Name: design and use of multiplexed chemostat arrays
Uploaded: 2013-02-23T00:00:00
Duration: 19 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays at JoVE.com

Oprichting van de video werd ondersteund door subsidies van de National Center for Research Resources (5P41RR011823-17) en het Nationaal Instituut van Algemene Medische Wetenschappen (8 P41 GM103533-17) van de National Institutes of Health. Dit werk werd ondersteund door NSF subsidie ​​1120425. MJD is een Rita Allen Stichting Scholar. AWM wordt gedeeltelijk ondersteund door NIH T32 HG00035. Wij danken Anna Sunshine voor hulp bij het verbeteren van protocollen. Daarnaast hebben we erkennen Sara DiRienzi, Celia Payen, en Amy Sirr als vroege gebruikers van de ministats.

Gebruik de juiste steriele techniek in heel het protocol. 1. Montage Onderdelen voor en voorbereiden van de Ministat Array <ol><li> Bestel alle onderdelen. </li><li> Reinig glazen buizen. Mark buizen bij 20 ml volume. </li><li> Maak kurk assemblages met lucht, media, en effluent havens en plaats ze op de top van de gereinigde glazen cultuur buizen. </li><li> Bereid bevochtigen kamers en regelen alle niet-geautoclaveerd delen. </li><li> Maak de lucht, afvalwater, en de media slangen met voldoende buizen lengtes en compatibele koppelingen. </li><li> Sluit elk type buis (lucht, media, en effluent) om de kurk vergaderingen en folie filters en de media snel verbinding te maken met hen voor te bereiden voor de autoclaaf. </li><li> Bereid een mandfles voor het maken van steriel chemostaat medium. </li><li> Bereid de cultuur bemonstering flessen door het invoegen van een twee-holes rubberen stop met de juiste accessoires. Folie elk filter om hen voor te bereiden op de autoclaaf. </li><li> Fit de gemonteerde reeks netjes in een of meer autoclaaf trays en autoclaveren alle onderdelen. </li><li> Maak en filteren chemostaat media in geautoclaveerd mandfles bevinden. </li></ol> 2. Een experiment instellen <ol><li> Vul elke hydratatie fles met 700 ml ddH 2 O. </li><li> Plaats de geautoclaveerde ministats in het verwarmingsblok ingesteld op de gewenste temperatuur. </li><li> Plaats de luchtvaartmaatschappijen in de 4-poorts verdeelblok en zet de luchtpomp. </li><li> Sluit het effluent lijnen naar de 100 ml collectie flessen. </li><li> Verwijder de folie van het uiteinde van de media buizen en media mandfles en verbind de twee snelle verbinding. Rijg elke lengte van de pomp slang door een peristaltische pomp cartridge en klik ze op hun plaats. Zet de pomp media. </li><li> Laat de kamers te vullen. Zet de media pomp. </li><li> Spuit de kurk samenstellingen met 70% ethanol en enten de culturen met behulp van een injectiespuit. Sla een monster van het inoculum als een bevroren glycerolvoorraadindien gewenst. Laat culturen groeien gedurende 30 uur. </li><li> Stel de hoogte van het effluent naald tot de cultuur volume is ingesteld op 20 ml met de luchtstroom uitgeschakeld. Dit kan enkele aanpassingen in de loop van een uur. Wanneer u klaar bent zet u de luchtstroom weer aan. </li><li> Zet de media pomp. </li><li> Leeg het effluent bemonstering flessen, die bevatten media verzameld tijdens het instellen van de werkcultuur volume, en noteer de tijd. </li><li> Om een ​​time-nulmeting plaatsvinden het effluent lijnen in steriele verzameling buizen gedurende 15 min-2 uur (afhankelijk van wat u het volume wilt proeven voor DNA-analyse). Maak ook een glycerol ingevroren voorraad voor elke cultuur op dit moment, indien gewenst. </li></ol> 3. Dagelijkse metingen <ol><li> Net als bij uw time-nulmeting, monster op ijs gedurende 15 minuten-2 uur (zoals vereist voor uw experiment) op ijs en om de tijd bemonsterd voor DNA en bevroren voorraad monsters. </li><li> Voor RNA-monsters hetzij bij een klein volumeUME met een spuit en 22G 5 &quot;naald uit de cultuur of uncork elk Ministat de gehele cultuur oogsten. monsters moeten snel worden, afgefiltreerd, en direct ingevroren in vloeibare stikstof. </li><li> Meet het uitstromende water dat sinds de laatste bemonstering voor elke Ministat om verdunning te kwantificeren. Stel verdunning, indien nodig door het verstellen van de pomp instelling of het tunen van de geldboete aan te passen op individuele pomp lijnen. </li><li> Vervang effluent lijnen in lege verzameling flessen. </li><li> Kwantificeren cellen / ml en andere eindpunten plaats en een glycerol ingevroren voorraad. </li></ol> 4. Post-experiment Cleanup <ol><li> Plaats alle slangen in aparte bakjes en spoel overmatig met ddH 2 O. Droge buis met een aquarium pomp. </li><li> Reinig de kurk samenstellingen met ddH 2 O en het gebruik van naald om de naalden te reinigen, opzuigen en doseren water op zijn beurt. Veeg de buitenkant van de naalden en kurk aan een te verwijderenresiduele media. </li><li> Reinig de glazen buizen met water en ethanol, en verwijder fysieke verontreinigingen met 3 gebald Kimwipes en tang. </li><li> Spoel en droog weer alle onderdelen voor gebruik. </li></ol>

