Name: design and use of multiplexed chemostat arrays
Uploaded: 2013-02-23T00:00:00
Duration: 19 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays at JoVE.com

Oprettelse af videoen blev støttet af tilskud fra National Center for Forskning Ressourcer (5P41RR011823-17) og National Institute of General Medical Sciences (8 P41 GM103533-17) fra National Institutes of Health. Dette arbejde blev også støttet af NSF tilskud 1.120.425. MJD er en Rita Allen Foundation Scholar. AWM er delvist understøttet af NIH T32 HG00035. Vi takker Anna Sunshine for at få hjælp med at forbedre protokoller. Derudover anerkender vi Sara DiRienzi, Celia Payen, og Amy Sirr som tidlige brugere af ministats.

Brug passende steril teknik i hele protokollen. 1. Samle dele til og forberedelse af Ministat Array <ol><li> Bestil alle dele. </li><li> Rene glasrør. Markere rør ved 20 ml volumen. </li><li> Gør kork samlinger med luft, medier og spildevand havne og placere dem på toppen af ​​de rengjorte glas kultur rør. </li><li> Forbered befugtningsceller kamre og arrangere alle ikke-autoklaverede dele. </li><li> Gør luft, spildevand og medier rør ved hjælp af tilstrækkelige rørstykker og kompatible koblinger. </li><li> Slut hver type slange (luft, medier og spildevand) til kork forsamlinger og folie filtre og medierne hurtig-forbindelse at forberede dem til autoklaven. </li><li> Der fremstilles en flaske til anvendelse ved fremstilling af sterile kemostat medium. </li><li> Forbered kultur sampling flasker ved at indsætte en to-huls gummiprop med passende fittings. Folie hvert filter at forberede dem på autoklaven. </li><li> Fit det samlet system pænt ind i en eller flere autoklave bakker og autoklaver alle dele. </li><li> Lav og filtrere kemostat medier i autoklaverede flasker. </li></ol> 2. Opsætning af et eksperiment <ol><li> Fyld hver hydrering kolbe med 700 ml ddH 2 O. </li><li> Placere autoklaverede ministats ind i varmeblokken indstillet ved den ønskede temperatur. </li><li> Placer flyselskaber i den 4-port manifold og tænd for luftpumpe. </li><li> Tilslut spildevand linjer til 100 ml indsamling flasker. </li><li> Fjern folien fra slutningen af ​​mediernes rør og medier ballon og forbinde de to hurtig forbindelse. Før hver længde af pumpeslange gennem en peristaltisk pumpe patron og klik dem på plads. Tænd medierne pumpen. </li><li> Lad kamrene udfylde. Sluk for medierne pumpen. </li><li> Spray kork forsamlinger med 70% ethanol og pode kulturerne ved hjælp af en sprøjte. Gem en prøve af inokulum som en frossen glycerol lagerom ønsket. Lad kulturer vokser i 30 timer. </li><li> Justere højden af ​​effluenten nålen indtil kulturen volumen indstilles til 20 ml med luftstrømmen slukket. Dette kan tage flere justeringer i løbet af en time. Når du er færdig vende luftstrømmen igen. </li><li> Drej medierne pumpen. </li><li> Tømme spildevand prøveudtagning flasker, der indeholder medier indsamles, mens indstilling af arbejdskulturen volumen, og registrere tiden. </li><li> For at tage et tid-nul måling sted spildevandet linjer i sterile indsamling rør til 15 min-2 timer (afhængigt af hvad volumen, du ønsker at prøve til DNA-analyse). Også gøre en glycerol frosset for hver kultur på dette tidspunkt om ønsket. </li></ol> 3. Daglige målinger <ol><li> Som med din tid-nul måling, prøve på is i 15 min-2 timer (som krævet for dit eksperiment) på is og registrere tiden udtaget til DNA og frosne lager prøver. </li><li> For RNA-prøver enten samle en lille volUme anvendelse af en sprøjte og 22G 5 &quot;nålen fra kulturen eller trække proppen hver ministat til at udnytte hele kulturen. Prøverne tages hurtigt, opsamlet ved filtrering og frosset øjeblikkeligt i flydende nitrogen. </li><li> Mål spildevand opsamlet siden sidste prøveudtagning for hver ministat at kvantificere fortynding sats. Justér fortynding satser hvis det er nødvendigt ved at justere pumpens indstilling eller tuning finjusteres på de enkelte pumpe linjer. </li><li> Udskift spildevand linjer i tom samling flasker. </li><li> Kvantificere celler / ml samt andre endpoints af interesse og gøre en glycerol frosset. </li></ol> 4. Post-eksperiment Oprydning <ol><li> Placer alle rør ud separate bakker og skyl omhyggeligt med ddH 2 O. Tør rør ved hjælp af et akvarium pumpe. </li><li> Rengør kork forsamlinger med Hedeselskabet 2 O og bruge nål indsats for at rense de nåle, opsugning og dispensering vand efter tur. Tør nålene og kork at fjerneresterende medier. </li><li> Rengør glasrør med vand og ethanol, og fjern fysiske forureninger med 3 balled op Kimwipes og pincet. </li><li> Skyl og tør alle dele igen før brug. </li></ol>

