Name: measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions
Uploaded: 2013-04-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 GM50322 til PM Kane. Forfatterne takker Dr. Rajini Rao, Johns Hopkins University for å gi gjær pHluorin plasmider og for råd om Ratiometrisk pH-målinger, og Dr. Gloria A. Martinez Munoz for å arbeide ut disse protokollene for vårt laboratorium.

1. Måling av vacuolar pH In Vivo hjelp BCECF-AM <ol><li> Driv en 50 ml væskekultur av gjærstammen som skal måles i det ønskede medium over natten. Målet er å ha celler i mid-log fase (OD600 (optisk tetthet på 600 nm) måling på ca 0,8 for suspensjon). </li><li> Pellet gjærcellene ved sentrifugering. Resuspender pelleten i 0,6 ml vekstmedium og overføring til et mikrosentrifugerør som har blitt veiet tidligere. Pellet cellene igjen i en mikrosentrifuge ved 2000 xg i 60 sek. Supernatanten fjernes s?...

<ol>
	<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensors+and+regulators+of+intracellular+pH.">Sensors and regulators of intracellular pH.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).</li><li>Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+is+a+tightly+controlled+signal+in+yeast.">Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).</li><li>Diakov, T. T., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+activity+and+assembly+by+extracellular+pH.">Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH.</a> J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).</li><li>Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+and+plasma+membrane+proton+pumps+collaborate+to+achieve+cytosolic+pH+homeostasis+in+yeast.">Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast.</a> J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).</li><li>Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+loss+of+Vph1+protein-containing+vacuolar+ATPases+(V-ATPases)+for+overall+cellular+pH+homeostasis.">Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).</li><li>Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+of+vacuolar+acidification+in+H(+)-ATPase-deficient+yeast.">Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast.</a> J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).</li><li>Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+sodium/proton+exchange+by+a+Rab-GTPase-activating+protein+regulates+endosomal+traffic+in+yeast.">Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast.</a> J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endosomal+Na+K+/H++exchanger+Nhx1+regulates+cellular+pH+to+control+vesicle+trafficking.">The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).</li><li>Owen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+spectrum-shifting+intracellular+pH+probes+5'(and+6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7,+1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one+and+2',7'-biscarboxyethyl-5(and+6)-carboxyfluorescein.">Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein.</a> Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).</li><li>Dechant, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+pH+is+a+second+messenger+for+glucose+and+regulates+the+PKA+pathway+through+V-ATPase.">Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase.</a> Embo J. 29, 2515-2526 (2010).</li><li>Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+of+monensin+sensitivity+in+yeast:+implications+for+post-Golgi+traffic+and+vacuolar+H+-ATPase+function.">Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function.</a> Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).</li><li>Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionophores+and+intact+cells.+I.+Valinomycin+and+nigericin+act+preferentially+on+mitochondria+and+not+on+the+plasma+membrane+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).</li><li>Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+CLC+protein+counteracts+vesicular+acidification+during+iron+starvation.">The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation.</a> J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).</li><li>Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+cytosolic+and+mitochondrial+pH+using+a+pH-sensitive+GFP+derivative+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+relation+between+intracellular+pH+and+growth.">In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth.</a> Microbiology. 155, 268-278 (2009).</li><li>Zhang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+ergosterol+in+V-ATPase+function+underlies+antifungal+activity+of+azole+drugs.">Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).</li><li>Brett, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+the+vacuolar+pH-stat+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 6, e17619 (2011).</li><li>Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+yeast+vacuole.">Methods for studying the yeast vacuole.</a> Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).</li><li>Chan, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+V-ATPase+proton+transport+reveal+uncoupling+functions+of+tether+linking+cytosolic+and+membrane+domains+of+V0+subunit+a+(Vph1p).">Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p).</a> J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).</li><li>Johnson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+inhibitors+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+pumps+in+yeast+by+high-throughput+screening+flow+cytometry.">Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry.</a> Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).</li></ol>

