Name: design and use of multiplexed chemostat arrays
Uploaded: 2013-02-23T00:00:00
Duration: 19 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays at JoVE.com

Etableringen av videoen ble støttet med tilskudd fra National Center for Research Resources (5P41RR011823-17) og National Institute of General Medical Sciences (8 P41 GM103533-17) fra National Institutes of Health. Dette arbeidet ble også støttet av NSF tilskudd 1.120.425. MJD er en Rita Allen Foundation Scholar. AWM støttes delvis av NIH T32 HG00035. Vi takker Anna Sunshine for å få hjelp med å forbedre protokoller. I tillegg erkjenner vi Sara DiRienzi, Celia Payen, og Amy Sirr som tidlige brukere av ministats.

Bruk egnet steril teknikk gjennom protokollen. 1. Montering Deler til og forberede Ministat Array <ol><li> Bestille alle deler. </li><li> Rengjør glassrør. Marker rør ved 20 ml volum. </li><li> Gjør kork forsamlinger med luft, media og avløp havner og plassere dem på toppen av de rengjorte glass kultur rør. </li><li> Forbered luftfukting kamre og ordne alle ikke-autoklaveres deler. </li><li> Gjør luft, avløpsvann og media tubing med tilstrekkelig rør lengder og kompatibel koblinger. </li><li> Koble hver type rør (luft, media og avløp) til kork forsamlinger og folie filtre og media rask koble å forberede dem for autoklaven. </li><li> Forbered en carboy for bruk i å lage steril chemostat medium. </li><li> Forbered kultur prøvetaking flasker ved å sette en to-hulls gummipropp med passende tilbehør. Folie hvert filter for å forberede dem for autoklaven. </li><li> Fit den sammensatte utvalg pent inn ett eller flere autoklav skuffer og autoklaver alle deler. </li><li> Lag og filtrere chemostat medier i autoklaveres flasker. </li></ol> 2. Sette opp et forsøk <ol><li> Fyll hver hydrering kolbe med 700 ml DDH 2 O. </li><li> Plasser autoklaveres ministats inn i varmeblokken innstilt på den ønskede temperatur. </li><li> Plasser flyselskapene i 4-port manifold og slå på luftpumpe. </li><li> Koble avløp linjene til 100 ml samling flasker. </li><li> Fjern folien fra slutten av media slange og media carboy og koble to raske kobler. Træ hver lengde pumpeslanger gjennom en peristaltikkpumpe kassett og klikke dem på plass. Slå på media pumpen. </li><li> La kamrene fylle. Slå av media pumpen. </li><li> Spray kork forsamlinger med 70% etanol og inokuler kulturer ved hjelp av en sprøyte. Lagre et utvalg av inokulum som en frossen glyserol lagerhvis ønskelig. La kulturer vokse for 30 hr. </li><li> Justere høyden av utløpet nålen inntil kulturen volumet er satt til 20 ml med luftstrømmen er slått av. Dette kan ta flere justeringer i løpet av en time. Når du er ferdig slår luftstrømmen igjen. </li><li> Slå media pumpen. </li><li> Tømme avløpsvann prøvetaking flasker, som inneholder media samlet mens innstillingen arbeidskultur volum, og registrerer tiden. </li><li> Å ta en time-null måling sted avløpsvannet linjer i sterile samling rør for 15 min-2 timer (avhengig av hvilket lydnivå du ønsker å prøve for DNA-analyse). Også gjøre en glyserol frossen lager for hver kultur på denne tiden hvis ønskelig. </li></ol> 3. Daglige målinger <ol><li> Som med tid-null måling, prøven på is i 15 min-2 timer (etter behov for eksperimentet) på is og registrerer tiden samplet for DNA og frosne lager prøver. </li><li> For RNA prøver enten samle en liten volUme med en sprøyte og 22G 5 &quot;kanyle fra kultur eller uncork hver ministat å høste hele kulturen. Prøvene må tatt raskt, oppsamlet ved filtrering, og fryses umiddelbart i flytende nitrogen. </li><li> Mål avløpsvannet samlet inn siden forrige prøvetaking for hver ministat å kvantifisere fortynning rate. Juster fortynning priser ved behov gjennom readjusting pumpen innstilling eller tuning finjusteringskomparatoren på individuelle pumpe linjer. </li><li> Erstatt avløp linjer i tomme samling flasker. </li><li> Kvantifisere celler / ml så vel som andre endepunkter av interesse og foreta en glyserol frossen lager. </li></ol> 4. Post-eksperiment Cleanup <ol><li> Plasser alle rør i separate skuffer og skyll med store mengder DDH 2 O. Tørr slange med et akvarium pumpe. </li><li> Rengjør kork forsamlinger med DDH 2 O og bruke nål sette inn for å rengjøre nåler, aspirere og utlevering vann etter tur. Tørk utsiden av nåler og kork for å fjerne eventuellegjenværende medier. </li><li> Rengjør glasset slangen med vann og etanol, og fjerne fysiske forurensninger med 3 balled opp Kimwipes og pinsetter. </li><li> Skyll og tørk alle delene igjen før bruk. </li></ol>

<ol>
	<li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R&#233;cherches+sur+la+Croissance+des+Cultures+Bacteriennes.">R&#233;cherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes.</a> Ann. I. Pasteur. 79, 390-410 (1950).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+the+chemostat.">Description of the chemostat.</a> Science. 15, 715-716 (1950).</li><li>Daran-Lapujade, P., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., de Winde, J. H., Pronk, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemostat-based+micro-array+analysis+in+baker's+yeast.">Chemostat-based micro-array analysis in baker's yeast.</a> Adv. Microb. Physiol. 54, 257-311 (2009).</li><li>ter Linde, J. J. M., Pronk, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transcriptional+analysis+of+aerobic+and+anaerobic+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 181, 7409-7413 (1999).</li><li>Boer, V., de Winde, J., Pronk, J., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome-wide+transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisiae+grown+on+glucose+in+aerobic+chemostat+cultures+limited+for+carbon,+nitrogen,+phosphorus,+or+sulfur.">The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur.</a> J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).</li><li>Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K., Oliver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+nutrient+control+of+gene+expression+in+Saccharomyces+cerevisiae+during+growth+and+starvation.">Global analysis of nutrient control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae during growth and starvation.</a> 101, 3148-3153 (2004).</li><li>Diderich, J. A., Kruckeberg, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Uptake+Kinetics+and+Transcription+of+HXT+Genes+in+Chemostat+Cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Glucose Uptake Kinetics and Transcription of HXT Genes in Chemostat Cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 274, 15350-15359 (1999).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria.">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).</li><li>Kubitschek, H. E., Bendigkeit, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+continuous+cultures.+I.+Dependence+of+mutational+response+upon+growth-limiting+factors.">Mutation in continuous cultures. I. Dependence of mutational response upon growth-limiting factors.</a> Mutation Res. 1, 113-120 (1964).</li><li>Gresham, D., Dunham, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+and+Dynamics+of+Evolutionary+Adaptations+to+Controlled+Nutrient-Limited+Environments+in+Yeast.">The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast.</a> PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).</li><li>Kao, K. C., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+clonal+interference+during+adaptive+evolution+in+asexual+populations+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).</li><li>Kvitek, D. J., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Sign+Epistasis+between+Frequently+Experimentally+Evolved+Adaptive+Mutations+Causes+a+Rugged+Fitness+Landscape.">Reciprocal Sign Epistasis between Frequently Experimentally Evolved Adaptive Mutations Causes a Rugged Fitness Landscape.</a> PLoS Genet. 7, e1002056 (2011).</li><li>Helling, R. B., Adams, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+during+Growth+in+a+Constant+Environment.">Evolution of Escherichia coli during Growth in a Constant Environment.</a> Genetics. 116, 349-358 (1987).</li><li>Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Evolution+in+Yeast:+A+Practical+Guide.">Experimental Evolution in Yeast: A Practical Guide.</a> Methods Enzymol. 470, (2010).</li><li>Hoskisson, P. A., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+-+making+a+comeback.">Continuous culture - making a comeback.</a> Microbiology. 151, 3153-3159 (2005).</li><li>Nanchen, A., Schicker, A., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+dependency+of+intracellular+fluxes+on+growth+rate+in+miniaturized+continuous+cultures+of+Escherichia+coli.">Nonlinear dependency of intracellular fluxes on growth rate in miniaturized continuous cultures of Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 1164-1172 (2006).</li><li>Klein, T., Schneider, K., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+miniaturized+stirred+bioreactors+for+parallel+continuous+cultivation+of+yeast+with+online+measurement+of+dissolved+oxygen+and+off-gas.">A system of miniaturized stirred bioreactors for parallel continuous cultivation of yeast with online measurement of dissolved oxygen and off-gas.</a> Biotechnol. and bioeng. , (2012).</li><li>Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+bacteria+undergoing+programmed+population+control+in+a+microchemostat.">Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat.</a> Science. 309, 137-140 (2005).</li><li>Groisman, A., Lobo, C., Cho, H., Campbell, J. K., Dufour, Y. S., Stevens, A. M., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chemostat+for+experiments+with+bacterial+and+yeast+cells.">A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells.</a> Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).</li><li>Brauer, M. J., Botstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Adjustment+and+Metabolic+Remodeling+in+Glucose-limited+Yeast+Cultures.">Homeostatic Adjustment and Metabolic Remodeling in Glucose-limited Yeast Cultures.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 2503-2517 (2005).</li><li>Torres, E. M., Amon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aneuploidy+on+Cellular+Physiology+and+Cell+Division+in+Haploid+Yeast.">Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast.</a> Science. 317, 916-924 (2007).</li><li>Regenberg, B., Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-rate+regulated+genes+have+profound+impact+on+interpretation+of+transcriptome+profiling+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Biology. 7, R107 (2006).</li><li>Castrillo, J. I., Oliver, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control+of+the+eukaryote+cell:+a+systems+biology+study+in+yeast.">Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast.</a> Journal of Biology. 6, 4 (2007).</li><li>Brauer, M. J., Botstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).</li><li>Ferenci, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+physiology,+regulation+and+mutational+adaptation+in+a+chemostat+environment.">Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment.</a> Adv. Microb. Physiol. 53, 169-229 (2008).</li></ol>

Forfatterne hevder at de ikke har noen interessekonflikter.