<ol>
	<li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R&#233;cherches+sur+la+Croissance+des+Cultures+Bacteriennes.">R&#233;cherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes.</a> Ann. I. Pasteur. 79, 390-410 (1950).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+the+chemostat.">Description of the chemostat.</a> Science. 15, 715-716 (1950).</li><li>Daran-Lapujade, P., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., de Winde, J. H., Pronk, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemostat-based+micro-array+analysis+in+baker's+yeast.">Chemostat-based micro-array analysis in baker's yeast.</a> Adv. Microb. Physiol. 54, 257-311 (2009).</li><li>ter Linde, J. J. M., Pronk, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transcriptional+analysis+of+aerobic+and+anaerobic+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 181, 7409-7413 (1999).</li><li>Boer, V., de Winde, J., Pronk, J., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome-wide+transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisiae+grown+on+glucose+in+aerobic+chemostat+cultures+limited+for+carbon,+nitrogen,+phosphorus,+or+sulfur.">The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur.</a> J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).</li><li>Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K., Oliver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+nutrient+control+of+gene+expression+in+Saccharomyces+cerevisiae+during+growth+and+starvation.">Global analysis of nutrient control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae during growth and starvation.</a> 101, 3148-3153 (2004).</li><li>Diderich, J. A., Kruckeberg, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Uptake+Kinetics+and+Transcription+of+HXT+Genes+in+Chemostat+Cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Glucose Uptake Kinetics and Transcription of HXT Genes in Chemostat Cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 274, 15350-15359 (1999).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria.">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).</li><li>Kubitschek, H. E., Bendigkeit, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+continuous+cultures.+I.+Dependence+of+mutational+response+upon+growth-limiting+factors.">Mutation in continuous cultures. I. Dependence of mutational response upon growth-limiting factors.</a> Mutation Res. 1, 113-120 (1964).</li><li>Gresham, D., Dunham, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+and+Dynamics+of+Evolutionary+Adaptations+to+Controlled+Nutrient-Limited+Environments+in+Yeast.">The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast.</a> PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).</li><li>Kao, K. C., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+clonal+interference+during+adaptive+evolution+in+asexual+populations+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).</li><li>Kvitek, D. J., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Sign+Epistasis+between+Frequently+Experimentally+Evolved+Adaptive+Mutations+Causes+a+Rugged+Fitness+Landscape.">Reciprocal Sign Epistasis between Frequently Experimentally Evolved Adaptive Mutations Causes a Rugged Fitness Landscape.</a> PLoS Genet. 7, e1002056 (2011).</li><li>Helling, R. B., Adams, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+during+Growth+in+a+Constant+Environment.">Evolution of Escherichia coli during Growth in a Constant Environment.</a> Genetics. 116, 349-358 (1987).</li><li>Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Evolution+in+Yeast:+A+Practical+Guide.">Experimental Evolution in Yeast: A Practical Guide.</a> Methods Enzymol. 470, (2010).</li><li>Hoskisson, P. A., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+-+making+a+comeback.">Continuous culture - making a comeback.</a> Microbiology. 151, 3153-3159 (2005).</li><li>Nanchen, A., Schicker, A., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+dependency+of+intracellular+fluxes+on+growth+rate+in+miniaturized+continuous+cultures+of+Escherichia+coli.">Nonlinear dependency of intracellular fluxes on growth rate in miniaturized continuous cultures of Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 1164-1172 (2006).