<ol>
	<li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R&#233;cherches+sur+la+Croissance+des+Cultures+Bacteriennes.">R&#233;cherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes.</a> Ann. I. Pasteur. 79, 390-410 (1950).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+the+chemostat.">Description of the chemostat.</a> Science. 15, 715-716 (1950).</li><li>Daran-Lapujade, P., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., de Winde, J. H., Pronk, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemostat-based+micro-array+analysis+in+baker's+yeast.">Chemostat-based micro-array analysis in baker's yeast.</a> Adv. Microb. Physiol. 54, 257-311 (2009).</li><li>ter Linde, J. J. M., Pronk, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transcriptional+analysis+of+aerobic+and+anaerobic+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 181, 7409-7413 (1999).</li><li>Boer, V., de Winde, J., Pronk, J., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome-wide+transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisiae+grown+on+glucose+in+aerobic+chemostat+cultures+limited+for+carbon,+nitrogen,+phosphorus,+or+sulfur.">The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur.</a> J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).</li><li>Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K., Oliver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+nutrient+control+of+gene+expression+in+Saccharomyces+cerevisiae+during+growth+and+starvation.">Global analysis of nutrient control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae during growth and starvation.</a> 101, 3148-3153 (2004).</li><li>Diderich, J. A., Kruckeberg, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Uptake+Kinetics+and+Transcription+of+HXT+Genes+in+Chemostat+Cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Glucose Uptake Kinetics and Transcription of HXT Genes in Chemostat Cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 274, 15350-15359 (1999).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria.">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).</li><li>Kubitschek, H. E., Bendigkeit, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+continuous+cultures.+I.+Dependence+of+mutational+response+upon+growth-limiting+factors.">Mutation in continuous cultures. I. Dependence of mutational response upon growth-limiting factors.</a> Mutation Res. 1, 113-120 (1964).</li><li>Gresham, D., Dunham, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+and+Dynamics+of+Evolutionary+Adaptations+to+Controlled+Nutrient-Limited+Environments+in+Yeast.">The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast.</a> PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).</li><li>Kao, K. C., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+clonal+interference+during+adaptive+evolution+in+asexual+populations+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).</li><li>Kvitek, D. J., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Sign+Epistasis+between+Frequently+Experimentally+Evolved+Adaptive+Mutations+Causes+a+Rugged+Fitness+Landscape.">Reciprocal Sign Epistasis between Frequently Experimentally Evolved Adaptive Mutations Causes a Rugged Fitness Landscape.</a> PLoS Genet. 7, e1002056 (2011).</li><li>Helling, R. B., Adams, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+during+Growth+in+a+Constant+Environment.">Evolution of Escherichia coli during Growth in a Constant Environment.</a> Genetics. 116, 349-358 (1987).</li><li>Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Evolution+in+Yeast:+A+Practical+Guide.">Experimental Evolution in Yeast: A Practical Guide.</a> Methods Enzymol. 470, (2010).</li><li>Hoskisson, P. A., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+-+making+a+comeback.">Continuous culture - making a comeback.</a> Microbiology. 151, 3153-3159 (2005).</li><li>Nanchen, A., Schicker, A., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+dependency+of+intracellular+fluxes+on+growth+rate+in+miniaturized+continuous+cultures+of+Escherichia+coli.">Nonlinear dependency of intracellular fluxes on growth rate in miniaturized continuous cultures of Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 1164-1172 (2006).</li><li>Klein, T., Schneider, K., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+miniaturized+stirred+bioreactors+for+parallel+continuous+cultivation+of+yeast+with+online+measurement+of+dissolved+oxygen+and+off-gas.">A system of miniaturized stirred bioreactors for parallel continuous cultivation of yeast with online measurement of dissolved oxygen and off-gas.</a> Biotechnol. and bioeng. , (2012).</li><li>Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+bacteria+undergoing+programmed+population+control+in+a+microchemostat.">Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat.</a> Science. 309, 137-140 (2005).</li><li>Groisman, A., Lobo, C., Cho, H., Campbell, J. K., Dufour, Y. S., Stevens, A. M., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chemostat+for+experiments+with+bacterial+and+yeast+cells.">A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells.</a> Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).</li><li>Brauer, M. J., Botstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Adjustment+and+Metabolic+Remodeling+in+Glucose-limited+Yeast+Cultures.">Homeostatic Adjustment and Metabolic Remodeling in Glucose-limited Yeast Cultures.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 2503-2517 (2005).</li><li>Torres, E. M., Amon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aneuploidy+on+Cellular+Physiology+and+Cell+Division+in+Haploid+Yeast.">Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast.</a> Science. 317, 916-924 (2007).</li><li>Regenberg, B., Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-rate+regulated+genes+have+profound+impact+on+interpretation+of+transcriptome+profiling+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Biology. 7, R107 (2006).