Chemostat dyrking i ministats, som med alle chemostat, krever oppmerksomhet på detaljer og feilsøking. Siden forurensning er av stor bekymring i kontinuerlig kultur eksperimenter, vi vanligvis ser via mikroskop for bakterier og sopp forurensning ved inokulering og hver 50 generasjoner under langsiktige utviklingen eksperimenter. Hittil har vi ikke observert forurensning over 96 evolusjon eksperimenter på mer enn 300 generasjoner (data ikke vist). For å teste for krysskontaminering mellom ministats og potensialet for mikrober å kolonisere kultur kammeret ved hjelp av avløpet linje vi kjørte 16 ministats slik at annenhver ministat ble inokulert med gjær som ovenfor og resten ble ikke inokulert med enhver kultur. Kulturene ble samplet i en felles avfallsbeholder, som ble tømt annenhver dag. Dermed hvis det var mulig for forurensninger å gå inn gjennom avløpet linjen vi sannsynligvis ville ha observert at i denne experiment. I løpet av tre uker og større enn 100 generasjoner av veksten i denne rutemønster av inokulerte og ikke-inokulert kulturer vi ikke observere vekst i ikke-inokulert ministat kultur rør, noe som tyder på at forurensning utenfra gjær eller andre mikrober er lite sannsynlig i eksperimenter av lignende tidsrammer. Selv om ministats ble designet for å operere på en måte analogt til kommersielle chemostats, gjør den modulære natur av denne ordningen for optimalisering å passe brukernes behov og budsjett. Den peristaltiske pumpe som brukes i denne protokollen kan oppnå strømningshastigheter mellom 0,0186 vol / time til 3,6 vol / time (data ikke vist). Økt kontroll av fortynning priser kan oppnås med alternative pumpemodeller. Merk at drift ved lavere fortynning priser kan kreve substitusjon av en høyere gauge nål for å oppnå den samme frekvensen av dråpene produksjonstid. Bestandsstørrelse er en viktig faktor for riktig design av evolusjon eksperimenter.Standarden fortynningshastigheten og næringsstoffer konsentrasjon brukt her gir en relativt stor befolkning størrelse (~ 10 9 celler) av samme størrelsesorden som publiserte evolusjon studier. 11 større eller mindre populasjoner kunne opprettholdes ved å endre arbeidsvolum eller begrensende næringsstoff konsentrasjon. Økt mutasjon leveranser kan også oppnås ved å arbeide med stammer med forhøyede mutasjon priser. De ministats kan også bli bedre over vår nåværende design. For eksempel kondens kan avleires på kultur rørveggene og kan bli sterkt redusert ved hjelp av en dyp vannbad, inkubator eller konstant temperatur rom. Selv clumping og vegg vekst i sulfat begrensede kulturer ser ut til å være relativt sjeldne, som vises i 5/48 evolusjon eksperimenter med 300 generasjoner (data ikke vist), et utvalg av tensider er tilgjengelig som kan hjelpe i å redusere eller forsinke denne egenskapen. I tilfelle at klumpdannelse forstyrrer tilstrekkelig kulturblanding, økt agitasjon kan oppnås ved å redusere antall av måter hver luftpumpe deles, eller ved å legge en omrøring apparat. Ytterligere prober for oppløst gass konsentrasjon, pH, eller andre parametere kan også være inkludert, som i noen andre motiver. 17 Til tross for potensielle endringer, ved hjelp av ministats som beskrevet i denne protokollen, observerte vi svært konsekvente eksperimentelle parametre og reproduserbare resultater når man sammenligner vår enhet til innrapporterte data for større volum kommersielle chemostats. Dette inkluderte reproduserbarhet av mobilnettet fysiologi sett gjennom steady-state likevekt innen 10-15 generasjoner (figur 2A) og skaffe tilsvarende kultur tettheter ved likevekt. Genuttrykksmønster var konsistente på tvers av tre biologiske replikerer i ministats og mellom ministats og kommersielle store volum plattformer (figur 2B), med unntak av jern metabolisme gener. Disse expression forskjeller er sannsynligvis forårsaket av endringer i metall innhold av de to enhetene eller forbedringer i kvaliteten på media ingredienser. Våre data tyder på at ministats vil være nyttig for