Name: design and use of multiplexed chemostat arrays
Uploaded: 2013-02-23T00:00:00
Duration: 19 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays at JoVE.com

Создание видео было поддержано грантами от Национального научно-исследовательский центр ресурсов (5P41RR011823-17) и Национального института общих медицинских наук (8 GM103533 P41-17) из Национального института здоровья. Эта работа была также поддержана грантом NSF 1120425. MJD является Rita Allen Foundation Scholar. AWM будет частично поддержана NIH T32 HG00035. Мы благодарим Анну Саншайн за помощь в улучшении протоколов. Кроме того, мы признаем, Сара DiRienzi, Селия Payen, и Эми Сирр в качестве первых пользователей ministats.

Используйте соответствующие стерильные техники по всему протокола. 1. Сборка частей для и подготовка массива Ministat <ol><li> Заказать все детали. </li><li> Очистка стеклянных трубок. Отметить труб на 20 мл. </li><li> Сделать пробки сборки с воздуха, средства массовой информации, и стоков портов и поместите их в верхней части очищенных стеклянных трубок культуры. </li><li> Подготовка камеры увлажнения и организовать все неавтоклавного части. </li><li> Сделать воздуха, стоков, труб и СМИ использованием достаточной длины трубы и муфты совместимы. </li><li> Подключите каждого типа труб (воздуха, средства массовой информации, и сточные воды), чтобы пробки и фольги сборки фильтров и средств массовой информации быстро подключить, чтобы подготовить их для автоклава. </li><li> Подготовка бутыль для использования в создании стерильной среды хемостат. </li><li> Подготовка бутылки культуры выборки, вставив два отверстия резиновой пробкой с соответствующими фитингами. Пленка каждого фильтра, чтобы подготовить их для автоклава. </li><li> Fiт собранного массива аккуратно в одном или нескольких лотков автоклав и автоклав все детали. </li><li> Марка и фильтрации хемостат средств массовой информации в автоклаве бутыли. </li></ol> 2. Настройка эксперимента <ol><li> Заполните каждый гидратации колбу с 700 мл DDH 2 O. </li><li> Поместите автоклавного ministats в комплект блока нагрева при заданной температуре. </li><li> Поместите авиакомпаний в 4-портовым многообразии и включите воздушный насос. </li><li> Подключите стоков линий на 100 мл бутылки коллекции. </li><li> Снимите фольгу с конца трубки СМИ и медиа-бутыли и подключить два быстрых соединяет. Пропустите каждую длину трубки насоса с помощью перистальтического насоса картриджа и нажмите их на место. Включите насос СМИ. </li><li> Пусть камеры заполнения. Выключите насос СМИ. </li><li> Спрей пробки собраний с 70% этанола и привить культуру с помощью шприца. Сохранить образец посевной в виде замороженного запаса глицеринаесли это необходимо. Пусть культуры растут в течение 30 часов. </li><li> Отрегулируйте высоту стоков иглу, пока культура громкость установлена ​​на 20 мл с потоком воздуха выключен. Это может занять несколько коррективов в течение часа. Когда закончите свою очередь потока воздуха обратно. </li><li> Поверните СМИ насос. </li><li> Очистка стоков бутылки отбора проб, которые содержат средства массовой информации, собранные во время установки рабочей культуры объеме, и записать время. </li><li> Для того, чтобы время от нуля измерение место стоков линии в стерильных пробирок в течение 15 мин-2 ч (в зависимости от объема вы хотите попробовать для анализа ДНК). Также убедитесь, глицерин замороженных наличии для каждой культуры в это время при желании. </li></ol> 3. Ежедневные измерения <ol><li> Как и в свое время нулевого измерения, образцы на льду в течение 15 мин-2 ч (как требуется для вашего эксперимента) на льду и записывать время пробы на ДНК и замороженных образцов складе. </li><li> Для образцов РНК либо собрать небольшой т.