</li><li>Castrillo, J. I., Oliver, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control+of+the+eukaryote+cell:+a+systems+biology+study+in+yeast.">Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast.</a> Journal of Biology. 6, 4 (2007).</li><li>Brauer, M. J., Botstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).</li><li>Ferenci, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+physiology,+regulation+and+mutational+adaptation+in+a+chemostat+environment.">Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment.</a> Adv. Microb. Physiol. 53, 169-229 (2008).</li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Chemostaat teelt in de ministats, net als bij elke chemostaat, vereist aandacht voor detail en trouble shooting. Omdat besmetting is van groot belang in continue cultuur experimenten hebben we gewoonlijk op zoek via microscoop voor bacteriën en schimmels besmetting bij inoculatie en om de 50 generaties tijdens lange-termijn evolutie experimenten. Tot dusver zijn er geen verontreiniging in 96 experimenten ontwikkeling van meer dan 300 generaties (data niet getoond) waargenomen. Om te testen voor kruisbesmetting tussen ministats en het potentieel voor microben om de cultuur kamer koloniseren door middel van het effluent lijn liepen we 16 ministats zodanig dat elke andere Ministat werd geënt met gist, zoals hierboven en de rest waren niet ingeënt met elke cultuur. De kweken werden bemonsterd in een gemeenschappelijke afvalhouder, die geleegd om de andere dag. Dus als het mogelijk verontreinigingen te voeren via de afvoerleiding we waarschijnlijk zou hebben opgemerkt dat deze experiment. Gedurende drie weken en meer dan 100 generaties groei van deze schaakbordpatroon geënt en niet-geïnoculeerde kweken we zagen geen groei in niet-geïnoculeerde Ministat kweekbuizen, suggereert dat vervuiling van buitenaf gist of andere microben onwaarschijnlijk is in experimenten soortgelijke termijnen. Hoewel de ministats werden ontworpen om te werken op een manier analoog aan commerciële chemostaten, het modulaire karakter van deze regeling maakt het mogelijk om de optimalisatie naar passen bij de behoeften van de gebruikers en het budget. De slangenpomp in dit protocol kan bereiken debiet tussen 0,0186 vol / uur tot 3,6 vol / uur (data niet getoond). Verhoogde controle van verdunning kan worden bereikt met alternatieve pomp modellen. Merk op dat de werking bij lagere verdunning kan substitutie van een hoger gauge naald nodig hebben om dezelfde frequentie van de druppel levering te bereiken. Grootte van de populatie is een belangrijke overweging voor een goede vormgeving van evolutie experimenten.De standaard verdunning en voedingsconcentratie hier gebruikt een relatief grote populatie grootte (~ 10 9 cellen) van dezelfde orde van grootte als gepubliceerde studies evolutie 11. Grotere of kleinere populaties kan worden gehandhaafd door het veranderen van het werkvolume of beperking voedingsconcentratie. Verhoogde mutation aanbod kan ook worden verkregen door met stammen met verhoogde mutatiesnelheden. De ministats zou ook kunnen worden verbeterd ten opzichte van onze huidige ontwerp. Bijvoorbeeld kan condensatie te verzamelen over de cultuur buiswanden en kan sterk worden verminderd door een diepe waterbad, incubator of constante temperatuur. Hoewel klonteren en wand groei sulfaat beperkte culturen lijkt relatief zeldzaam, die in 5/48 evolutie experimenten met 300 generaties (data niet getoond), diverse oppervlakteactieve middelen zijn beschikbaar die kunnen helpen bij het verminderen of vertragen deze eigenschap. Indien klonteren interfereert met adequate cultuurmengen, roeren verhoogd kan worden bereikt door het aantal manieren elke luchtpomp verdeeld, of door toevoeging van een roerwerk. Extra probes voor opgeloste gasconcentratie, pH of andere parameters kunnen worden opgenomen, zoals in sommige andere ontwerpen 17. Ondanks mogelijke aanpassingen, met behulp van de ministats zoals beschreven in dit protocol, zagen we zeer consistent experimentele parameters en reproduceerbare resultaten bij het vergelijken van ons apparaat te gerapporteerde gegevens voor groter volume commerciële chemostaten. Dit omvatte reproduceerbaarheid van cellulaire fysiologie gezien door het bereiken van steady-state evenwicht binnen 10-15 generaties (Figuur 2A) en het verkrijgen van dezelfde cultuur dichtheden bij evenwicht. Genexpressie patronen consistent waren drie biologische repliceert in ministats en tussen ministats en commerciële groot volume platforms (Figuur 2B), met uitzondering van ijzer metabolisme genen. Deze expression verschillen worden waarschijnlijk veroorzaakt door veranderingen in de metalen inhoud van de twee apparaten of verbeteringen in de kwaliteit van de media ingrediënten. Onze gegevens suggereren dat ministats nuttig zal zijn voor physiology of competitie experimenten waarbij een consistente omgeving vereist. Om te testen of de Ministat ontwerp is voldoende voor experimentele evolutie toepassingen we culturen onder sulfaat beperking ontwikkeld voor 250 generaties CGH gebruikt om amplificatie karakteriseren de SUL1 locus -. Een kenmerk van langetermijnevolutie onder deze omstandigheden in grotere volume chemostaten 10 We waargenomen amplificatie van SUL1 in klonen van 4/4 onafhankelijke experimenten evolutie in sulfaat-beperkte media (figuur 2C). Het geheel genomen suggereren deze gegevens dat ministats een robuust platform die nuttig kunnen zijn voor een verscheidenheid van traditionele chemostaat toepassingen. Hoewel we demonstreerden hun gebruik in het kweken van gist, de ministats moetook compatibel met andere organismen en vergelijkbare ontwerpen daadwerkelijk zijn gebruikt voor het kweken van bacteriën en andere gistsoorten. 16,17,25 Bovendien kleinere cultuurvolume en gecorreleerd verminderde behoefte aan media kan ministats een aantrekkelijk alternatief voor experimenten die dure of exotische reagentia zoals het geval kan in chemische of genetische schermen.