</li><li>Klein, T., Schneider, K., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+miniaturized+stirred+bioreactors+for+parallel+continuous+cultivation+of+yeast+with+online+measurement+of+dissolved+oxygen+and+off-gas.">A system of miniaturized stirred bioreactors for parallel continuous cultivation of yeast with online measurement of dissolved oxygen and off-gas.</a> Biotechnol. and bioeng. , (2012).</li><li>Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+bacteria+undergoing+programmed+population+control+in+a+microchemostat.">Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat.</a> Science. 309, 137-140 (2005).</li><li>Groisman, A., Lobo, C., Cho, H., Campbell, J. K., Dufour, Y. S., Stevens, A. M., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chemostat+for+experiments+with+bacterial+and+yeast+cells.">A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells.</a> Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).</li><li>Brauer, M. J., Botstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Adjustment+and+Metabolic+Remodeling+in+Glucose-limited+Yeast+Cultures.">Homeostatic Adjustment and Metabolic Remodeling in Glucose-limited Yeast Cultures.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 2503-2517 (2005).</li><li>Torres, E. M., Amon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aneuploidy+on+Cellular+Physiology+and+Cell+Division+in+Haploid+Yeast.">Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast.</a> Science. 317, 916-924 (2007).</li><li>Regenberg, B., Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-rate+regulated+genes+have+profound+impact+on+interpretation+of+transcriptome+profiling+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Biology. 7, R107 (2006).</li><li>Castrillo, J. I., Oliver, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control+of+the+eukaryote+cell:+a+systems+biology+study+in+yeast.">Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast.</a> Journal of Biology. 6, 4 (2007).</li><li>Brauer, M. J., Botstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).</li><li>Ferenci, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+physiology,+regulation+and+mutational+adaptation+in+a+chemostat+environment.">Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment.</a> Adv. Microb. Physiol. 53, 169-229 (2008).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Kemostat dyrkning i ministats, som med enhver kemostat, kræver opmærksomhed for detaljer og fejlfinding. Da forureningen er af stor bekymring i kontinuerlig kultur eksperimenter, vi typisk ser via mikroskop for bakteriel og svampeangreb ved podning og hver 50 generationer under langsigtede udvikling eksperimenter. Til dato har vi ikke observeret forurening på tværs af 96 evolution eksperimenter på mere end 300 generationer (data ikke vist). For at teste for krydskontaminering mellem ministats og potentialet for mikrober at kolonisere dyrkningskammeret via afgangsledningen vi løb 16 ministats sådan at hver anden ministat blev podet med gær som ovenfor, og resten blev ikke inokuleret med en kultur. Kulturerne blev opsamles i en fælles affaldsbeholder, som blev tømt hver anden dag. Så hvis det var muligt for forurenende stoffer at komme ind gennem den udstrømmende linje, vi sandsynligvis ville have observeret, at i dette experiment. I løbet af tre uger og mere end 100 generationer af vækst i dette skakbrætmønster af podede og ikke-podede kulturer vi ikke observerer vækst i ikke-inokulerede ministat dyrkningsrør, hvilket tyder på, at forurening udefra gær eller andre mikroorganismer er usandsynlig i eksperimenter lignende tidsrammer. Selvom ministats var designet til at fungere på en måde analog med kommercielle kemostater, den modulære beskaffenhed af dette arrangement giver mulighed for optimering til at passe brugernes behov og budget. Den peristaltiske pumpe, der anvendes i denne protokol kan opnå strømningshastigheder mellem 0,0186 vol / time til 3,6 vol / t. (data ikke vist). Øget kontrol med fortynding satser kunne opnås med alternative pumpemodeller. Bemærk, at drift ved lavere fortynding rater kan kræve substitution af en højere gauge nål for at opnå den samme frekvens af små dråber levering. Befolkningens størrelse er en vigtig overvejelse for korrekt udformning af evolution eksperimenter.Den normale fortyndingsforhold og næringsstofkoncentrationen anvendes her tilvejebringer en relativ stor population størrelse (~ 10 9 celler) af samme størrelsesorden som offentliggjorte evolution undersøgelser. 