Уме с помощью шприца и 22G 5 &quot;иглу от культуры или откупорить каждый Ministat собрать всю культуру. Образцы должны быть приняты быстро, собирали путем фильтрации, и немедленно замораживали в жидком азоте. </li><li> Измерьте сточные воды собираются с последней выборки для каждого Ministat количественно разбавления. Отрегулируйте разбавления если это необходимо для перенастройки насоса установки или настройки точной настройки на отдельных линиях насоса. </li><li> Заменить стоков линии в пустые бутылки коллекции. </li><li> Количественная клеток / мл, а также другие конечные точки интереса и сделать глицерина замороженных запасов. </li></ol> 4. После эксперимента очистки <ol><li> Поместите все трубы в отдельные лотки и полоскания с чрезмерно DDH 2 O. Сухая трубка использованием аквариума насос. </li><li> Очистите пробку сборки с DDH 2 O и использовать иглы вставки для очистки иглы, аспирационных и дозирования воды по очереди. Протрите наружную поверхность иглы и пробки для удаленияостаточные средства массовой информации. </li><li> Очистите стеклянные трубки с водой и этанолом, и удалить физические загрязнители с 3 сжатой до Kimwipes и щипцы. </li><li> Промойте и высушите все детали снова перед использованием. </li></ol>

<ol>
	<li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R&#233;cherches+sur+la+Croissance+des+Cultures+Bacteriennes.">R&#233;cherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes.</a> Ann. I. Pasteur. 79, 390-410 (1950).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+the+chemostat.">Description of the chemostat.</a> Science. 15, 715-716 (1950).</li><li>Daran-Lapujade, P., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., de Winde, J. H., Pronk, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemostat-based+micro-array+analysis+in+baker's+yeast.">Chemostat-based micro-array analysis in baker's yeast.</a> Adv. Microb. Physiol. 54, 257-311 (2009).</li><li>ter Linde, J. J. M., Pronk, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transcriptional+analysis+of+aerobic+and+anaerobic+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 181, 7409-7413 (1999).</li><li>Boer, V., de Winde, J., Pronk, J., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome-wide+transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisiae+grown+on+glucose+in+aerobic+chemostat+cultures+limited+for+carbon,+nitrogen,+phosphorus,+or+sulfur.">The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur.</a> J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).</li><li>Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K., Oliver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+nutrient+control+of+gene+expression+in+Saccharomyces+cerevisiae+during+growth+and+starvation.">Global analysis of nutrient control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae during growth and starvation.</a> 101, 3148-3153 (2004).</li><li>Diderich, J. A., Kruckeberg, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Uptake+Kinetics+and+Transcription+of+HXT+Genes+in+Chemostat+Cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Glucose Uptake Kinetics and Transcription of HXT Genes in Chemostat Cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 274, 15350-15359 (1999).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria.">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).</li><li>Kubitschek, H. E., Bendigkeit, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+continuous+cultures.+I.+Dependence+of+mutational+response+upon+growth-limiting+factors.">Mutation in continuous cultures. I. Dependence of mutational response upon growth-limiting factors.</a> Mutation Res. 1, 113-120 (1964).</li><li>Gresham, D., Dunham, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+and+Dynamics+of+Evolutionary+Adaptations+to+Controlled+Nutrient-Limited+Environments+in+Yeast.">The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast.</a> PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).</li><li>Kao, K. C., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+clonal+interference+during+adaptive+evolution+in+asexual+populations+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).</li><li>Kvitek, D. J., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Sign+Epistasis+between+Frequently+Experimentally+Evolved+Adaptive+Mutations+Causes+a+Rugged+Fitness+Landscape.">Reciprocal Sign Epistasis between Frequently Experimentally Evolved Adaptive Mutations Causes a Rugged Fitness Landscape.</a> PLoS Genet. 7, e1002056 (2011).</li><li>Helling, R. B., Adams, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+during+Growth+in+a+Constant+Environment.">Evolution of Escherichia coli during Growth in a Constant Environment.</a> Genetics. 116, 349-358 (1987).