De dynamiek van de microbiële groei en evolutie zijn fundamenteel voor microbiologie, ecologie, genetica en biotechnologie. De meest gebruikte methode voor het kweken van micro-organismen is in batch, waarbij cellen worden bij lage dichtheid geënt in voedselrijke bouillon en gekweekt tot verzadiging. Hoewel eenvoudig uit te voeren met behulp van standaard laboratoriumapparatuur, batch culturen te ervaren een fluctuerende chemische omgeving en dienovereenkomstig te veranderen cellulaire fysiologie. Deze heterogene groei-omgeving kan leiden tot secundaire groei en stress effecten die kunnen maskeren subtiele fysiologische verschillen. Experimentele evolutie door cascadeproeven overdracht kan selecteren voor complexe mengsels van de groei-fase specifieke subpopulaties, complicerende pogingen om aanpassingen te sluiten op specifieke selectieve omstandigheden. Meting van de kwantitatieve fenotypes kan moeilijk zijn als gevolg van lawaai van onnauwkeurige monster timing en variatie in functies zoals vertraging. Continu culturen een alternatiefgroei regime waar de cellen reproduceerbaar kunnen worden gekweekt in een chemisch homogene omgeving bij een bepaalde groeisnelheid een fysiologische steady state te bereiken. Vanwege deze voordelen studies van experimentele ontwikkeling en karakterisatie van cellulaire staat vaak gebruik de gecontroleerde omgeving van continue culturen zoals de chemostaat 14. Waardering van deze voordelen heeft geleid tot een hernieuwde interesse in chemostaat culturen. 15 Sinds de introductie in 1950 1,2 chemostaat systemen ontwikkeld om te functioneren op verschillende schaalniveaus, variërend van l tot microliter en voor verschillende toepassingen 16. -19 Deze verschillende ontwerpen, die variëren van commercieel geproduceerde bioreactoren te glassblown schepen om aangepaste microfluidics platforms, aandeel algemene ontwerpprincipes. Een cultuur kamer wordt geroerd en belucht (meestal door borrelen lucht doorheen) en de microben daarin worden bewaard homogenely verspreid de cultuur kamer te allen tijde. Vers medium gedefinieerde samenstelling wordt voortdurend toegevoegd en de snelheid van toevoeging regelt groeisnelheid en beïnvloedt de chemische omgeving ervaren de cultuur. Overloop wordt het kweekvolume in de groei buis en daardoor overflow de cultuur wordt bemonsterd dezelfde snelheid waarmee vers medium binnenkomt. Op deze manier culturen snel een fysiologische steady-state bij waar veel biologische parameters constant blijven. Ondanks de voordelen van chemostaten en verslagen van deze verschillende platformen in de literatuur, is brede invoering is beperkt door problemen bij het bouwen en exploiteren van deze systemen, en de hoge kosten die gepaard gaan met commerciële mogelijkheden. Verder beschrijvingen van hoe te maken en gebruik maken van deze apparaten kunnen ondoorzichtig te zijn. We stellen ontwerpen en gebruiksaanwijzing van een kleine footprint array van miniatuur chemostaten opgebouwd uit gemakkelijk verkrijgbare onderdelen tegen lage kosten. We obsErve zeer consistente experimentele parameters en reproduceerbare resultaten bij het vergelijken onze apparaat gerapporteerde gegevens voor gist gekweekt in grotere volume commerciële bioreactors. Dit geldt ook voor de reproduceerbaarheid van cellulaire fysiologie, gezien door het bereiken van de steady-state evenwicht binnen 10-15 generaties en het verkrijgen van soortgelijke cultuur dichtheden bij evenwicht. Bovendien genexpressiepatronen stroken tussen ministats en een commerciële groter volume platform. Stabiliteit van verdunning, optische dichtheid en de reproduceerbaarheid van genexpressie tussen drie gelijke culturen tonen de robuustheid van ons platform. We tonen ook aan dat dezelfde adaptieve mutaties ontstaan ​​ten opzichte van soortgelijke experimentele evolutie termijnen als bij groter volume chemostaten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> 3/32 &quot;x 7/32&quot; silicone pompslang </td><td> VWR </td><td> 63009-260 </td><td> Tubing: Bestellen: (50 &#39;coil pack) </td></tr><tr><td> 1/2 &quot;x 5/8&quot; silicone (extra groot) </td><td> VWR </td><td> 63009-299 </td><td> Tubing: Bestellen: (50 &#39;coil pack) </td></tr><tr><td> 1/4 &quot;x 3/8&quot; silicone (medium) </td><td> VWR </td><td> 63009-279 </td><td> Tubing: Bestellen: (50 &#39;coil pack) </td></tr><tr><td> Oranje groen Marprene pompslang </td><td> Watson-Marlow </td><td> 978.0038.00 + </td><td> Tubing: Oestellen: 6x (pak van 6) </td></tr><tr><td> Vrouwelijke luer, 1/8 &quot;barb </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45500-04 </td><td> Connectors: Bestellen: 4x (pak van 25) </td></tr><tr><td> Male luer lock, 1/8 &quot;barb </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45503-04 </td><td> Connectors: Bestellen: 1x (pak van 25) </td></tr><tr><td> Reductiestuk &quot;tot 1/8&quot; PVDF, 1/4 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30.703-50 </td><td> Connectors: Bestellen: 1x (pak van 10) </td></tr><tr><td> Prikkeldraad Y-connector, 1/8 &quot;ID </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-30703-92 </td><td> Connectors: Bestellen: 3x (pak van 10) </td></tr><tr><td> Medium slangklemmen </td><td> VWR </td><td> 63022-405 </td><td> Klemmen: Bestellen: 1x (pak van 12) </td></tr><tr><td> Dag Pinchcock (metalen klem voor buizen) </td><td> VWR </td><td> 21730-001 </td><td> Klemmen: Bestellen: 1x (pak van 10) </td></tr><tr><td> Man inline valved snelkoppeling, past slang: 1/4 inch </td><td> Visser </td><td> 05-112-39 </td><td> Connectors: Bestellen: 1x (pak van 25) </td></tr><tr><td> Vrouw inline valved snelkoppeling, past slang: 1/4 inch ID, Polypropyleen </td><td> Visser </td><td> 05-112-37 </td><td> Connectors: Bestellen: 1x (pak van 5) </td></tr><tr><td> Silent Air Pompen </td><td> <a href="http://www.aquariumguys.com/" target="_blank">Aquarium Guys.com</a> </td><td> 212422 </td><td> Luchttoevoer: Volgorde: 4 pompen </td></tr><tr><td> PTFE filters, 0,45 pm, voor luchtfiltratie </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-02915-22 </td><td> Luchttoevoer: Bestellen: 1x (doos van 100) </td></tr><tr><td> 1L Fles met pistool </td><td> Visser </td><td> 10-181F </td><td> Luchttoevoer: Bestellen: 2x (Pack van 6) </td></tr><tr><td> # 8 silicone stop 3/8 in gat voor sidearm kolven </td><td> Visser </td><td> K953715-0801 </td><td> Luchttoevoer: Bestel: 8 stoppers </td></tr><tr><td> 4-Port manifold </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06464-85 </td><td> Luchttoevoer: Bestel: 8 manifolds </td></tr><tr><td> 55 ml Schroefdop kweekbuisjes </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 9825-25 </td><td> Cultuur Kamer: Orde: 2x (pak van 48) </td></tr><tr><td> Regelmatige onderhuidse witte hub naald, 16G, 5 inch lengte voor uitstroomleiding </td&gt; <td> Visser </td><td> 14-817-105 </td><td> Cultuur Kamer: Orde: 1x (pak van 100) </td></tr><tr><td> Spinal Tap naald </td><td> VWR </td><td> BD40836 </td><td> Cultuur Kamer: Orde: 4x (pak van 10) </td></tr><tr><td> Regelmatige hypodermische roze naald </td><td> Visser </td><td> 14-817-104 </td><td> Cultuur Kamer: Orde: 1x (pak van 100) </td></tr><tr><td> Foam Siliconenstopper grootte &quot;2&quot;, roze </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-06 </td><td> Cultuur Kamer: Orde: 2x (pak van 20) </td></tr><tr><td> 8-Well buis Rack </td><td> VWR </td><td> 82024-452 </td><td> Cultuur Kamer: Volgorde: 4 rekken </td></tr><tr><td> 10L Reservoir fles met bodem slang uitlaat: vacuüm veilig </td><td> VWR </td><td> 89001-530 </td><td> Media: Bestel: 2 of meer </td></tr><tr><td> Geel schuim siliconen stop, niet-standaard maat 12 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-22 </td><td> Media: Bestel: 2 of meer </td></tr><tr><td> Mandfles Venting Filter </td><td> Visser </td><td> SLFG 050 10 </td><td> Media: Bestel: 1x (pak van 10) </td></tr><tr><td> Elektrische tape, groen </td><td> <a href="http://Amazon.com" target="_blank">Amazon.com</a> </td><td> 10.851-BA-10 </td><td> Media: Bestel 1 rol. </td></tr><tr><td> Fles bovenste filter, 1L, 0,2 micrometer, 45 mm </td><td> VWR </td><td> 29442-978 </td><td> Media: Orde: (1 geval van 12) </td></tr><tr><td> 5000 ml Reservoir fles met onderuitloop: vacuum veilig </td><td> VWR </td><td> 89003-384 </td><td> Media: (Optioneel) </td></tr><tr><td> Blue Foam Siliconen stop, nonstandardsize 10 1/2 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-18 </td><td> Media: (Optioneel) </td></tr><tr><td> 205S/CA16, 16 Cartridge pomp </td><td> Watson-Marlow </td><td> 020.3716.00A </td><td> Media Pomp: Bestel: 1 </td></tr><tr><td> 16-kanaals 205CA Extension pompkop </td><td> Watson-Marlow </td><td> 023.1401.000 </td><td> Media Pomp: Bestel: 2 uitbreiding pompkoppen </td></tr><tr><td> Silicone aquarium sealer </td><td> Visser </td><td> S18180B </td><td> Media Pomp: Bestel: 1 </td></tr><tr><td> 6-blok droge bad </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Bestel: 2 voor 32 ministats of 1 voor 16. </td></tr><tr><td> Blok voor drybath, 6 x 25 mm reageerbuis per blok </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Bestel: 12 voor 32 ministats of 6 voor 16. </td></tr><tr><td> Nylon membraanfilters, 0,45 pm poriegrootte; Dia: 25 mm. </td><td> Visser </td><td> R04SP02500 </td><td> Oogsten: Bestellen: 1x (pak van 100) (optioneel) </td></tr><tr><td> Nylon membraanfilters, 0,45 pm poriegrootte; 45 mm </td><td> Visser </td><td> R04SP04700 </td><td> Oogsten: Bestellen: 1x (pak van 100) (optioneel) </td></tr><tr><td> 47 mm, grote filter apparatuur </td><td> Visser </td><td> XX10 047 30 </td><td> Oogsten: Bestellen: 1 (optioneel) </td></tr><tr><td> Glass filterhouder 25 mm, kleine filterinrichting </td><td> VWR </td><td> 26316-692 </td><td> Oogsten: Bestellen: 1 (optioneel) </td></tr><tr><td> Dewarvat, 1L voor vloeibare stikstof </td><td> VWR </td><td> 63380-052 </td><td> Oogsten: Bestellen: 1 (optioneel) </td></tr></tbody></table>