Vi har benyttet disse protokollene å ta opp en rekke aspekter ved pH homeostase. For eksempel har vi sammenlignet cytosolic og pH svar av vill type og V-ATPase-mangelfull muterte celler 4,5. Vi har også undersøkt effekten av endrede vekstvilkår, særlig ekstracellulær pH, på vacuolar pH respons på glukose tre. Viktigere, responsen man observerer er begge i overensstemmelse med andre metoder for kvantitativ måling av pH og med biokjemiske data som beskriver endrede aktiviteter av protonpumpe...

pH homeostase er en dynamisk og svært regulert prosess i alle organismer 1,2. Biokjemiske prosesser er strengt regulert av pH, og intracellulære miljøer er innstilt til smale pH områder for å tillate optimal aktivitet av de fastboende enzymer. Imidlertid kan intracellulær pH ​​homeostase bli utfordret av raske endringer i miljø-pH, metabolske skift, og enkelte signalveier. I tillegg kan intracellulær pH ​​i seg selv tjene som et viktig signal. Til slutt, mange organeller opprettholde lumenal pH-verdier som er forskjellig fra det omkringliggende cytosol og avgjørende for organeller-spesifikke funksjoner. Gjær Saccharomyces cerevisiae aksjer en rekke pH homeostase mekanismer med høyere eukaryoter to. I de sure organeller i endocytic / lysosomale vei, er pH primært styrt av svært konservert vacuolar proton-translocating ATPase (V-ATPase), som opptrer i tandem med mange exchangers avhengig av pH-gradienten. Alle eukaryote celler har også proton eksport mekanismer. I sopp og planter, et sekund, distinkt proton pump på plasma membran, Pma1, eksport metabolske protoner og antas å være den viktigste determinant av cytosolic pH og plasma membran potensial. Den genetiske fleksibilitet S. cerevisiae og dens kommersielle betydning, har gjort det til en svært interessant og viktig modell for å studere pH homeostase to. I tillegg til å være de viktigste driverne av organeller forsuring, er V-ATPaser sterkt regulert enzymer og vår lab er interessert i å forstå mekanismene for V-ATPase regulering. Mot dette målet, har vi brukt in vivo pH-målinger av vacuolar og cytosolic pH: 1) å overvåke svar til skiftende ekstracellulære forhold, for eksempel glukose savn og readdition, 2) å undersøke effekten av mutasjoner som kompromiss V-ATPase aktivitet, og 3) for å utforske coornering av organellesystemer og plasma membran protonpumpene 3-5. Disse eksperimentene bare ble mulig gjennom utvikling av robuste Ratiometrisk pH indikatorer mottagelig å bruke i gjærceller. . Plante et al først viste at BCECF (2&#39;7&#39;-bis-(2-karboksyetyl) -5 - (og 6)-karboksyfluorescein), som har blitt mye brukt for å måle cytosolisk pH i pattedyrceller, akkumuleres i gjær vakuole i stedet for den 6. cytosol. Denne forskjell i BCECF lokalisering er blitt tilskrevet de mange hydrolytiske enzymer i vakuole, som sannsynligvis er ansvarlig for spalting av acetoksy-metylester fra BCECF-AM (acetoksymetyl ester av BCECF) og vacuolar retensjon 6.. Ali et al. Syv videreutviklet vacuolar pH-måling med BCECF og tilpasset disse målingene til en fluorescens plateleser format. Brett et al. Innført gjær pHluorin som et middel for måling av cytosolisk pH i gjær ved å uttrykke et plasmid-borne ratiometric pH-sensitive GFP 8 under kontroll av en gjær-promoter ni. Den eksitasjon spektra av begge BCECF og gjær pHluorin er følsomme for pH, slik at de brukes som Ratiometrisk pH-indikatorer hvor forholdet av fluorescens ved to eksitasjonsbølgelengdene, målt på en enkelt emisjonsbølgelengde, gir et mål på pH 8,10. Disse gjær vacuolar og cytosolic pH-sensorer har vært brukt til både encellede og populasjonsbasert målinger. Encellede målinger 6,11 er utført av fluorescens mikroskopi og bildeanalyse. Vacuolar eller cytosoliske fluorescens ved de to bølgelengder blir målt for hver celle. De befolkningsbaserte målinger er utført i enten en mikroplateleser med passende fluorescens evner eller i en fluorimeter. Vi har stort sett gjort våre målinger i en fluorimeter, fordi det gir enkel tilgang for tillegg av komponenter som glukose under conkontinuerlige kinetiske målinger. Vår nåværende lab protokoller for måling av vacuolar og cytosolic pH er listet nedenfor; begge er også lett tilpasses microplate analyser.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spectrofluorometer</td>
 <td>Horiba Jobin Yvon</td>
 <td>Model Fluoromax-4</td>
 <td>Temperature control and stirring capability are desirable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCECF-AM</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>B1150</td>
 <td>Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 &deg;C </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>monensin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M5273</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>nigericin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N7143</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M8250</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions

Vacuolar og cytosolic pH er sterkt regulert i gjærceller og okkupere en sentral rolle i den samlede pH homeostase. Vi beskriver protokoller for proporsjonal måling av pH in vivo ved hjelp av pH-sensitive fluorophores lokalisert til vakuole eller cytosol. Vacuolar pH er målt ved hjelp BCECF, som lokaliserer til vakuole i gjær når introdusert inn i celler i sin acetoksymetyl esterform. Cytosolic pH er målt med et pH-sensitive GFP uttrykt under kontroll av en gjær promoter, gjær pHluorin. Metoder for måling av fluorescens-forhold i gjærcelle-suspensjoner i et fluorimeter er beskrevet. Gjennom disse protokollene, enkeltdoser tidspunkt målinger av pH under forskjellige forhold eller i forskjellige gjær mutanter blitt sammenlignet og endringer i pH over tid har vært overvåket. Disse metoder har også blitt tilpasset til et fluorescens plateleser format for high-throughput eksperimenter. Fordeler med Ratiometrisk pH-målinger over andre apgangsmåter i bruk, potensielle eksperimentelle problemer og løsninger, og utsiktene for fremtidig bruk av disse teknikkene er også beskrevet.

Figur 1 viser vacuolar pH-data fremskaffet på vill-type gjær celler dyrket i rikt medium (gjærekstrakt-pepton dekstran YEPD) bufret til pH 5 med 50 mM MES. Vi ofte vokser cellene i bufret medium på grunn av pH i mediet kan endres ganske dramatisk under over natten vekst, spesielt for minimalt medium, og vi har funnet at pH i vekstmediet kan påvirke vacuolar pH responser 3. Imidlertid er det også akseptabelt for mange forsøk for å dyrke cellene i ikke-bufret medium. Figur 1A</s...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions at JoVE.com

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar og cytosolic pH kan måles i levende gjær (<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;) Celler ved hjelp Ratiometrisk fluorescerende fargestoffer lokalisert til bestemte cellene. Vi beskriver prosedyrer for måling vacuolar pH med BCECF-AM, som lokaliserer til vakuole i gjær, og cytosolic pH med en cytosolic proporsjonal pH-sensitive GFP (gjær pHluorin).

Måling av vacuolar og cytosolic pH<em&gt; In Vivo</em&gt; I gjær cellesuspensjoner

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Kvantitativ måling av Invadopodia-mediert Extracellular Matrix proteolyse i enkeltrom og Flercellede Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Enkel og effektiv teknikk for utarbeidelse av testikkel cellesuspensjoner

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Samtidig måling av pH i endocytic og cytosoliske avdelinger i levende celler ved hjelp konfokalmikroskopi

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Måling av Heme Synthesis Levels i pattedyrceller

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analyse av cellesuspensjoner Isolert fra solid vev ved Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Høyoppløselig avbildning og analyse av enkelt Astral mikrotubulidynamikk i Budding gjær

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

4D Microscopy of Yeast

4D mikroskopi av gjær

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

Effekten av fluorescerende proteiner på Fusion partnere bruker Polyglutamine toksisitet analyser i gjær

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Måling av oksygen inntak priser på intakt Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...