</li><li>Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Evolution+in+Yeast:+A+Practical+Guide.">Experimental Evolution in Yeast: A Practical Guide.</a> Methods Enzymol. 470, (2010).</li><li>Hoskisson, P. A., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+-+making+a+comeback.">Continuous culture - making a comeback.</a> Microbiology. 151, 3153-3159 (2005).</li><li>Nanchen, A., Schicker, A., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+dependency+of+intracellular+fluxes+on+growth+rate+in+miniaturized+continuous+cultures+of+Escherichia+coli.">Nonlinear dependency of intracellular fluxes on growth rate in miniaturized continuous cultures of Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 1164-1172 (2006).</li><li>Klein, T., Schneider, K., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+miniaturized+stirred+bioreactors+for+parallel+continuous+cultivation+of+yeast+with+online+measurement+of+dissolved+oxygen+and+off-gas.">A system of miniaturized stirred bioreactors for parallel continuous cultivation of yeast with online measurement of dissolved oxygen and off-gas.</a> Biotechnol. and bioeng. , (2012).</li><li>Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+bacteria+undergoing+programmed+population+control+in+a+microchemostat.">Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat.</a> Science. 309, 137-140 (2005).</li><li>Groisman, A., Lobo, C., Cho, H., Campbell, J. K., Dufour, Y. S., Stevens, A. M., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chemostat+for+experiments+with+bacterial+and+yeast+cells.">A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells.</a> Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).</li><li>Brauer, M. J., Botstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Adjustment+and+Metabolic+Remodeling+in+Glucose-limited+Yeast+Cultures.">Homeostatic Adjustment and Metabolic Remodeling in Glucose-limited Yeast Cultures.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 2503-2517 (2005).</li><li>Torres, E. M., Amon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aneuploidy+on+Cellular+Physiology+and+Cell+Division+in+Haploid+Yeast.">Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast.</a> Science. 317, 916-924 (2007).</li><li>Regenberg, B., Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-rate+regulated+genes+have+profound+impact+on+interpretation+of+transcriptome+profiling+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Biology. 7, R107 (2006).</li><li>Castrillo, J. I., Oliver, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control+of+the+eukaryote+cell:+a+systems+biology+study+in+yeast.">Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast.</a> Journal of Biology. 6, 4 (2007).</li><li>Brauer, M. J., Botstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).</li><li>Ferenci, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+physiology,+regulation+and+mutational+adaptation+in+a+chemostat+environment.">Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment.</a> Adv. Microb. Physiol. 53, 169-229 (2008).</li></ol>

Авторы заявляют, что они не имеют никакого конфликта интересов.

Хемостата выращивания в ministats, как с любым хемостат, требует внимания к деталям и устранения неисправностей. Поскольку загрязнение вызывает большое беспокойство в непрерывных экспериментов культуру, мы обычно смотрят через микроскоп для бактериальные и грибковые загрязнения на прививки и каждые 50 поколений в течение длительных экспериментов эволюции. На сегодняшний день мы не наблюдали загрязнения через 96 экспериментов эволюции более 300 поколений (данные не показаны). Для проверки перекрестного загрязнения между ministats и потенциал для микробов, чтобы колонизировать культуры камере путем канализационная линия мы провели 16 ministats такие, что любой другой Ministat инокулировали дрожжей, как указано выше, а остальное не засевают любой культуры. Культуры были отобраны в коммунальную контейнер, который был освобожден через день. Таким образом, если бы это было возможно для загрязнителей войти через канализационная линия, мы вероятно бы отметить, что в этом experimENT. В течение трех недель и больше, чем 100 поколений роста в этом шахматном порядке привитых и не прививку культуры мы не наблюдаем рост в не привитый труб Ministat культуры, предполагая, что