design and use of multiplexed chemostat arrays

Chemostaten zijn continue kweek systemen waarin cellen worden gekweekt in een strikt gecontroleerde, chemisch constante omgeving waar kweekdichtheid wordt beperkt door het beperken van specifieke voedingsstoffen. 1,2 Gegevens uit chemostaten zijn zeer reproduceerbaar voor de meting van kwantitatieve fenotypen omdat ze een constante groei en milieu bij steady-state. Om deze redenen, chemostaten zijn geworden nuttige hulpmiddelen voor gedetailleerde karakterisering van de fysiologie door middel van analyse van genexpressie 3-6 en andere kenmerken van culturen bij steady-state evenwicht. 7 Lange-termijn experimenten in chemostaten kunt markeren specifieke trajecten dat microbiële populaties vast te stellen tijdens adaptieve evolutie in een gecontroleerde omgeving. In feite hebben chemostaten gebruikt voor experimentele evolutie sinds hun uitvinding. 8 Een gemeenschappelijk resultaat in evolutie experimenten voor elke biologische herhaalde een unieke repertoire van mutaties verwerven. 9 tot 13 ​​Deze diversiteit doet vermoeden dat er veel wordt overgelaten om ontdekt te worden door het uitvoeren van de evolutie experimenten met een veel grotere verwerkingscapaciteit. We presenteren hier de opzet en werking van een relatief eenvoudige, goedkope array van miniatuur chemostaten-of ministats-en valideren hun gebruik in de bepaling van de fysiologie en in de evolutie experimenten met gist. Deze aanpak houdt in groei van tientallen chemostaten lopen op een enkele multiplex peristaltische pomp. De culturen worden op een 20 ml werkvolume, dat praktisch is voor een verscheidenheid aan toepassingen. Wij hopen dat steeds throughput, dalende kosten en gedetailleerde opbouw en werking instructies kunnen ook onderzoek en industriële toepassing van dit ontwerp motiveren een algemeen platform voor functioneel karakteriseren grote aantallen stammen, soorten en groeiparameters, evenals genetische of drugs bibliotheken.

