Name: measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions
Uploaded: 2013-04-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH R01 GM50322 till PM Kane. Författarna tackar Dr Rajini Rao, Johns Hopkins University för att ge jästen pHluorin plasmider och för råd om ratiometrisk pH-mätningar, och Dr Gloria A. Martinez Munoz för att arbeta ut dessa protokoll för vårt labb.

Ett. Mätning av vakuolär pH In Vivo Använda BCECF-AM <ol><li> Odla en 50 ml flytande kultur av jäststammen som skall mätas i det önskade mediet över natten. Målet är att ha celler i mitten av log-fas (OD600 (optisk densitet vid 600 nm) mätning av cirka 0,8 för upphängning). </li><li> Pellets jästcellerna genom centrifugering. Återsuspendera pelleten i 0,6 ml av tillväxtmediet och överför till ett mikrocentrifugrör som har vägts tidigare. Pellets cellerna igen i en mikrocentrifug vid 2000 x ...

<ol>
	<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensors+and+regulators+of+intracellular+pH.">Sensors and regulators of intracellular pH.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).</li><li>Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+is+a+tightly+controlled+signal+in+yeast.">Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).</li><li>Diakov, T. T., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+activity+and+assembly+by+extracellular+pH.">Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH.</a> J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).</li><li>Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+and+plasma+membrane+proton+pumps+collaborate+to+achieve+cytosolic+pH+homeostasis+in+yeast.">Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast.</a> J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).</li><li>Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+loss+of+Vph1+protein-containing+vacuolar+ATPases+(V-ATPases)+for+overall+cellular+pH+homeostasis.">Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).</li><li>Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+of+vacuolar+acidification+in+H(+)-ATPase-deficient+yeast.">Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast.</a> J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).</li><li>Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+sodium/proton+exchange+by+a+Rab-GTPase-activating+protein+regulates+endosomal+traffic+in+yeast.">Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast.</a> J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endosomal+Na+K+/H++exchanger+Nhx1+regulates+cellular+pH+to+control+vesicle+trafficking.">The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).</li><li>Owen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+spectrum-shifting+intracellular+pH+probes+5'(and+6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7,+1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one+and+2',7'-biscarboxyethyl-5(and+6)-carboxyfluorescein.">Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein.</a> Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).</li><li>Dechant, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+pH+is+a+second+messenger+for+glucose+and+regulates+the+PKA+pathway+through+V-ATPase.">Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase.</a> Embo J. 29, 2515-2526 (2010).</li><li>Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+of+monensin+sensitivity+in+yeast:+implications+for+post-Golgi+traffic+and+vacuolar+H+-ATPase+function.">Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function.</a> Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).</li><li>Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionophores+and+intact+cells.+I.+Valinomycin+and+nigericin+act+preferentially+on+mitochondria+and+not+on+the+plasma+membrane+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).</li><li>Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+CLC+protein+counteracts+vesicular+acidification+during+iron+starvation.">The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation.</a> J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).</li><li>Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+cytosolic+and+mitochondrial+pH+using+a+pH-sensitive+GFP+derivative+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+relation+between+intracellular+pH+and+growth.">In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth.</a> Microbiology. 155, 268-278 (2009).</li><li>Zhang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+ergosterol+in+V-ATPase+function+underlies+antifungal+activity+of+azole+drugs.">Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).</li><li>Brett, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+the+vacuolar+pH-stat+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 6, e17619 (2011).</li><li>Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+yeast+vacuole.">Methods for studying the yeast vacuole.</a> Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).</li><li>Chan, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+V-ATPase+proton+transport+reveal+uncoupling+functions+of+tether+linking+cytosolic+and+membrane+domains+of+V0+subunit+a+(Vph1p).">Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p).</a> J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).</li><li>Johnson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+inhibitors+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+pumps+in+yeast+by+high-throughput+screening+flow+cytometry.">Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry.</a> Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).</li></ol>