загрязнение от внешних дрожжей или другие микробы вряд ли произойдет в экспериментах Похожие сроки. Несмотря на то, ministats были предназначены для работы в моде аналогичных коммерческих хемостаты, модульная природа этого механизма позволяет оптимизацию в соответствии с потребностями пользователей и бюджет. Перистальтический насос, используемый в данном протоколе можно добиться расхода между 0,0186 об / час до 3,6 т. / ч (данные не представлены). Повышенный контроль разведение ставки могут быть достигнуты с альтернативными моделями насосов. Обратите внимание, что операции по более низким ставкам разбавления может потребовать замены высших иглы для достижения той же частоте капли доставки. Численность населения является важным фактором для правильного дизайна эволюции экспериментов.Стандартная ставка разведения и концентрации питательных веществ, используемые здесь обеспечивает относительно большой численностью населения (~ 10 9 клеток) того же порядка, что и опубликованные исследования эволюции 11. Большего или меньшего населения может быть сохранена путем изменения рабочего объема или ограничение концентрации питательных веществ. Увеличение мутации питания также может быть получен путем работы с штаммы с повышенной цены мутации. Ministats также может быть улучшен по сравнению с нынешней конструкции. Например конденсации может собрать на стенах культуры трубки и может быть значительно снижена при использовании глубокий водяной бане, инкубатор, или постоянной комнатной температуры. Хотя слипания и стены рост сульфата ограниченной культур представляется относительно редки, появляясь в 5/48 экспериментов эволюции на 300 поколений (данные не представлены), различные поверхностно-активные вещества имеются, которые могут помочь в уменьшении или задержку эту черту. В случае, если слипания мешает адекватной культурысмешивания, повышенное волнение может быть достигнута за счет сокращения числа способов каждого воздушного насоса разделен, либо путем добавления перемешивание аппарата. Дополнительные зонды для растворенного газа концентрации, рН, или другие параметры могут быть также включены, как и в некоторых других конструкций 17. Несмотря на потенциальные изменения, используя ministats, как описано в этом протоколе, мы наблюдали очень последовательно экспериментальные параметры и воспроизводимые результаты при сравнении наших устройство представила данные за больший объем коммерческих хемостаты. Это включает воспроизводимость клеточной физиологии, как видно по достижении стационарного равновесия в течение 10-15 поколений (рис. 2A) и получения аналогичных плотности культуры в равновесии. Моделей экспрессии генов были последовательны в трех биологических размножается в ministats и между ministats и коммерческих большим объемом платформы (рис. 2В), за исключением генов метаболизма железа. Эти ехрression различия, вероятно, вызвана изменениями в содержании металла из двух устройств или улучшения качества компонентов среды. Наши данные показывают, что ministats будет полезна для физиологии или конкуренции эксперименты, в которых последовательно окружающей среды не требуется. Чтобы проверить, если дизайн Ministat достаточно для экспериментальных приложений эволюции мы развивались культур под сульфат ограничение на 250 поколений и использоваться CGH для характеристики усиления в локусе SUL1 -. Отличительной чертой долгосрочного развития в этих условиях в большей хемостаты объемом 10 мы наблюдали Усиление SUL1 в клонах от 4/4 независимых экспериментов эволюции в сульфат-ограниченных средах (рис. 2С). В целом эти данные свидетельствуют о том, что ministats являются надежной платформой, которая может быть полезна для различных традиционных приложений хемостат. Хотя мы продемонстрировали их использование в культивировании почкующихся дрожжей, ministats должнытакже совместимы с другими организмами и аналогичных конструкций на самом деле были использованы для культивирования бактерий и других видов дрожжей. 16,17,25 Кроме того, меньший объем культуры и коррелирует снижение потребности в средствах массовой информации может сделать ministats привлекательной альтернативой для экспериментов, требующих дорогих или экзотических реагентами, как может быть в случае химической или генетической экранов.

