Name: measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions
Uploaded: 2013-04-19T12:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el NIH R01 GM50322 a PM Kane. Los autores agradecen al Dr. Rajini Rao, de la Universidad Johns Hopkins para la prestación de los plásmidos pHluorin levadura y asesoramiento sobre medidas de pH radiométricos y Dra. Gloria A. Martínez Muñoz para la elaboración de estos protocolos para nuestro laboratorio.

1. Medida del pH vacuolar in vivo usando BCECF-AM <ol><li> Crecer un cultivo líquido de 50 ml de la cepa de levadura a medir en el medio deseado durante la noche. El objetivo es que las células en fase semilogarítmica (OD600 (densidad óptica a 600 nm) de medición de aproximadamente 0,8 para la suspensión). </li><li> Sedimentar las células de levadura mediante centrifugación. Resuspender el precipitado en 0,6 ml de medio de crecimiento y la transferencia a un tubo de microcentrífuga que ha sido previa...

<ol>
	<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensors+and+regulators+of+intracellular+pH.">Sensors and regulators of intracellular pH.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).</li><li>Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+is+a+tightly+controlled+signal+in+yeast.">Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).</li><li>Diakov, T. T., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+activity+and+assembly+by+extracellular+pH.">Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH.</a> J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).</li><li>Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+and+plasma+membrane+proton+pumps+collaborate+to+achieve+cytosolic+pH+homeostasis+in+yeast.">Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast.</a> J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).</li><li>Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+loss+of+Vph1+protein-containing+vacuolar+ATPases+(V-ATPases)+for+overall+cellular+pH+homeostasis.">Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).</li><li>Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+of+vacuolar+acidification+in+H(+)-ATPase-deficient+yeast.">Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast.</a> J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).</li><li>Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+sodium/proton+exchange+by+a+Rab-GTPase-activating+protein+regulates+endosomal+traffic+in+yeast.">Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast.</a> J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endosomal+Na+K+/H++exchanger+Nhx1+regulates+cellular+pH+to+control+vesicle+trafficking.">The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).</li><li>Owen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+spectrum-shifting+intracellular+pH+probes+5'(and+6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7,+1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one+and+2',7'-biscarboxyethyl-5(and+6)-carboxyfluorescein.">Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein.</a> Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).</li><li>Dechant, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+pH+is+a+second+messenger+for+glucose+and+regulates+the+PKA+pathway+through+V-ATPase.">Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase.</a> Embo J. 29, 2515-2526 (2010).</li><li>Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+of+monensin+sensitivity+in+yeast:+implications+for+post-Golgi+traffic+and+vacuolar+H+-ATPase+function.">Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function.</a> Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).</li><li>Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionophores+and+intact+cells.+I.+Valinomycin+and+nigericin+act+preferentially+on+mitochondria+and+not+on+the+plasma+membrane+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).</li><li>Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+CLC+protein+counteracts+vesicular+acidification+during+iron+starvation.">The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation.</a> J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).</li><li>Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+cytosolic+and+mitochondrial+pH+using+a+pH-sensitive+GFP+derivative+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+relation+between+intracellular+pH+and+growth.">In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth.</a> Microbiology. 155, 268-278 (2009).</li><li>Zhang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+ergosterol+in+V-ATPase+function+underlies+antifungal+activity+of+azole+drugs.">Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).</li><li>Brett, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+the+vacuolar+pH-stat+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 6, e17619 (2011).</li><li>Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+yeast+vacuole.">Methods for studying the yeast vacuole.</a> Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).</li><li>Chan, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+V-ATPase+proton+transport+reveal+uncoupling+functions+of+tether+linking+cytosolic+and+membrane+domains+of+V0+subunit+a+(Vph1p).">Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p).</a> J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).</li><li>Johnson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+inhibitors+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+pumps+in+yeast+by+high-throughput+screening+flow+cytometry.">Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry.</a> Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).</li></ol>

Hemos utilizado estos protocolos para hacer frente a una serie de aspectos de la homeostasis del pH. Por ejemplo, hemos comparado las respuestas citosólicas y el pH de las células mutantes de tipo salvaje y V-ATPasa deficiente en 4,5. También hemos examinado los efectos de las condiciones de crecimiento alterado, pH extracelular, particularmente en respuesta a la glucosa pH vacuolar 3. Es importante destacar que las respuestas que se observan son a la vez coherente con otros métodos de medició...