fysiologi eller konkurranse eksperimenter der en konsekvent miljø er nødvendig. For å teste om ministat design er tilstrekkelig for eksperimentelle evolusjon applikasjoner vi utviklet kulturer henhold sulfat begrensning for 250 generasjoner og brukte CGH å karakterisere forsterkning på SUL1 locus -. Et kjennetegn på langsiktige utviklingen under disse forholdene i større volum chemostats 10 Vi observerte forsterkning av SUL1 i kloner fra 4/4 uavhengige evolusjon eksperimenter i sulfat-begrensede media (figur 2C). Sett under ett antyder disse dataene at ministats er en robust plattform som kan være nyttig for en rekke tradisjonelle chemostat applikasjoner. Selv om vi demonstrert bruken i dyrking spirende gjær, de ministats børogså kompatibel med andre organismer og lignende design har faktisk blitt brukt til dyrking bakterier og andre gjær arter. 16,17,25 Videre mindre kultur volum og korrelert redusert behov for media kan gjøre ministats et attraktivt alternativ for eksperimenter som krever dyrt eller eksotisk reagenser som kan være tilfelle i kjemiske eller genetiske skjermer.

Dynamikken i mikrobiell vekst og utvikling er grunnleggende for mikrobiologi, økologi, genetikk og bioteknologi. Den vanligste metoden for dyrking mikrober er i batch, hvor cellene blir vaksinert ved lav tetthet i næringsrikt buljong og vokst til metning. Selv enkle å utføre ved hjelp av standard laboratorieutstyr, batch kulturer oppleve en varierende kjemisk miljø og tilsvarende endring mobilnettet fysiologi. Denne heterogene vekst miljøet kan føre til sekundære vekst og stress effekter som kan maskere subtile fysiologiske forskjeller. Eksperimentell evolusjon ved seriell batch overføring kan velge for komplekse blandinger av vekst-fase spesifikke subpopulasjoner, kompliserende forsøk på å koble tilpasninger til bestemte selektive forhold. Måling av kvantitative fenotyper kan være vanskelig på grunn av støy fra upresis prøve timing og variasjon i funksjoner som lag tid. Sammenhengende kultur gi et alternativvekst regime hvor celler kan reproduserbart dyrkes i en kjemisk homogen miljø på en definert vekstrate å nå en fysiologisk steady state. På grunn av disse fordelene, studier av eksperimentell evolusjon og karakterisering av cellulær tilstand ofte utnytte kontrollert miljø av kontinuerlige kulturer som chemostat. 14 Styrking av disse fordelene har ført til en oppblomstring i interessen for chemostat kulturer. 15 Siden de ble introdusert i 1950, har 1,2 chemostat systemer er utviklet for å fungere på en rekke skalaer fra liter til mikroliter og for en rekke bruksområder. 16 -19 Disse ulike design, som spenner fra kommersielt produsert bioreaktorer til glassblown fartøy til egendefinerte MicroFluidics plattformer, dele generelle design prinsipper. En kultur kammer omrøres og luftes (vanligvis ved bobling luft gjennom det) og mikrobene deri holdes homogenly dispergert i hele kulturen kammeret til enhver tid. Friskt medium av definert sammensetning tilsettes kontinuerlig og tilsetningshastigheten kontrollerer vekstraten og påvirker kjemiske miljøet oppleves av kulturen. Et overløp setter kulturen volum i veksten røret, og gjennom dette overløp kulturen blir samplet på samme hastighet ved hvilken friskt medium trer. På denne måten kulturer raskt nå en fysiologisk steady state der mange biologiske parametre holdes konstante. Til tross for fordelene med chemostats og rapporter fra de ulike plattformene i litteraturen, har utbredelsen vært begrenset av vanskeligheter i bygging og drift disse systemene, og høye kostnader forbundet med kommersielle alternativer. Videre beskrivelser av hvordan å lage og bruke disse enhetene kan være ugjennomsiktig. Vi presenterer design og instruksjoner for bruk av en liten plassbruk rekke miniatyr chemostats bygget fra lett tilgjengelige deler til en lav kostnad. Vi obsErve svært konsekvente eksperimentelle parametre og reproduserbare resultater når man sammenligner vår enhet til innrapporterte data for gjær dyrket i