Динамика микробного роста и развития являются основополагающими для микробиологии, экологии, генетики и биотехнологии. Наиболее распространенный метод культивирования микроорганизмов в партии, где клетки засевают при низкой плотности в богатой питательными веществами бульон и выращивали до насыщения. Хотя несложно выполнить с помощью стандартного лабораторного оборудования, партия культур испытывают колебания химической среде и, соответственно, изменения клеточной физиологии. Это гетерогенной среде роста может привести к вторичные эффекты роста и стрессов, которые могут маскировать тонкие физиологические различия. Экспериментальные эволюции последовательной передачи партия может выбрать для сложных смесей роста фазы конкретные субпопуляции, что усложняет попытки связать адаптации к конкретным селективных условиях. Измерение количественных фенотипов может быть затруднено из-за шума от неточного времени выборки и изменения функций, таких как временным лагом. Непрерывные культуры обеспечивают альтернативуРост режим, при котором клетки могут быть воспроизводимо выращивают в химически однородной среды на определенный темп роста для достижения физиологического устойчивом состоянии. Благодаря этим преимуществам, исследования экспериментальной эволюции и характеристики сотового состояния часто используют контролируемой среды непрерывного культур, как хемостат 14. Оценка этих преимуществ привело к возрождению интереса к хемостат культур 15. С момента их появления в 1950 году, 1,2 хемостат системы были разработаны для функционирования на различных масштабах от литра до мкл и для различных приложений 16. -19 Эти различные конструкции, которые варьируются от серийно выпускаемых биореакторов для glassblown судов пользовательских платформ микрофлюидики, доля общих принципах дизайна. Культура камеры перемешивают и газированные (как правило, путем пропускания воздуха через него) и микробов содержащихся в нем хранятся однородныеют рассеяны по всему культуры камеру во все времена. Свежий среде определенного состава добавляется постоянно и скорость добавления контролирует темп роста и влияет на химические среды, испытываемых культуры. Переполнение задает культура объем в росте трубку, и через это переполнение культуры будут взяты образцы с той же скоростью, при которой свежей среды входит. Таким образом культурами быстро добраться до физиологической устойчивое состояние, при котором многие биологические параметры остаются неизменными. Несмотря на преимущества хемостаты и отчеты об этих различных платформах в литературе, широкое распространение было ограничено трудности в строительстве и эксплуатации этих систем, и высокие расходы, связанные с коммерческой вариантов. Кроме описания того, как создавать и использовать эти устройства могут быть непрозрачными. Мы представляем образцы и инструкции по применению компактных массива миниатюрных хемостаты построены из легко доступных частей по низким ценам. Мы наблЭрве весьма последовательно экспериментальные параметры и воспроизводимые результаты при сравнении наших устройство представила данные за дрожжи культивировали в большем объеме коммерческие биореакторы. Это включает в себя воспроизводимость клеточной физиологии, как видно по достижении стационарного равновесия в течение 10-15 поколений и получения аналогичных плотности культуры в равновесии. Кроме того, модели экспрессии гена согласуются между ministats и коммерческих большего объема платформы. Устойчивость разбавления, оптической плотности и воспроизводимость экспрессии генов между тремя повторных культур продемонстрировать надежность нашей платформе. Мы также показываем, что же адаптивные мутации возникают по сравнению с аналогичными сроками экспериментальной эволюции как с большим объемом хемостаты.