Vi har utnyttjat dessa protokoll för att hantera ett antal aspekter av pH-homeostas. Till exempel har vi jämförde cytosoliska och pH-svaren av vildtyp och V-ATPas-deficient mutantceller 4,5. Vi har även undersökt effekterna av förändrade tillväxtförutsättningar, särskilt extracellulära pH, på vakuolär pH svar på glukos 3. Viktigt svaren vi observerar är både förenligt med andra metoder för kvantitativ pH-mätning och med biokemiska data som beskriver förändrade verksamhet proto...

pH homeostas är en dynamisk och starkt reglerad process i alla organismer 1,2. Biokemiska processer är tätt regleras av pH, och intracellulära miljöer är inställda snäva pH-områden för att möjliggöra optimal aktivitet för de inhemska enzymer. Däremot kan intracellulära pH homeostas att utmanas av snabba förändringar i miljön pH, metabola förändringar, och vissa signalvägar. Dessutom kan intracellulära pH sig utgöra en viktig signal. Slutligen, många organeller upprätthålla lumenal pH-värden som skiljer sig från den omgivande cytosolen och avgörande för organell-specifika funktioner. Jästsvampen Saccharomyces cerevisiae delar ett antal mekanismer pH homeostas med högre eukaryoter 2. I de sura organeller i endocytiska / lysosomala vägen är pH främst styrs av starkt konserverade vakuolär proton-translokerande ATPas (V-ATPas), agerar tillsammans med många valutakursgers beroende av pH-gradienten. Alla eukaryota celler har också mekanismer proton export. I svampar och växter, en sekund, distinkt protonpumpshämmare vid plasmamembranet, Pma1, export metaboliska protoner och tros vara den avgörande faktorn för cytosolic pH och plasmamembran potential. Den genetiska flexibilitet S. cerevisiae och dess kommersiella betydelse, har gjort det en mycket intressant och viktig modell för att studera pH homeostas 2. Förutom att vara de primära drivkrafterna för organell försurning, är V-ATPases regleras mycket enzymer och vårt labb är intresserad av att förstå mekanismerna hos V-ATPas förordning. Mot detta mål, har vi använt in vivo pH-mätningar av vakuolär och cytosolisk pH: 1) att övervaka svar på förändrade extracellulära förhållanden, såsom glukos deprivation och readdition, 2) att undersöka effekterna av mutationer som kompromiss V-ATPas-aktivitet, och 3) att utforska samordning av organell och plasmamembran protonpumpar 3-5. Dessa experiment blev möjlig endast genom utveckling av robusta ratiometrisk pH-indikatorer som lämpar sig för användning i jästceller. . Växt et al först visade att BCECF (2&#39;7&#39;-bis-(2-karboxietyl) -5 - (och 6)-karboxifluorescein), som har använts i stor utsträckning för att mäta cytosoliskt pH i däggdjursceller, ackumuleras i jästen vakuolen i stället för den cytosolen 6. Denna skillnad i BCECF lokalisering har tillskrivits många hydrolytiska enzymer i vakuolen, som sannolikt ansvariga för klyvning av acetoxy metylestern från BCECF-AM (acetoximetylester av BCECF) och vakuolär behålla 6. Ali et al. 7 vidareutvecklat vakuolär pH-mätning med hjälp BCECF och anpassat dessa mätningar till en fluorescens plattläsaren format. Brett et al. Introducerade jäst pHluorin som ett sätt att mäta cytosoliskt pH i jäst genom att uttrycka en plasmidburen ratiometric pH-känsligt GFP 8 under kontroll av en jäst-promotor 9. Den excitationsspektra av både BCECF och jäst pHluorin är känsliga för pH, så de används som ratiometrisk pH-indikatorer i vilka förhållandet av fluorescens vid två exciteringsvåglängder, mätt vid en enda emissionsvåglängd, ger ett mått på pH 8,10. Dessa jäst vakuolära och cytosolisk pH-sensorer har använts för både encelliga och befolkning-baserade mätningar. Encelliga mätningar 6,11 utförs av fluorescens mikroskopi och bildanalys. Vakuolär eller cytosolisk fluorescens vid de två våglängderna mäts för varje cell. De populationsbaserade Mätningarna utförs i antingen en mikroplattläsare med lämpliga fluorescens kapacitet eller i en fluorimeter. Vi har generellt sett gjort våra mätningar i en fluorimeter, eftersom det ger enkel åtkomst för tillsättning av komponenter såsom glukos under kondiga kinetiska mätningar. Våra nuvarande lab protokoll för mätning av vakuolär och cytosolic pH är listade nedan, båda är också lätt anpassas till mikroplatt analyser.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spectrofluorometer</td>
 <td>Horiba Jobin Yvon</td>
 <td>Model Fluoromax-4</td>
 <td>Temperature control and stirring capability are desirable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCECF-AM</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>B1150</td>
 <td>Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 &deg;C </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>monensin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M5273</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>nigericin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N7143</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M8250</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions

Vakuolär och cytosolisk pH är starkt reglerad i jästceller och intar en central roll i den övergripande pH homeostas. Vi beskriver protokoll för ratiometrisk mätning av pH in vivo med hjälp av pH-känsliga fluoroforer lokaliserade till vakuolen eller cytosolen. Vakuolär pH mäts med BCECF, som lokaliserar till vakuolen i jäst när de införs i celler i sin acetoximetylester formulär. Cytosoliskt pH mäts med en pH-känslig GFP uttryckt under kontroll av en jästpromotor, jäst pHluorin. Metoder för mätning av fluorescens förhållanden i suspensioner jästcell i en fluorimeter beskrivs. Genom dessa protokoll har enstaka tidpunkt mätningar av pH under olika förhållanden eller i olika jästmutanter jämförts och förändringar i pH över tiden har övervakats. Dessa metoder har också anpassats till en fluorescens plattläsaren format för hög genomströmning experiment. Fördelar med ratiometrisk pH-mätningar över andra apinfallsvinklar för närvarande är i bruk, eventuella experimentella problem och lösningar, samt utsikterna för framtida användning av dessa tekniker beskrivs också.

Figur 1 visar vakuolära pH data erhållna från vildtyp jästceller odlas i rikt medium (jästextrakt-pepton-dextran, YEPD) buffrad till pH 5 med 50 mM MES. Vi växer ofta av cellerna i buffrat medium eftersom mediets pH kan förändras ganska dramatiskt under tillväxt över natten, särskilt för minimalt medium, och vi har funnit att pH för tillväxtmediet kan påverka vakuolära pH svar 3. Men det är också acceptabelt för många försök att odla cellerna i obuffrat mediet. F...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions at JoVE.com

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vakuolär och cytosolisk pH kan mätas i aktiv jäst (<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;) Celler med ratiometrisk fluorescerande färgämnen lokaliserade till specifika cellulära avdelningar. Vi beskriver förfaranden för mätning vakuolär pH med BCECF-AM, som lokaliserar till vakuolen i jäst, och cytosolisk pH med en cytosolisk ratiometrisk pH-känsliga GFP (jäst pHluorin).

Mätning av vakuolär och cytosolisk pH<em&gt; In Vivo</em&gt; I jästcell Suspensioner

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

In vivo Micro-cirkulation Mätning i skelettmuskel genom Intra-vitala Mikroskopi

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Kvantitativ mätning av Invadopodia-medierad extracellulär matrix proteolys i enkel-och flercelliga kontexter

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Enkel och effektiv teknik för framställning av Testicular cellsuspensioner

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Samtidig pH-mätning i endocytic och Cytosoliska fack i levande celler med hjälp av konfokalmikroskopi

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Mätning av hemsyntesen nivåer i däggdjursceller

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analys av cellsuspensioner Isolerade från fasta vävnader från Spectral flödescytometri

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Högupplöst avbildning och analys av enskilda Astral mikrotubuli Dynamics i knoppande jäst

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

4D Microscopy of Yeast

4D mikroskopi av jäst

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

Effekten av fluorescerande proteiner på Fusion Partners använder Polyglutamine toxicitet analyser i jäst

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mätning av syre förbrukning i intakt Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...