11 større eller mindre populationer kunne opretholdes ved at ændre arbejdsvolumen eller begrænsende næringsstof koncentration. Øget mutation forsyning kunne også opnås ved at arbejde med stammer med forhøjede mutationsrater. De ministats kunne også forbedres i løbet af vores nuværende design. For eksempel kondensation kan samle sig på kultur rørvæggene og kan reduceres betydeligt ved at anvende en dyb vandbad, inkubator eller konstant temperatur. Selv klumpning og væg vækst i sulfat begrænsede kulturer synes at være forholdsvis sjældne, optræder i 5/48 evolution eksperimenter med 300 generationer (data ikke vist), en række overfladeaktive midler er tilgængelige, der kan hjælpe til faldende eller forsinke dette træk. I tilfælde af at sammenklumpning interfererer med passende kulturblanding, forøget omrøring kan opnås ved at reducere antallet af måder hver luftpumpen er opdelt, eller ved tilsætning af et omrøringsapparat. Yderligere prober for opløst gas koncentration, pH eller andre parametre kan også medtages, som i nogle andre designs. 17 Trods de potentielle ændringer, under anvendelse af de ministats som beskrevet i denne protokol vi observeret meget konsekvente eksperimentelle parametre og reproducerbare resultater, når man sammenligner vores enhed til indberettede data for større volumen kommercielle kemostater. Dette omfattede reproducerbarhed af cellulær fysiologi set gennem nå steady-state ligevægt inden for 10-15 generationer (figur 2A) og opnåelse af tilsvarende kultur densiteter ved ligevægt. Genekspressionsmønstre var konsekvente i alle tre biologiske replikerer i ministats og mellem ministats og kommercielle stor volumen platforme (figur 2B), med undtagelse af jern-metabolisme gener. Disse expression forskelle sandsynligvis forårsaget af ændringer i metalindhold af de to enheder eller forbedringer i kvaliteten af ​​medierne ingredienser. Vore data antyder, at ministats vil være nyttig for fysiologi eller konkurrence eksperimenter, hvor et ensartet miljø er påkrævet. For at teste om ministat design er tilstrækkelig til eksperimentelle evolution ansøgninger, vi udviklede kulturer under sulfat begrænsning for 250 generationer og brugte CGH at karakterisere forstærkning på SUL1 locus -. Kendetegnende for langsigtet udvikling under disse betingelser i større volumen kemostater 10 Vi observerede amplifikation af SUL1 i kloner fra 4/4 uafhængige evolution eksperimenter i sulfat-begrænset medium (figur 2C). Taget som helhed disse data, at ministats er en robust platform, som kan være anvendelige til en række traditionelle kemostat applikationer. Selvom vi demonstreret deres anvendelse i dyrkning spirende gær, de ministats børogså være forenelige med andre organismer og lignende designs er i virkeligheden blevet brugt til dyrkning af bakterier og andre gær arter. 16,17,25 Endvidere mindre kultur volumen og korreleret nedsat behov for medier kan gøre ministats et attraktivt alternativ for eksperimenter, der kræver dyrt eller eksotiske reagenser som kan være tilfældet i kemiske eller genetiske skærme.

Dynamikken i mikrobiel vækst og udvikling er afgørende for mikrobiologi, økologi, genetik og bioteknologi. Den mest almindelige fremgangsmåde til dyrkning af mikroorganismer er i batch, hvor celler podes ved lav tæthed i næringsrigt medium og dyrket til mætning. Selvom ligetil at udføre med standard laboratorieudstyr, oplever batchkulturer en svingende kemisk miljø og tilsvarende skiftende cellulær fysiologi. Denne heterogene vækstmiljø kan resultere i sekundære vækst og stress effekter, som kan maskere subtile fysiologiske forskelle. Eksperimentel udvikling ved seriel batch overførsel kan vælge for komplekse blandinger af vækst-fase-specifikke subpopulationer, komplicerer forsøg på at forbinde tilpasninger til de særlige selektive betingelser. Måling af kvantitative fænotyper kan være vanskelig på grund af støj fra upræcis prøve timingen og variationen i funktioner såsom halter tid. Kontinuerlige kulturer et alternativvækst ordning, hvor celler kan reproducerbart dyrket i et kemisk homogent miljø ved en defineret væksthastighed at opnå en fysiologisk steady state. På grund af disse fordele, ofte studier af eksperimentel udvikling og karakterisering af cellulær tilstand anvender et kontrolleret miljø på kontinuerte kulturer som kemostat. 