la homeostasis del pH es un proceso dinámico y altamente regulado en todos los organismos 1,2. Los procesos bioquímicos están fuertemente regulados por el pH, y los ambientes intracelulares están sintonizados con rangos estrechos de pH para permitir la óptima actividad de las enzimas residentes. Sin embargo, la homeostasis del pH intracelular puede ser impugnada por los rápidos cambios en el pH del medio ambiente, los cambios metabólicos y algunas vías de señalización. Además, el pH intracelular puede servir por sí misma como una señal importante. Por último, muchos orgánulos mantener los valores pH de la luz que son distintos desde el citosol circundante y esenciales para las funciones específicas de orgánulo. Los Saccharomyces cerevisiae de levadura acciones un número de mecanismos de homeostasis de pH con eucariotas superiores 2. En los orgánulos ácidos de la vía endocítica / lisosomal, el pH se controla principalmente por el muy conservadas de protones ATPasa vacuolar translocación (V-ATPasa), en actuación conjunta con muchos intercambiadoresgers dependientes del gradiente de pH. Todas las células eucariotas también tienen mecanismos de exportación de protones. En los hongos y las plantas, un segundo, de la bomba de protones distinto en la membrana plasmática, PMA1, las exportaciones protones metabólicas y se cree que es el principal determinante de pH citosólico y el potencial de la membrana plasmática. La flexibilidad genética de S. cerevisiae y su importancia comercial, se han convertido en un modelo muy interesante e importante para el estudio de la homeostasis del pH 2. Además de ser los principales impulsores de la acidificación de orgánulos, V-ATPasas están altamente regulados enzimas y nuestro laboratorio está interesado en comprender los mecanismos de regulación V-ATPasa. Para lograr este objetivo, hemos utilizado en las mediciones de pH in vivo de pH vacuolar y citosólica: 1) para monitorear las respuestas a las cambiantes condiciones extracelulares, tales como la privación de glucosa y readdition, 2) para examinar los efectos de las mutaciones que comprometen la actividad V-ATPasa, y 3) para explorar la coorsobre coordinación de los orgánulos y plasma bombas de protones de membrana 3-5. Estos experimentos sólo se hizo posible mediante el desarrollo de indicadores de pH ratiometric sólidas susceptibles de utilizar en células de levadura. . Planta et al primero mostró que BCECF (2&#39;7&#39;-bis-(2-carboxietil) -5 - (y 6)-carboxifluoresceína), que se ha utilizado ampliamente para medir el pH citosólico en células de mamífero, se acumula en la vacuola de levadura en lugar de la citosol 6. Esta diferencia en la localización de BCECF se ha atribuido a las muchas enzimas hidrolíticas en la vacuola, que probablemente responsable de la escisión del éster de metilo acetoxi de BCECF-AM (éster de acetoximetilo de BCECF) y vacuolar de retención 6. Ali et al. 7 desarrollado la medición del pH vacuolar con BCECF y adaptado estas mediciones en un formato de lector de placas de fluorescencia. Brett et al. Introducido pHluorin levadura como un medio de medir el pH citosólico en la levadura mediante la expresión de un plásmido r transmitidasatiometric GFP sensible al pH 8 bajo el control de un promotor de levadura-específica 9. Los espectros de excitación de ambos BCECF y la levadura pHluorin son sensibles al pH, por lo que se utilizan como indicadores de pH radiométricos en los que la proporción de fluorescencia a dos longitudes de onda de excitación, medidos a una única longitud de onda de emisión, proporciona una medida de pH 8,10. Estas levaduras sensores de pH vacuolar y citosólica se han utilizado tanto para mediciones de una sola célula y poblacional. Mediciones de celda única 6,11 se realizan por microscopía de fluorescencia y análisis de imágenes. Fluorescencia vacuolar o citosólica en las dos longitudes de onda se mide para cada célula. Las mediciones basadas en la población se llevan a cabo ya sea en un lector de microplacas con capacidades de fluorescencia apropiados o en un fluorímetro. Hemos hecho generalmente nuestras mediciones en un fluorímetro, ya que proporciona un fácil acceso para la adición de componentes, tales como la glucosa durante el conmediciones cinéticas continuas. Nuestros protocolos de laboratorio actuales para la medición de pH vacuolar y citosólica se enumeran a continuación, ambos también se adaptan fácilmente a los ensayos de microplaca.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spectrofluorometer</td>
 <td>Horiba Jobin Yvon</td>
 <td>Model Fluoromax-4</td>
 <td>Temperature control and stirring capability are desirable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCECF-AM</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>B1150</td>
 <td>Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 &deg;C </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>monensin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M5273</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>nigericin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N7143</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M8250</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions

Vacuolar y el pH citosólico están altamente regulados en células de levadura y ocupan un papel central en la homeostasis global de pH. Se describen protocolos para la medición radiométrica de pH in vivo utilizando fluoróforos sensibles al pH localizadas en la vacuola o citosol. PH vacuolar se mide usando BCECF, que se localiza en la vacuola en la levadura cuando se introduce en las células en su forma de éster de acetoximetilo. PH citosólico se mide con una GFP sensible al pH expresado bajo el control de un promotor de levadura, levadura pHluorin. Se describen métodos para la medición de fluorescencia ratios en suspensiones de células de levadura en un fluorímetro. A través de estos protocolos, mediciones puntuales de tiempo individuales de pH bajo condiciones diferentes o en diferentes mutantes de levadura se han comparado y los cambios de pH a través del tiempo han sido controlados. Estos métodos también se han adaptado a un formato de lector de placas de fluorescencia para experimentos de alto rendimiento. Ventajas de las mediciones de pH ratiometric más de otros APTambién se describen los enfoques actualmente en uso, posibles problemas y soluciones experimentales, y las perspectivas para el futuro uso de estas técnicas.

La Figura 1 presenta los datos de pH vacuolar obtenidos en células de levadura de tipo salvaje cultivadas en medio rico (extracto de levadura-peptona-dextrano; YEPD) tamponada a pH 5 con 50 mM de MES. A menudo crecer las células en medio tamponado debido a que el pH del medio puede cambiar de manera espectacular durante el crecimiento durante la noche, en particular para un medio mínimo, y hemos encontrado que el pH del medio de crecimiento puede afectar a las respuestas de pH vacuolar 3. ...

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Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

PH vacuolar y citosólica se puede medir en la levadura en vivo (<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;) Células usando colorantes fluorescentes ratiometric localizados en compartimentos celulares específicos. Se describen procedimientos para la medición de pH vacuolar con BCECF-AM, que se localiza en la vacuola en levaduras, y el pH citosólico con una GFP sensible al pH radiométrica citosólica (levadura pHluorin).

La medición de pH vacuolar y citosólica<em&gt; En Vivo</em&gt; En suspensiones de células de levadura

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

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