Name: measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions
Uploaded: 2013-04-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH R01 GM50322 в PM Кейна. Авторы благодарят доктора Раджини Рао, Университет Джона Хопкинса за предоставление дрожжей pHluorin плазмид и для рекомендаций по радиометрические измерения рН, и д-р Глория А. Мартинес Муньос для разработки этих протоколов для нашей лаборатории.

1. Измерение рН вакуолярных In Vivo Использование BCECF-AM <ol><li> Grow 50 мл жидкой культуры штамма дрожжей должна быть измерена в нужном среде в течение ночи. Цель состоит в том, чтобы иметь клеток в середине логарифмической фазы (OD 600 (оптическая плотность при 600 нм) измерение примерно 0,8 суспе...

<ol>
	<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensors+and+regulators+of+intracellular+pH.">Sensors and regulators of intracellular pH.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).</li><li>Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+is+a+tightly+controlled+signal+in+yeast.">Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).</li><li>Diakov, T. T., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+activity+and+assembly+by+extracellular+pH.">Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH.</a> J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).</li><li>Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+and+plasma+membrane+proton+pumps+collaborate+to+achieve+cytosolic+pH+homeostasis+in+yeast.">Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast.</a> J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).</li><li>Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+loss+of+Vph1+protein-containing+vacuolar+ATPases+(V-ATPases)+for+overall+cellular+pH+homeostasis.">Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).</li><li>Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+of+vacuolar+acidification+in+H(+)-ATPase-deficient+yeast.">Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast.</a> J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).</li><li>Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+sodium/proton+exchange+by+a+Rab-GTPase-activating+protein+regulates+endosomal+traffic+in+yeast.">Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast.</a> J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endosomal+Na+K+/H++exchanger+Nhx1+regulates+cellular+pH+to+control+vesicle+trafficking.">The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).</li><li>Owen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+spectrum-shifting+intracellular+pH+probes+5'(and+6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7,+1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one+and+2',7'-biscarboxyethyl-5(and+6)-carboxyfluorescein.">Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein.</a> Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).</li><li>Dechant, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+pH+is+a+second+messenger+for+glucose+and+regulates+the+PKA+pathway+through+V-ATPase.">Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase.</a> Embo J. 29, 2515-2526 (2010).</li><li>Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+of+monensin+sensitivity+in+yeast:+implications+for+post-Golgi+traffic+and+vacuolar+H+-ATPase+function.">Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function.</a> Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).</li><li>Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionophores+and+intact+cells.+I.+Valinomycin+and+nigericin+act+preferentially+on+mitochondria+and+not+on+the+plasma+membrane+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).</li><li>Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+CLC+protein+counteracts+vesicular+acidification+during+iron+starvation.">The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation.</a> J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).</li><li>Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+cytosolic+and+mitochondrial+pH+using+a+pH-sensitive+GFP+derivative+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+relation+between+intracellular+pH+and+growth.">In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth.</a> Microbiology. 155, 268-278 (2009).</li><li>Zhang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+ergosterol+in+V-ATPase+function+underlies+antifungal+activity+of+azole+drugs.">Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).</li><li>Brett, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+the+vacuolar+pH-stat+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 6, e17619 (2011).</li><li>Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+yeast+vacuole.">Methods for studying the yeast vacuole.</a> Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).</li><li>Chan, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+V-ATPase+proton+transport+reveal+uncoupling+functions+of+tether+linking+cytosolic+and+membrane+domains+of+V0+subunit+a+(Vph1p).">Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p).</a> J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).</li><li>Johnson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+inhibitors+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+pumps+in+yeast+by+high-throughput+screening+flow+cytometry.">Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry.</a> Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).</li></ol>

Мы использовали эти протоколы для решения ряда аспектов рН гомеостаза. Например, мы сравнивали цитозольного и рН реакции дикого типа и V-АТФазы с дефицитом мутантных клеток 4,5. Мы также исследовали влияние изменившихся условий роста, в частности рН внеклеточной, на вакуолярных от?...