14 Vurdering af disse fordele har ført til en genopblussen interesse for kemostat kulturer. 15 Da de blev indført i 1950, har 1,2 kemostat systemer blevet udviklet til at fungere på forskellige skalaer i området fra l til mikroliter, og for en række anvendelser. 16 -19 Disse forskellige designs, der spænder fra kommercielt produceret bioreaktorer til glassblown fartøjer til brugerdefinerede MicroFluidics platforme, deler de generelle designprincipper. En kultur kammer omrøres og beluftes (normalt ved at boble luft igennem det), og mikrober indeholdt deri holdes homogenly dispergeret i dyrkningskammeret på alle tidspunkter. Frisk medium med defineret sammensætning tilsættes kontinuerligt og af tilsætningshastigheden styrer vækst og påvirker det kemiske miljø, der opleves af kulturen. Et overløb sætter kulturen volumen i væksten røret, og gennem dette overflow kulturen vil blive udtaget ved samme hastighed, hvormed frisk medium kommer ind. På denne måde kulturer hurtigt nå en fysiologisk ligevægtstilstand, hvor mange biologiske parametre forbliver konstante. Trods fordelene ved kemostater og rapporter fra disse forskellige platforme i litteraturen, er omfattende vedtagelse været begrænset af problemer med at bygge og drive disse systemer, og høje omkostninger, der er forbundet med kommercielle muligheder. Derudover beskrivelser af, hvordan man fremstiller og anvender disse enheder kan være uigennemsigtig. Vi præsenterer designs og instruktioner til brug af et lille fodaftryk vifte af miniature kemostater bygget af let tilgængelige dele til en lav pris. Vi obsErve yderst konsekvente eksperimentelle parametre og reproducerbare resultater, når man sammenligner vores enhed til indberettede data for gær dyrket i større mængder kommercielle bioreaktorer. Dette omfatter reproducerbarhed af cellulær fysiologi set gennem nå steady-state ligevægt inden for 10-15 generationer, og få lignende kultur tætheder ved ligevægt. Derudover genekspression mønstre er overensstemmelse mellem ministats og en kommerciel større volumen platform. Stabilitet af fortyndingshastighed, optisk tæthed og reproducerbarhed af genekspression mellem tre gentagne kulturer viser robustheden af ​​vores platform. Vi viser også, at de samme adaptive mutationer opstår i forhold til lignende eksperimentelle evolution tidsskalaer som med større volumen kemostater.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfrit) </td></tr><tr><td> 3/32 &quot;x 7/32&quot; siliconeslange </td><td> VWR </td><td> 63009-260 </td><td> Tubing: Bestil: (50 &#39;spole pack) </td></tr><tr><td> 1/2 &quot;x 5/8&quot; siliconerør (ekstra stor) </td><td> VWR </td><td> 63009-299 </td><td> Tubing: Bestil: (50 &#39;spole pack) </td></tr><tr><td> 1/4 &quot;x 3/8&quot; siliconerør (medium) </td><td> VWR </td><td> 63009-279 </td><td> Tubing: Bestil: (50 &#39;spole pack) </td></tr><tr><td> Orange green Marprene pumpeslange </td><td> Watson-Marlow </td><td> 978.0038.00 + </td><td> Tubing: Order: 6x (pakke med 6) </td></tr><tr><td> Hunlueren, 1/8 &quot;barb </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45500-04 </td><td> Stik: Bestil: 4x (pakke med 25) </td></tr><tr><td> Luer lock, 1/8 &quot;barb </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45503-04 </td><td> Stik: Bestil: 1x (pakke med 25) </td></tr><tr><td> Reducere konnektor, &quot;til 1/8&quot; PVDF, 1/4 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30703-50 </td><td> Stik: Bestil: 1x (pakke med 10) </td></tr><tr><td> Barbed Y-stik, 1/8 &quot;ID </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-30703-92 </td><td> Stik: Bestil: 3x (pakke med 10) </td></tr><tr><td> Medium slangeklemmer </td><td> VWR </td><td> 63022-405 </td><td> Clamps: Bestil: 1x (pakke med 12) </td></tr><tr><td> Dag Pinchcock (metalbøjle til slanger) </td><td> VWR </td><td> 21730-001 </td><td> Clamps: Bestil: 1x (pakke med 10) </td></tr><tr><td> Mand inline ventiladapteren quick-stik, passer slange: 1/4 in </td><td> Fisher </td><td> 05-112-39 </td><td> Stik: Bestil: 1x (pakke med 25) </td></tr><tr><td> Kvinde inline ventiladapteren hurtig-stik, passer slange: 1/4 in ID, polypropylen </td><td> Fisher </td><td> 05-112-37 </td><td> Stik: Bestil: 1x (pakke med 5) </td></tr><tr><td> Silent luftpumper </td><td> <a href="http://www.aquariumguys.com/" target="_blank">Aquarium Guys.com</a> </td><td> 212.422 </td><td> Lufttilførsel: Bestil: 4 pumper </td></tr><tr><td> PTFE