større volum kommersielle bioreaktorer. Dette inkluderer reproduserbarhet av mobilnettet fysiologi sett gjennom steady-state likevekt innen 10-15 generasjoner og skaffe tilsvarende kultur tettheter ved likevekt. I tillegg genuttrykksmønster er konsistente mellom ministats og en kommersiell større volum plattform. Stabilitet av fortynning rate, optisk tetthet og reproduserbarhet av genuttrykk mellom tre gjentatte kulturer demonstrere robustheten vår plattform. Vi viser også at de samme adaptive mutasjoner oppstår over lignende eksperimentelle evolusjon tidsskalaer som med større volum chemostats.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> 3/32 &quot;x 7/32&quot; silikonslanger </td><td> VWR </td><td> 63009-260 </td><td> Slange: Rekkefølge: (50 &#39;spiral pack) </td></tr><tr><td> 1/2 &quot;x 5/8&quot; silikonslanger (ekstra stor) </td><td> VWR </td><td> 63009-299 </td><td> Slange: Rekkefølge: (50 &#39;spiral pack) </td></tr><tr><td> 1/4 &quot;x 3/8&quot; silikonslanger (medium) </td><td> VWR </td><td> 63009-279 </td><td> Slange: Rekkefølge: (50 &#39;spiral pack) </td></tr><tr><td> Oransje grønn Marprene pumpeslanger </td><td> Watson-Marlow </td><td> 978.0038.00 + </td><td> Slange: Order: 6x (pakke med 6) </td></tr><tr><td> Kvinne luer, 1/8 &quot;barb </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45500-04 </td><td> Kontakter: Bestill: 4x (en pakke 25) </td></tr><tr><td> Mann luerlås, 1/8 &quot;brodd </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45503-04 </td><td> Kontakter: Rekkefølge: 1x (en pakke 25) </td></tr><tr><td> Redusere kontakten, &quot;til 1/8&quot; PVDF, 1/4 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30703-50 </td><td> Kontakter: Rekkefølge: 1x (10 stk) </td></tr><tr><td> Barbed Y-kontakt, 1/8 &quot;ID </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-30703-92 </td><td> Kontakter: Bestill: 3x (en pakke 10) </td></tr><tr><td> Middels rør klemmer </td><td> VWR </td><td> 63022-405 </td><td> Klemmer: Rekkefølge: 1x (en pakke 12) </td></tr><tr><td> Dag Pinchcock (metallbøyle for slanger) </td><td> VWR </td><td> 21730-001 </td><td> Klemmer: Rekkefølge: 1x (en pakke 10) </td></tr><tr><td> Mann inline Valved quick-kontakt, Passer slange: 1/4 tommer </td><td> Fisher </td><td> 05-112-39 </td><td> Kontakter: Rekkefølge: 1x (en pakke 25) </td></tr><tr><td> Kvinne inline Valved rask kontakt, Passer slange: 1/4 tommer ID, Polypropylene </td><td> Fisher </td><td> 05-112-37 </td><td> Kontakter: Rekkefølge: 1x (en pakke 5) </td></tr><tr><td> Silent Air Pumper </td><td> <a href="http://www.aquariumguys.com/" target="_blank">Akvarium Guys.com</a> </td><td> 212422 </td><td> Air Supply: Rekkefølge: 4 pumper </td></tr><tr><td> PTFE filtre, 0,45 mikrometer, for luftfiltrering </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-02915-22 </td><td> Air Supply: Rekkefølge: 1x (eske med 100) </td></tr><tr><td> 1L Flask med sidearm </td><td> Fisher </td><td> 10-181F </td><td> Air Supply: Rekkefølge: 2x (pakke med 6) </td></tr><tr><td> # 8 silikon propp, 3/8 i hullet, for sidearmen kolber </td><td> Fisher </td><td> K953715-0801 </td><td> Air Supply: Rekkefølge: 8 stoppers </td></tr><tr><td> 4-Port manifold </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06464-85 </td><td> Air Supply: Rekkefølge: 8 manifolder </td></tr><tr><td> 55 ml skrukork kultur rør </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 9825-25 </td><td> Kultur Chamber: Rekkefølge: 2x (en pakke 48) </td></tr><tr><td> Regelmessig sprøyte hvit hub nål, 16G, 5 tommer lengde for effluent linje </td&gt; <td> Fisher </td><td> 14-817-105 </td><td> Kultur Chamber: Rekkefølge: 1x (en pakke 100) </td></tr><tr><td> Spinal Tap nål </td><td> VWR </td><td> BD40836 </td><td> Kultur Chamber: Rekkefølge: 4x (en pakke 10) </td></tr><tr><td> Regelmessig sprøyte rosa nål </td><td> Fisher </td><td> 14-817-104 </td><td> Kultur Chamber: Rekkefølge: 1x (en pakke 100) </td></tr><tr><td> Skum Silikon stopper størrelse &quot;2&quot;, rosa </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-06 </td><td> Kultur Chamber: Rekkefølge: 2x (en pakke 20) </td></tr><tr><td> 8-Vel tube Rack </td><td> VWR </td><td> 82024-452 </td><td> Kultur Chamber: Rekkefølge: 4 stativer </td></tr><tr><td> 10L Reservoir flaske med bunnen slangeutløp: vakuum trygt </td><td> VWR </td><td> 89001-530 </td><td> Media: Rekkefølge: 2 eller flere </td></tr><tr><td> Gult skum silikon stopper, ikke-standard størrelse 12 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-22 </td><td> Media: Rekkefølge: 2 eller flere </td></tr><tr><td> Carboy Venting Filter </td><td> Fisher </td><td> SLFG 050 10 </td><td> Media: Rekkefølge: 1x (en pakke 10) </td></tr><tr><td> Elektrisk tape, grønn </td><td> <a href="http://Amazon.com" target="_blank">Amazon.com</a> </td><td> 10851-BA-10 </td><td> Media: Bestill en rull. </td></tr><tr><td> Flaske topp filter, 1L, 0,2 mikrometer, 45 mm </td><td> VWR </td><td> 29442-978 </td><td> Media: Rekkefølge: (1 tilfelle av 12) </td></tr><tr><td> 5000 ml Reservoir flaske med bunnutløp: vacuum trygg </td><td> VWR </td><td> 89003-384 </td><td> Media: (valgfritt) </td></tr><tr><td> Blå Skum Silikon stopper, nonstandardsize 10 1/2 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-18 </td><td> Media: (valgfritt) </td></tr><tr><td> 205S/CA16, 16 Cartridge pumpe </td><td> Watson-Marlow </td><td> 020.3716.00A </td><td> Media Pumpe: Bestill: 1 </td></tr><tr><td> 16-kanals 205CA Extension pumpehodet </td><td> Watson-Marlow </td><td> 023.1401.000 </td><td> Media Pumpe: Rekkefølge: 2 extension pumpehoder </td></tr><tr><td> Silikon akvarium sealer </td><td> Fisher </td><td> S18180B </td><td> Media Pumpe: Bestill: 1 </td></tr><tr><td> 6-blokk tørr bad </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Rekkefølge: 2 for 32 ministats eller en for 16 år. </td></tr><tr><td> Blokk for drybath, 6 x 25 mm testrør per blokk </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Rekkefølge: 12 for 32 ministats eller 6 for 16 år. </td></tr><tr><td> Nylon Membranfilter, 0,45 mikrometer porestørrelse, Dia: 25 mm. </td><td> Fisher </td><td> R04SP02500 </td><td> Høsting: Rekkefølge: 1x (en pakke 100) (valgfritt) </td></tr><tr><td> Nylon Membranfilter, 0,45 mikrometer porestørrelse, 45 mm </td><td> Fisher </td><td> R04SP04700 </td><td> Høsting: Rekkefølge: 1x (en pakke 100) (valgfritt) </td></tr><tr><td> 47 mm, stort filter apparat </td><td> Fisher </td><td> Xx10 047 30 </td><td> Høsting: Rekkefølge: 1 (ekstrautstyr) </td></tr><tr><td> Glass filterholder, 25 mm, liten filter apparat </td><td> VWR </td><td> 26316-692 </td><td> Høsting: Rekkefølge: 1 (ekstrautstyr) </td></tr><tr><td> Dewar flask, 1L for flytende Nitrogen </td><td> VWR </td><td> 63380-052 </td><td> Høsting: Rekkefølge: 1 (ekstrautstyr) </td></tr></tbody></table>

design and use of multiplexed chemostat arrays

Chemostats er kontinuerlig kultur i hvilke celler dyrket i et strengt kontrollert, kjemisk stabile omgivelser der kultur tetthet er begrenset av å begrense spesifikke næringsstoffer. 1,2 Data fra chemostats er svært reproduserbare for måling av kvantitative fenotyper som de gir en konstant vekstrate og miljø ved steady state. Av disse grunner, har chemostats blitt nyttige verktøy for fine skala karakterisering av fysiologi gjennom analyse av genuttrykk 3-6 og andre kjennetegn kulturer ved steady-state likevekt. 7 Langsiktige eksperimenter i chemostats kan markere bestemte baner som mikrobielle populasjoner vedta under adaptive evolusjon i et kontrollert miljø. Faktisk har chemostats blitt brukt for eksperimentell utvikling siden oppfinnelsen sin. 8 En vanlig resultat i evolusjon eksperimenter er for hver biologisk replikere å få en unik repertoar av mutasjoner. 