 통해 가능하게되었다. . 포유 동물 세포의 세포질 산도를 측정하기 위해 널리 사용되었습니다, 효모 액포에 축적 - 플랜트 등 첫번째 BCECF ((6) carboxyfluorescein 2&#39;7&#39; - 비스 - (2 - 카복시 에틸) -5) 것으로 나타났다 대신 세포질 6. BCECF 현지화의 차이는 BCECF-AM (BCECF의 아세 톡시 메틸 에스테르) 및 액포 유지 6에서 아세 톡시 메틸 에스테르의 분열에 대한 가능성이 책임 액포에있는 많은 가수 분해 효소에 기인하고있다. 알리 등 7. 더 BCECF를 사용하여 액포의 pH 측정을 개발하고 형광 플레이트 리더 형식으로 이러한 측정을 적응. 브렛 등. 플라스미드 매개 R을 표현하여 효모의 세포질 산도를 측정하는 수단으로 효모 pHluorin 소개효모 특이 적 프로모터 9 통제 atiometric 산도에 민감한 GFP 8. BCECF 효모 pHluorin 모두의 여기 스펙트럼은 산도에 민감, 그래서 그들은 하나의 발광 파장에서 측정 된 두 여기 파장,에서 형광의 비율은 pH가 8,10의 측정을 제공하는 비례의 pH 지표로 사용됩니다. 이러한 효모 액포와 세포질 pH 센서는 모두 단일 셀 및 인구 기반 측정에 사용되었습니다. 단일 세포 측정은 6,11 형광 현미경 및 이미지 분석에 의해 수행됩니다. 두 파장에서의 액포 또는 세포질 형광 각 셀에 대해 측정됩니다. 인구 기반의 측정은 적절한 형광 기능을 갖춘 마이크로 플레이트 리더 중 하나 또는 fluorimeter에서 수행됩니다. 그것은 죄수 중에 이러한 포도당 같은 구성 요소의 추가에 대한 쉬운 접근을 제공하기 때문에 우리는 일반적으로 fluorimeter 우리의 측정을 수행 한tinuous 운동 측정. 액포와 세포질의 pH 측정을위한 우리의 현재 실험실 프로토콜은 아래에 나열되어 있습니다; 둘은 쉽게 마이크로의 분석에 적용됩니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spectrofluorometer</td>
 <td>Horiba Jobin Yvon</td>
 <td>Model Fluoromax-4</td>
 <td>Temperature control and stirring capability are desirable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCECF-AM</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>B1150</td>
 <td>Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 &deg;C </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>monensin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M5273</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>nigericin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N7143</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M8250</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions

액포와 산도 세포질이 높은 효모 세포의 조절과 전체의 pH 항상성에 중요한 역할을 차지한다. 우리는 공포 또는 세포질로 지역화 산도에 민감한 형광 물질을 사용하여 생체 내에서의 pH 비례 측정을위한 프로토콜을 설명합니다. 액포 pH는 그 아세 톡시 메틸 에스테르 형태로 세포에 도입하면 효모 공포에 지역화 BCECF를 사용하여 측정됩니다. 세포질 pH는 효모 발기인, 효모 pHluorin의 통제하에 표현 산도에 민감한 GFP로 측정됩니다. fluorimeter에서 효모 세포 현탁액의 형광 비율을 측정하는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 프로토콜을 통해 다른 조건 하에서, 또는 다른 효모 돌연변이의 pH 단일 시점의 측정이 비교되었고 시간이 지남에 따라 산도의 변화를 모니터링하고 있습니다. 이 방법은 높은 처리량 실험 형광 플레이트 리더 형식에 맞게 조정되었습니다. 다른 AP에 비례 pH 측정의 장점현재 사용 가능한 실험 문제 및 해결하고, 이러한 기술의 향후 사용에 대한 전망의 접근 방법도 설명합니다.

50 밀리미터 MES pH를 5로 버퍼링 된, 그림 1은 다양한 매체에서 자란 야생 형 효모 세포 (YEPD 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스 트란)에서 얻은 액포의 pH 데이터를 제공합니다. 배지의 pH는 특히 최소 배지 하룻밤 성장하는 동안 매우 극적으로 변화 할 수 있기 때문에 우리는 종종 버퍼 매체에 세포를 성장하고, 우리는 성장 배지의 pH가 액포의 pH 응답하기 3에 영향을 미칠 수있는 것으로 ?...

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Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

액포와 세포질 pH는 라이브 효모 측정 할 수있다 (<em&gt; S. cerevisiae의</em&gt;) 특정 세포 구획에 국한 비례 형광 염료를 사용하여 세포. 우리는 효모의 공포에 지역화 BCECF-AM, 그리고 세포질 비례 산도에 민감한 GFP (효모 pHluorin)와 세포질 산도와 액포 산도를 측정하기위한 절차를 설명합니다.

액포와 세포질의 pH 측정<em&gt; 생체 내</em&gt; 효모 세포 현탁액의

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

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