filtre, 0,45 um, til luftfiltrering </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-02915-22 </td><td> Lufttilførsel: Bestil: 1x (æske med 100) </td></tr><tr><td> 1L kolbe med sidearm </td><td> Fisher </td><td> 10-181F </td><td> Lufttilførsel: Bestil: 2x (Pack of 6) </td></tr><tr><td> # 8 silicone prop, 3/8 i hul, for sidearm kolber </td><td> Fisher </td><td> K953715-0801 </td><td> Lufttilførsel: Bestil: 8 propper </td></tr><tr><td> 4-Port manifold </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06464-85 </td><td> Lufttilførsel: Bestil: 8 manifolder </td></tr><tr><td> 55 ml skruelåg dyrkningsrør </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 9825-25 </td><td> Kultur Chamber: Bestil: 2x (pakke med 48) </td></tr><tr><td> Regelmæssig hypodermisk hvid hub nål, 16G, 5 in længde for udløbslinie </td&gt; <td> Fisher </td><td> 14-817-105 </td><td> Kultur Chamber: Bestil: 1x (pakke med 100) </td></tr><tr><td> Spinal tap nål </td><td> VWR </td><td> BD40836 </td><td> Kultur Chamber: Bestil: 4x (pakke med 10) </td></tr><tr><td> Regelmæssig hypodermisk lyserød nål </td><td> Fisher </td><td> 14-817-104 </td><td> Kultur Chamber: Bestil: 1x (pakke med 100) </td></tr><tr><td> Skum Silicone prop størrelse &quot;2&quot;, pink </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-06 </td><td> Kultur Chamber: Bestil: 2x (pakke med 20) </td></tr><tr><td> 8-Well rør Rack </td><td> VWR </td><td> 82024-452 </td><td> Kultur Chamber: Bestil: 4 reoler </td></tr><tr><td> 10L Reservoir flaske med bund slange afgangsåbning: vacuum pengeskab </td><td> VWR </td><td> 89001-530 </td><td> Medie: Ordre: 2 eller flere </td></tr><tr><td> Gult skum silikone prop, ikke-standard størrelse 12 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-22 </td><td> Medie: Ordre: 2 eller flere </td></tr><tr><td> Ballon Udluftning Filter </td><td> Fisher </td><td> SLFG 050 10 </td><td> Medie: Ordre: 1x (pakke med 10) </td></tr><tr><td> Tape, grøn </td><td> <a href="http://Amazon.com" target="_blank">Amazon.com</a> </td><td> 10851-BA-10 </td><td> Medier: Bestil 1 rulle. </td></tr><tr><td> Flasketoppen filter, 1L, 0,2 um, 45 mm </td><td> VWR </td><td> 29442-978 </td><td> Medie: Bestil: (1 tilfælde af 12) </td></tr><tr><td> 5000 ml Reservoir flaske med bundudløb: Vacuum sikker </td><td> VWR </td><td> 89003-384 </td><td> Medier: (Valgfri) </td></tr><tr><td> Blå Foam Silikone prop, nonstandardsize 10 1/2 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-18 </td><td> Medier: (Valgfri) </td></tr><tr><td> 205S/CA16, 16 Cartridge pumpe </td><td> Watson-Marlow </td><td> 020.3716.00A </td><td> Medier Pumpe: Bestil: 1 </td></tr><tr><td> 16-kanals 205CA Extension pumpehoved </td><td> Watson-Marlow </td><td> 023.1401.000 </td><td> Medier Pumpe: Bestil: 2 Udvidelse pumpehoveder </td></tr><tr><td> Silicone akvarium sealer </td><td> Fisher </td><td> S18180B </td><td> Medier Pumpe: Bestil: 1 </td></tr><tr><td> 6-blok tør bath </td><td> VWR </td><td> 12.621-120 </td><td> Heatblock: Bestil: 2 for 32 ministats eller 1 til 16. </td></tr><tr><td> Block for drybath, 6 x 25 mm reagensglas pr blok </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Bestil: 12 til 32 ministats eller 6 til 16. </td></tr><tr><td> Nylonmembran Filtre, 0,45 um porestørrelse, Dia: 25 mm. </td><td> Fisher </td><td> R04SP02500 </td><td> Høst: Bestil: 1x (pakke med 100) (valgfrit) </td></tr><tr><td> Nylonmembran Filtre, 0,45 um porestørrelse, 45 mm </td><td> Fisher </td><td> R04SP04700 </td><td> Høst: Bestil: 1x (pakke med 100) (valgfrit) </td></tr><tr><td> 47 mm, stort filterapparat </td><td> Fisher </td><td> XX10 047 30 </td><td> Høst: Bestil: 1 (valgfri) </td></tr><tr><td> Glass filterholder, 25 mm, lille filter apparater </td><td> VWR </td><td> 26316-692 </td><td> Høst: Bestil: 1 (valgfri) </td></tr><tr><td> Dewarkar, 1L for flydende nitrogen </td><td> VWR </td><td> 63380-052 </td><td> Høst: Bestil: 1 (valgfri) </td></tr></tbody></table>

design and use of multiplexed chemostat arrays