De Ministat matrix hierboven en in (Figuur 1A, B) werd gebruikt om de cultuur een haploïde MATa laboratoriumstam van gist (S288c) onder sulfaat-limiterende omstandigheden zoals eerder beschreven. 10 We werkzaamheid getest gemeenschappelijke chemostaat toepassingen zoals bepaling van fysiologie en experimentele evolutie. De ministats geldig is, meermaals experimenten die zij in industriële fermentoren aangepast voor gebruik chemostaat. 10,20,21 ATR Sixfors fermentoren werden bij een 300 ml werkvolume, dan tien keer het volume van de ministats en hebben aanzienlijk verschillende modi van cultuur beluchting en agitatie. We hebben geprobeerd om apparatuur stabiliteit, steady state fysiologie, experimentele evolutie resultaten, en gen-expressie patronen verkregen met deze fermentoren repliceren. Sinds uniformiteit van verdunning en beluchting zijn belangrijke aspecten van de chemostaat ontwerp, we measured de werkelijke verdunning in 32 ministats na 15 generaties groei en dat met een doel verdunning van 0,17 vol / uur (4-5 druppels / min) we een gemiddelde verdunningssnelheid van 0,17208 bereikt met een standaarddeviatie van 0,0075 in 32 repliceert. Deze serie was in onze typische tolerantie van + / -0,01 vol / uur verschil van de doelstellingen, waarna grootschalige veranderingen in genexpressie waargenomen. Tweeëntwintig-drieëntwintig over 4 ministats het luchtdebiet werd bepaald aan 307,5 ​​ml zijn / min met een standaarddeviatie van 9,57 ml / min. Dit suggereert dat de luchtstroom in de kamers robuust is en gelijk verdeeld over de vier kamers en een waarde gelijk aan die beschreven voor beluchting in industriële fermentoren 20. We eerder waargenomen terugkerende versterking van de hoge-affiniteit zwavel-ion transporter SUL1 in 8/8 sulfaat beperkte evolutie experimenten in gist 10. Aangezien de consistentie van resultaten op this staat hebben we gekozen sulfaat-beperking van ons systeem het vermogen te testen. Een vereiste element van chemostaat cultuur is de noodzaak om een ​​constante chemische omgeving te handhaven. Schommelingen in de overvloed van een beperkende voedingsstof of andere veranderingen in de omgeving meestal resulteren in een verandering in het aantal cellen in een cultuur. We gemeten optische dichtheid als een proxy voor celaantal (Figuur 2A) en reproduceerbaarheid gemeten over 16 duplokweken het vinden van een gemiddelde van 1,12 A600 (~ 10 9 cellen) na ~ 15 generaties groei met een standaarddeviatie van 0,057 eenheden of 5,1 %. Ter vergelijking metingen van vier duplokweken gekweekt in de industriële fermentoren toonde een standaardafwijking van 2,5%. Cellen werden goed gemengd in de groeikamer: metingen van OD en cellen uit het effluent spoor waren gelijk aan monsters die rechtstreeks uit de kweekbuis (data niet getoond). Deze resultaten tonen de robuustheid van ons platform eend mogelijkheid om een ​​constante chemische omgeving te handhaven binnen een soortgelijke tolerantie als de industriële fermentor. Als gevoeliger uitlezing van fysiologie, vergeleken we genoomwijde steady state genexpressie van kweken gekweekt onder sulfaat beperking in de ministats en in de industriële fermentor. Genexpressie in de ministats toonde een hoge mate van overeenkomst over drie biologische replicaten (Figuur 2B). We hebben eerder opgemerkt dat RNA uit twee herhaalde Sixfors chemostaten en co-gehybridiseerd met een microarray expressie van genen 99% viel binnen een 1,5-voudige bereik, waardoor het gebruik van 1.5X als empirische betekenis cutoff 21. Genexpressie van drie gelijke ministats, vergeleken paarsgewijze, toonde 99% van de genen viel binnen een 1,5-1,7 maal bereik, vergelijkbaar met de resultaten van de industriële fermentoren. De drie monsters werden gehybridiseerd met individuele arrays en de paarsgewijze verhoudingen daarna berekend, zodat deze values omvatten inter-array ruis Naast biologische ruis, mogelijk overschatting van de variatie tussen repliceert in vergelijking met de gepubliceerde, co-gehybridiseerde resultaten. 