рН гомеостаза является динамичной и строго регулируется процесс во всех 1,2 организмов. Биохимические процессы жестко регулируется рН и внутриклеточной среды настроены на узких диапазонах рН для оптимальной деятельности резидента ферментов. Однако гомеостаз внутриклеточного рН может быть оспорена быстрых изменений в рН среды, метаболические сдвиги, и определенные сигнальные пути. Кроме того, внутриклеточный рН сам по себе может служить в качестве важного сигнала. Наконец, многие органеллы поддержания просвета значениях рН, которые отличаются от окружающих цитозоль и необходимым для органелл конкретных функций. Дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE акций ряда рН гомеостаза механизмов высших эукариот 2. В кислой органелл эндоцитические / лизосомальных пути, рН главным образом управляется высоко консервативны вакуоли протон-АТФазы транслокации (V-АТФазы), действующее совместно с многими валеюрт зависит от рН градиента. Все эукариотической клетки также имеют механизмы протонной экспорт. В грибов и растений, второй, отличный протонного насоса в плазматической мембране, Pma1, экспорт метаболический протонов и, как полагают, основным фактором, определяющим цитозольного рН и потенциала плазматической мембране. Генетической гибкости С. CEREVISIAE и его коммерческой важности, сделали его очень интересной и важной моделью для изучения рН гомеостаза 2. Помимо того, что главной движущей силой в подкисления органелл, V-АТФазы строго регулируется ферментами и наша лаборатория заинтересован в понимании механизмов V-АТФазы регулирования. Для достижения этой цели мы используем в естественных условиях измерения рН и вакуолярных цитозольные рН: 1) для контроля реакции на меняющийся внеклеточной условия, такие как глюкоза и лишения readdition, 2) для изучения влияния мутаций, что компромисс V-АТФазы, и 3) изучить координатахдинация органелл и плазматической мембраной протонного насоса 3-5. Эти эксперименты только стало возможным благодаря разработке надежных радиометрические показатели рН поддается использовать в клетках дрожжей. . Растений и др. впервые показали, что BCECF (2&#39;7&#39;-бис-(2-карбоксиэтил) -5 - (и 6)-карбоксифлуоресцеина), который широко используется для измерения цитозольного рН в клетках млекопитающих, накапливается в дрожжевой вакуоль вместо цитозоле 6. Это различие в локализации BCECF было обусловлено многими гидролитических ферментов в вакуоль, которые, вероятно, ответственных за отщеплению ацетокси-метиловый эфир из BCECF-AM (ацетоксиметил эфира BCECF) и вакуоли удержания 6. Али и др.. 7 дальнейшее развитие вакуолярных измерения рН с использованием BCECF и ​​адаптировать этих измерений флуоресценции формате ридере. Brett соавт. Введены дрожжи pHluorin в качестве средства измерения цитозольного рН в дрожжах путем экспрессии плазмиды Гatiometric рН-чувствительных 8 GFP под контролем дрожжевого промотора 9. Спектры возбуждения и BCECF и ​​дрожжей pHluorin чувствительные к рН, поэтому они используются в качестве логометрических показатели рН, в которой отношение флуоресценции при возбуждении двух длинах волн, измеренные при одной длине волны излучения, обеспечивает измерение рН 8,10. Эти дрожжи вакуолярных и цитозольные датчики рН были использованы как для одноклеточных и популяционном уровнях измерений. Одноклеточные измерений 6,11 выполняются с помощью флуоресцентной микроскопии и анализа изображений. Вакуоли или цитозольных флуоресценции при двух длинах волн измеряют для каждой ячейки. Населения на основе измерения выполняются в любом планшетного флуоресценции с соответствующими возможностями или в флуориметра. В целом, мы сделали наши измерения на флуориметре, потому что она обеспечивает легкий доступ для добавления компонентов, таких как глюкоза во Conнепрерывный кинетических измерений. Наши текущие протоколы лаборатории для измерения и вакуолярных цитозольные рН перечислены ниже, оба они являются также легко адаптируется к микропланшет анализов.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spectrofluorometer</td>
 <td>Horiba Jobin Yvon</td>
 <td>Model Fluoromax-4</td>
 <td>Temperature control and stirring capability are desirable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCECF-AM</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>B1150</td>
 <td>Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 &deg;C </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>monensin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M5273</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>nigericin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N7143</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M8250</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions

Вакуоли и цитозольных рН строго регулируется в клетках дрожжей и занимают центральную роль в гомеостазе общий рН. Мы описываем протоколы для радиометрические измерения рН в естественных условиях использования рН-чувствительных флуорофорам локализован в вакуоль или цитозоль. Вакуоли рН измеряли с использованием BCECF, который локализуется в вакуоль в дрожжах при введении в клетки в ацетоксиметил форме сложного эфира. Цитозольного рН измеряли с помощью рН-чувствительных GFP экспрессировался под контролем промотора, дрожжи, дрожжевой pHluorin. Методы измерения флуоресценции соотношений в дрожжевой клетке суспензий на флуориметре описаны. С помощью этих протоколов, один момент времени измерения рН в разных условиях и в разных мутантов дрожжей сравнением и изменения рН в течение долгого времени был проведен мониторинг. Эти методы также были адаптированы к флуоресцентным планшет-ридере формат высокой пропускной экспериментов. Преимущества радиометрические измерения рН по сравнению с другими APподходы используются в настоящее время, потенциальные экспериментальные проблемы и решения, а также перспективы для будущего использования этих методов также описаны.

1 приведены данные вакуоли рН полученных на дрожжей дикого типа клеток, выращенных в обогащенной среде (дрожжевой экстракт-пептон-декстраном; YEPD), забуференном до рН 5 с помощью 50 мМ MES. Мы часто выращивать клетки в буферной среде, поскольку рН среды может резко измениться в тече?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions at JoVE.com

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Вакуоли и цитозольных рН может быть измерена в живых дрожжей (<em&gt; С. CEREVISIAE</em&gt;) При использовании логометрического флуоресцентных красителей локализованы в конкретных клеточных компартментах. Опишем процедуры измерения рН вакуоли с BCECF-AM, который локализуется в вакуоль у дрожжей и цитозольных рН с цитозольного логометрических рН-чувствительных GFP (дрожжи pHluorin).

Измерение и вакуолярных Цитозольные рН<em&gt; In Vivo</em&gt; В суспензиях Дрожжи клеточной

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

В естественных условиях микро-циркуляции Измерение в скелетной мышце путем Intra-жизненно микроскопии

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Количественное измерение Invadopodia-опосредованного протеолиза внеклеточной матрицы в одно-и многоклеточных контексты

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Простой и эффективный способ для подготовки яичек клеточные суспензии

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Измерение Одновременное рН в эндоцитотических и цитозольные отсеков в живых клетках с помощью конфокальной микроскопии

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Измерение уровней Гем синтез в клетках млекопитающих

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Анализ Суспензии клеток, выделенная из твердых тканей с помощью спектральной проточной цитометрии

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Изображения с высоким разрешением и анализ индивидуальной астральных микротрубочек динамики в почкующихся дрожжах

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

4D Microscopy of Yeast

4D Микроскопия дрожжей

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

Влияние на Fusion партнеров с помощью анализов токсичности Хантингтона в дрожжи флуоресцентных белков

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Измерение коэффициентов потребления кислорода в неповрежденной Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...