Kemostater er kontinuerlige kultur systemer, hvor cellerne dyrkes i et stramt kontrolleret, kemisk konstant miljø, hvor kultur tæthed er begrænset ved at begrænse specifikke næringsstoffer. 1,2 Data fra kemostater er særdeles reproducerbar til måling af kvantitative fænotyper, da de giver en konstant vækstrate og miljø ved steady state. Af disse grunde har kemostater blevet nyttige redskaber for finskala-karakterisering af fysiologi gennem analyse af genekspression 3-6 og andre egenskaber ved kulturer ved steady state ligevægt. 7 Langsigtede eksperimenter i kemostater kan fremhæve bestemte baner at mikrobielle populationer udsteder under adaptive evolution i et kontrolleret miljø. Faktisk har kemostater været anvendt til eksperimentel udvikling, siden deres opfindelse. 8 En fælles resulterer i udviklingen eksperimenter er for hvert biologisk replikat at opnå et unikt repertoire af mutationer. 9-13 Denne mangfoldighed antyder, at der er meget tilbage at blive opdaget ved at udføre evolution eksperimenter med langt større gennemløb. Vi præsenterer her for konstruktion og drift af en relativt simpel, billig vifte af miniature kemostater-eller ministats-og validere deres anvendelse i bestemmelse af fysiologi og i evolution eksperimenter med gær. Denne fremgangsmåde indebærer vækst af snesevis af kemostater løbe en enkelt multiplex peristaltisk pumpe. Kulturerne holdes ved en 20 ml arbejdsvolumen, der er praktisk for en lang række applikationer. Det er vores håb, at stigende gennemløb, faldende omkostninger, og give detaljerede bygge-og driftsvejledning også kan motivere forskning og industriel anvendelse af dette design som en generel platform for funktionelt karakterisering et stort antal stammer, arter og vækstparametre, samt genetisk eller lægemiddel-biblioteker.

The ministat matrix beskrevet ovenfor og i (figur 1A, B) blev anvendt til dyrkning af en haploid MATa laboratoriestamme af spirende gær (S288C) under sulfat-begrænsende betingelser som beskrevet tidligere. 10. Vi testede effektiviteten for almindelige kemostat anvendelser, herunder bestemmelse af fysiologi og eksperimentel udvikling. At validere ministats, vi gentages flere forsøg tidligere er udført i industrielle fermentorer modificeret til kemostat brug. 10,20,21 ATR Sixfors fermentorer blev kørt ved en 300 ml arbejdsvolumen, over ti gange volumenet af de ministats, og har betydeligt forskellige tilstande af kultur beluftning og omrøring. Vi forsøgte at replikere udstyr stabilitet, steady state fysiologi, eksperimentelle udvikling skyldes, og genekspression mønstre opnået med disse fermentorer. Da ensartethed fortyndingshastighed og beluftning er vigtige aspekter af kemostat design, vi migasured den faktiske fortyndingsforhold i 32 ministats efter 15 generationers vækst og fundet, at med et mål fortynding på 0,17 vol / time (4-5 dråber / min) opnåede vi en gennemsnitlig fortynding på 0,17208 med en standardafvigelse på 0,0075 over 32 replikater. Dette interval var inden for vores typiske tolerance på + / -0,01 vol / timers forskel fra målfastsættelse, ud over hvilken store ændringer i genekspression er blevet observeret. 22-23 Across 4 ministats luftmængden blev bestemt til at være 307,5 ​​ml / min med en standardafvigelse på 9,57 ml / min. Dette antyder, at luftstrømmen ind i kamrene er robust og ligeligt fordelt mellem de fire kamre og er en værdi svarende til den beskrevet for beluftning i industrielle fermentorer. 20 Vi har tidligere observerede tilbagevendende amplifikation af høj affinitet svovl-ion transporter SUL1 i 8/8 sulfat-begrænset evolution eksperimenter i gær. 10 I betragtning af ensartede resultater under this tilstand valgte vi sulfat-begrænsning for at teste vores system evne. Et nødvendige element af kemostatkultur er behovet for at opretholde en konstant kemisk miljø. Udsving i overflod af et begrænsende næringsstof eller andre ændringer i det miljø typisk resultere i en ændring i antallet af celler i en given kultur. Vi målte optisk tæthed som en proxy for celleantal (fig. 2A) og målte reproducerbarhed hele 16 gentagne kulturer, finde en gennemsnitlig A600 af 1,12 (~ 10 9 celler) efter ~ 15 generationer af vækst med en standardafvigelse på 0,057 enheder, eller 5,1 %. Til sammenligning viste målinger taget fra 4 gentagne kulturer dyrket i de industrielle fermentorer en standardafvigelse på 2,5%. Celler var godt blandet i vækstkammeret: målinger af OD og celletal taget fra effluenten spor svarede til prøver taget direkte fra dyrkningsrør (data ikke vist). Disse resultater viser robustheden af ​​vores platform end evne til at opretholde en konstant kemisk miljø i en tilsvarende tolerance med den industrielle fermentor. Som en mere følsom udlæsning af fysiologi sammenlignede vi genom-dækkende steady state genekspression fra kulturer dyrket under sulfat begrænsning i ministats og i den industrielle fermentor. Genekspression i ministats viste en høj grad af lighed på tværs af tre biologiske replikater (figur 2B). Vi har tidligere bemærket, at for RNA afledt fra to gentagne Sixfors kemostater og co-hybridiseret til et mikroarray, ekspression af 99% af gener faldt inden for et 1,5-ganges område, der tillader anvendelse af 1,5 X som en empirisk betydning cutoff. 