138 genen differentieel tot expressie&gt; 1,5-voudig in alle drie herhalingen Ministat vergeleken met een monster genomen van een passende kweek in de industriële fermentor. Genen daalde in uitdrukking in de ministats waren zwaar verrijkt voor ijzer metabolisme. Deze handtekening kan een afspiegeling van de verschillende metalen samenstelling van elk configuratie van het apparaat: de Sixfors inrichting omvat een metalen waaier en beluchting montage ondergedompeld in de cultuur en de media jerrycans eerder gebruikte ook vereist metalen hardware. De Ministat maakt gebruik van roestvrij stalen naalden, maar geen andere metalen onderdelen. Genen met verhoogde expressie grotendeels geassocieerd met celmembranen, maar de biologische betekenis van deze vereniging is onduidelijk. Ten slotte hebben we getest experimentele evolutie under deze voorwaarden. Na 250 generaties sulfaat beperkte groei, 4/4 klonen getest van 4 onafhankelijke populaties ontwikkeling bleek amplificatie van SUL1 zoals gedetecteerd door array comparatieve genomische hybridisatie (CGH, figuur 2C). Dit resultaat is consistent met de bevindingen in groter volume dan soortgelijke chemostaten tijdsintervallen 10. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1.jpg" alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1highres.jpg"/> Figuur 1. A. constructie en plaatsing van de Ministat array. B. Ontwerp van de cultuur kamer. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2.jpg" alt="Figuur 2" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2highres.jpg"/> Figuur 2. A. experimental gegevens waaruit blijkt dat culturen bereiken evenwicht binnen tien generaties groei (n = 16). B. Expressie voor drie biologische duplo S1-3 bemonsterde steady state onder sulfaat beperking ten opzichte van een gemeenschappelijke referentie gekweekt in een aangepaste sulfaat beperkte Sixfors chemostaat . C. SUL1 amplificaties teruggevonden in ministats na 250 generaties van groei in een sulfaat-beperkte omgeving. Genomisch DNA uit elke kloon werd ontwikkeld vergeleken met voorouderlijke DNA door CGH beschreven. Kopienummer 21 gemiddelde werd berekend voor elke geamplificeerde gebied en naast elke amplicon zijn. Alle microarray gegevens worden afgezet in de GEO-database onder toegangsnummer GSE36691. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50262/50262fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays at JoVE.com

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

We ontwikkeld en gevalideerd een kleine voetafdruk array van miniatuur chemostaten opgebouwd uit gemakkelijk beschikbare onderdelen voor lage kosten. Fysiologische en experimentele evolutie resultaten waren vergelijkbaar met groter volume chemostaten. De Ministat reeks biedt een compacte, goedkope, en toegankelijk platform voor traditionele chemostaat experimenten, functionele genomica, en chemische screening toepassingen.

Ontwerp en gebruik van multiplexverzending chemostaat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

Microfluïdische Chips Gecontroleerde met elastomeer microklep Arrays

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

Bio-elektrische Analyses van een Osseointegrated Intelligent Design System Implantaat voor geamputeerden

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays MEAs

Hoe te Cultuur, Record en het stimuleren van neuronale netwerken op de Micro-elektrode arrays (MEA&#39;s)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Profilering van de Pre-micro-RNA&#39;s en microRNA&#39;s met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

Multiplexed fluorometrische Immunoassay Methodiek en problemen oplossen

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

Fabricage en gebruik van micro-omgeving microarrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Assemblage van Nucleosomale Arrays van Recombinant kernhistonen en Nucleosome Positioning DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Ontwerp en analyse van temperatuurvoorkeursgedrag en het circadiane ritme in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...