9-13 Dette mangfoldet tyder på at det er mye igjen å bli oppdaget ved å utføre evolusjon eksperimenter med langt større gjennomstrømming. Vi presenterer her utforming og drift av en relativt enkel, rimelig utvalg av miniatyr chemostats-eller ministats-og validere deres bruk i fastsettelse av fysiologi og i evolusjon eksperimenter med gjær. Denne tilnærmingen innebærer vekst av titalls chemostats kjøre av en enkelt multiplekset peristaltisk pumpe. Kulturene holdes ved en 20 ml arbeidsvolum, som er praktisk for en rekke anvendelser. Det er vår håp at økende gjennomstrømning, minkende regning, og gi detaljert bygning og drift instruksjoner kan også motivere forskning og industriell anvendelse av dette motivet som en generell plattform for funksjonelt karakteriserer stort antall bakteriestammer, arter, samt vekstparametre, samt genetisk eller narkotika bibliotekene.

Den ministat matrise beskrevet ovenfor og i (figur 1A, B) ble brukt til kultur en haploid MATA laboratoriestammen av spirende gjær (S288c) under sulfat-begrensende betingelser som beskrevet tidligere. 10 Vi testet effekt for vanlige chemostat applikasjoner, inkludert bestemmelse av fysiologi og eksperimentell utvikling. Å validere ministats, gjentok vi flere eksperimenter tidligere utførte i industrielle fermentorer modifisert for chemostat bruk. 10,20,21 ATR Sixfors fermentorer ble kjørt på en 300 ml arbeider volum, over ti ganger volumet av ministats, og har betydelig forskjellige moduser kultur lufting og omrøring. Vi prøvde å gjenskape utstyr stabilitet, steady state fysiologi, eksperimentelle evolusjon resultater, og genuttrykksmønster oppnådd med disse fermentorer. Siden ensartethet av fortynning rate og lufting er viktige aspekter ved chemostat design, me viasured selve fortynningshastigheten tvers 32 ministats etter 15 generasjoner av vekst og funnet at med et mål fortynningshastigheten på 0,17 vol / time (4-5 dråper / min) oppnådd en gjennomsnittlig fortynningshastigheten av 0,17208 med et standardavvik på 0,0075 tvers 32 replikater. Denne serien var innenfor vår typisk avvik på + / -0,01 vol / t forskjell fra målet innstillingen, utover som store endringer i genuttrykk er observert. 22-23 Across 4 ministats luftgjennomstrømningen ble bestemt til å være 307,5 ​​ml / min med et standardavvik på 9,57 ml / min. Dette tyder på at luft-strømmen inn i kamrene er robust og jevnt fordelt mellom fire kamre, og er en verdi lik den som beskrevet for lufting i industrielle fermentorer. 20 Vi tidligere observert tilbakevendende amplifikasjon av høyaffinitets svovel-ion transportør SUL1 i 8/8 sulfat-begrensede evolution eksperimenter i gjær. 10 Gitt konsistensen av resultater under this tilstand vi valgte sulfat-begrensning for å teste systemets evne. En forutsetning element chemostat kultur er behovet for å opprettholde en konstant kjemisk miljø. Svingninger i overflod av et begrensende næringsstoff eller andre endringer i miljøet typisk resultere i en endring i antall celler i en gitt kultur. Vi målte optisk tetthet som en proxy for celle nummer (figur 2A) og målte reproduserbarhet over 16 replikatmålinger kulturer, finne en gjennomsnittlig A600 på 1,12 (~ 10 9 celler) etter ~ 15 generasjoner av vekst med et standardavvik på 0,057 enheter, eller 5,1 %. For sammenligning viste målinger tatt fra fire gjentatte kulturer dyrket i de industrielle fermentorer et standardavvik på 2,5%. Celler ble godt blandet i vekstkammeret: målinger av OD og celletall tatt fra avløpsstrømmen sporet tilsvarte prøvene tatt direkte fra kultur tube (data ikke vist). Disse resultatene viser robustheten av vår plattform end evne til å opprettholde en konstant kjemisk miljø innenfor et tilsvarende toleranse som industriell fermentoren. Som en mer sensitiv avlesning av fysiologi sammenlignet vi genom-wide steady state genekspresjon fra kulturer dyrket under sulfat begrensning i de ministats og i den industrielle fermentoren. Genekspresjon i ministats viste en høy grad av likhet tvers tre biologiske replikater (figur 2B). Vi tidligere bemerket at for RNA avledet fra to replikatmålinger Sixfors chemostats og co-hybridisert til en mikromatrise, falt ekspresjon av 99% av gener innenfor 1,5 doblingen, som tillater bruk av 1,5 X som en empirisk betydning cutoff. 