21 Genekspression fra tredobbelte ministats, sammenlignet parvise, viste 99% af gener faldt inden for et 1,5-1,7 fold interval, kan sammenlignes med resultaterne fra de industrielle fermentorer. De tre prøver blev hybridiseret til individuelle arrays og de parvise nøgletal beregnet efterfølgende, så disse vaLues indbefatter inter-array-støj ud over biologisk støj, potentielt overvurderet variation mellem replikater i sammenligning med de publicerede, co-hybridiserede resultater. 138 gener blev differentielt udtrykte&gt; 1,5-fold i alle tre ministat replikater sammenlignet med en prøve indsamlet fra et matchet kultur dyrket i den industrielle fermentor. Gener faldt i udtryk i ministats var stærkt beriget med jern metabolisme. Denne signatur kan afspejle de forskellige metal sammensætning af hver enhed konfiguration: den Sixfors apparat omfatter en metal løbehjul og beluftning samling nedsænket i kulturen, og medierne dunke tidligere anvendte også påkrævet metal hardware. The ministat anvender rustfrit stål nåle, men ingen andre metalkomponenter. Gener med forøget ekspression i høj grad var associeret med cellemembraner, selv om den biologiske betydning af denne association er uklar. Endelig testede vi eksperimentel evolution under disse betingelser. Efter 250 generationer af sulfat-begrænset vækst, viste 4/4 kloner testet fra 4 uafhængige udviklende populationer amplifikation af SUL1 som påvist ved array komparativ genomisk hybridisering (CGH, figur 2C). Dette resultat er i overensstemmelse med resultater større volumen kemostater forhold til lignende tidsintervaller. 10 <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1.jpg" alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1highres.jpg"/> Fig. 1. A. Konstruktion og arrangementet af ministat arrayet. B. Design af dyrkningskammeret. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2.jpg" alt="Figur 2" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2highres.jpg"/> Figur 2. A. Experimental der viser, at kulturerne når ligevægt inden for ti generationer af vækst (n = 16). B. Ekspression data for tre biologiske replikater S1-3 samplet under stabil under sulfat begrænsning i forhold til en fælles reference dyrket i et matchet sulfat-begrænset Sixfors kemostat . C. SUL1 amplifikationer genfundet i ministats efter 250 generationer af vækst i en sulfat-begrænset miljø. Genomisk DNA fra hver udviklet klon blev sammenlignet med nedarvet DNA ved CGH som beskrevet. 21 Mean kopital blev beregnet for hver amplificerede region og er vist ved siden af hver amplikon. Alle microarray data er deponeret i GEO-databasen under tiltrædelsen GSE36691. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50262/50262fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays at JoVE.com

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Vi udviklet og valideret en lille fodaftryk vifte af miniature kemostater bygget af let tilgængelige dele til en lav pris. Fysiologiske og eksperimentel udvikling skyldes svarede til større volumen kemostater. Den ministat arrayet giver en kompakt, billig og tilgængelig platform for traditionelle kemostat eksperimenter, funktionelle genomics og kemiske screening applikationer.

Design og brug af multiplekset kemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays MEAs

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kortlægning Bakterielle Funktionelle Networks og spredningsveje i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Hjælp Syntetiske Genetiske Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

Fremstilling og anvendelse af mikromiljø microarrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Montering af nukleosomal Arrays fra rekombinant Core Histoner og nukleosom Positioning DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design og analyse af temperaturpræferenceadfærd og dens døgnrytme i Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Identifikation af protein-protein-interaktion websteder anvendelse af peptid Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...