21 Genuttrykk fra Tre replikatmålinger ministats, sammenlignet parvis, viste 99% av genene falt innenfor en 1.5 til 1.7 ganger spenn, kan sammenlignes med resultatene fra de industrielle fermentorer. De tre prøver ble hybridisert til individuelle arrays og parvise forholdstall beregnet etterpå, så disse values inkluderer inter-array støy i tillegg til biologisk støy, potensielt overestimere variasjonen mellom replikater sammenlignet til de publiserte, co-hybridiserte resultater. 138 genene ble differensielt uttrykt&gt; 1,5 ganger i alle tre ministat replikat sammenlignet til en prøve samlet fra en matchet kultur dyrket i industrielle fermentoren. Gener redusert i uttrykk i ministats var tungt beriket for jern metabolisme. Denne signaturen kan gjenspeile de ulike metall sammensetningen av hver enhet konfigurasjon: Sixfors omfatter en metall impeller og lufting montering midt i kulturen, og media flasker tidligere brukt også nødvendig metall maskinvare. Den ministat benytter rustfritt stål nåler, men ingen andre metallkomponenter. Gener med økt uttrykk ble i stor grad forbundet med cellemembraner, men den biologiske betydningen av denne foreningen er uklart. Til slutt testet vi eksperimentell utvikling under disse forholdene. Etter 250 generasjoner av sulfat-begrenset vekst, viste 4/4 kloner testet fra 4 uavhengige utvikling populasjoner forsterkning av SUL1 som oppdaget av matrise Comparative Genomic Hybridisering (CGH, figur 2C). Dette resultatet er i samsvar med funnene i større volum chemostats over lignende tidsintervaller. 10 <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1.jpg" alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1highres.jpg"/> Figur 1. A. Design og arrangement av ministat array. B. Design av kulturen kammeret. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2.jpg" alt="Figur 2" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2highres.jpg"/> Figur 2. A. Experimental data som viser at kulturer oppnå likevekt innen ti generasjoner av vekst (n = 16). B. Expression data for tre biologiske replikater S1-3 samplet under steady state etter sulfat begrensning i forhold til en felles referanse vokst i en matchet sulfat-limited Sixfors chemostat . C. SUL1 presiseringer gjenfunnet i ministats etter 250 generasjoner av vekst i en sulfat-begrenset miljø. Genomisk DNA fra hver klon ble utviklet sammenlignet ancestral DNA av CGH som beskrevet. 21 Mean kopitall ble beregnet for hvert amplifisert region og er vist ved siden av hver amplikonet. Alle microarray data er avsatt i GEO database under tiltredelse GSE36691. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50262/50262fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays at JoVE.com

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Vi utviklet og validert en liten plassbruk rekke miniatyr chemostats bygget fra lett tilgjengelige deler til lav pris. Fysiologiske og eksperimentell evolusjon resultatene var lik større volum chemostats. Den ministat rekke gir en kompakt, billig og tilgjengelig plattform for tradisjonelle chemostat eksperimenter, funksjonell genomikk og kjemiske screening programmer.

Design og bruk av multipleksede Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays MEAs

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kartlegging Bakteriell Funksjonelle nettverk og veier i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Ved hjelp av syntetisk Genetiske Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

Fabrikasjon og bruk av mikromiljøet microarrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Montering av Nucleosomal Arrays fra Rekombinant kjerne Histoner og nukleosom Positioning DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design og analyse av temperaturpreferanseatferd og dens døgnrytme i Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Identifisere Protein-protein interaksjons nettsteder Bruke Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...