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии (по желанию) </td></tr><tr><td> 3/32 &quot;х 7/32&quot; силиконовой трубки </td><td> VWR </td><td> 63009-260 </td><td> Трубы: Заказ: (50 &#39;катушки упаковке) </td></tr><tr><td> 1/2 силиконовых &quot;х 5/8&quot; трубки (очень большой) </td><td> VWR </td><td> 63009-299 </td><td> Трубы: Заказ: (50 &#39;катушки упаковке) </td></tr><tr><td> 1/4 &quot;х 3/8&quot; силиконовой трубки (средний) </td><td> VWR </td><td> 63009-279 </td><td> Трубы: Заказ: (50 &#39;катушки упаковке) </td></tr><tr><td> Оранжевый Зеленый Marprene трубки насоса </td><td> Watson-Marlow </td><td> 978.0038.00 + </td><td> Трубы: Order: 6x (упаковка из 6) </td></tr><tr><td> Женский Luer, 1/8 &quot;шип </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45500-04 </td><td> Разъемы: Заказ: 4x (упаковка из 25) </td></tr><tr><td> Мужской Luer Lock, 1/8 &quot;шип </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45503-04 </td><td> Разъемы: Заказ: 1x (упаковка из 25) </td></tr><tr><td> Сокращение разъем, PVDF, 1/4 &quot;до 1/8&quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30703-50 </td><td> Разъемы: Заказ: 1x (упаковка из 10) </td></tr><tr><td> Колючая Y разъем, 1/8 &quot;ID </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-30703-92 </td><td> Разъемы: Заказ: 3x (упаковка из 10) </td></tr><tr><td> Средний зажимы труб </td><td> VWR </td><td> 63022-405 </td><td> Зажимы: Заказ: 1x (упаковка из 12) </td></tr><tr><td> День лабораторный зажим (металлический зажим для труб) </td><td> VWR </td><td> 21730-001 </td><td> Зажимы: Заказ: 1x (упаковка из 10) </td></tr><tr><td> Мужской встроенный клапанами быстрого соединения, подходит для труб: 1/4 дюйма </td><td> Рыбак </td><td> 05-112-39 </td><td> Разъемы: Заказ: 1x (упаковка из 25) </td></tr><tr><td> Женский встроенный клапанами быстрого соединения, подходит для труб: 1/4 дюйма ID, полипропилен </td><td> Рыбак </td><td> 05-112-37 </td><td> Разъемы: Заказ: 1x (комплект из 5) </td></tr><tr><td> Тихая воздушные насосы </td><td> <a href="http://www.aquariumguys.com/" target="_blank">Аквариум Guys.com</a> </td><td> 212422 </td><td> Air Supply: Заказ: 4 насосов </td></tr><tr><td> PTFE фильтр, 0,45 мкм, для фильтрации воздуха </td><td> Коул Parmeг </td><td> HV-02915-22 </td><td> Air Supply: Заказ: 1x (в коробке 100) </td></tr><tr><td> 1л Фляга с пистолетом </td><td> Рыбак </td><td> 10-181F </td><td> Air Supply: Order: 2x (Pack из 6) </td></tr><tr><td> № 8 силиконовые пробки, 3/8 в отверстие, для колб пистолет </td><td> Рыбак </td><td> K953715-0801 </td><td> Air Supply: заказ: 8 пробками </td></tr><tr><td> 4-портовый многообразии </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06464-85 </td><td> Air Supply: заказ: 8 многообразиях </td></tr><tr><td> 55 мл Винт трубы крышки культуры </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 9825-25 </td><td> Культура палаты: Заказ: 2x (упаковка из 48) </td></tr><tr><td> Регулярные подкожные белые центром иглы, 16G, 5 дюйма длиной канализационная линия </td&gt; <td> Рыбак </td><td> 14-817-105 </td><td> Культура палаты: Заказ: 1x (упаковка 100) </td></tr><tr><td> Спинной иглу крана </td><td> VWR </td><td> BD40836 </td><td> Культура палаты: Заказ: 4x (упаковка из 10) </td></tr><tr><td> Регулярные подкожные розовые иглы </td><td> Рыбак </td><td> 14-817-104 </td><td> Культура палаты: Заказ: 1x (упаковка 100) </td></tr><tr><td> Пена Силиконовые пробки размера &quot;2&quot;, розовая </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-06 </td><td> Культура палаты: Заказ: 2x (упаковка из 20) </td></tr><tr><td> 8-ну трубу стойки </td><td> VWR </td><td> 82024-452 </td><td> Культура палаты: Заказ: 4 стойки </td></tr><tr><td> 10L бутылью с нижней сливной шланг: вакуумные безопасной </td><td> VWR </td><td> 89001-530 </td><td> СМИ: Заказ: 2 или более </td></tr><tr><td> Желтая пробка силиконовой пеной, нестандартные размер 12 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-22 </td><td> СМИ: Заказ: 2 или более </td></tr><tr><td> Carboy вентиляции фильтра </td><td> Рыбак </td><td> SLFG 050 10 </td><td> СМИ: Заказ: 1x (упаковка из 10) </td></tr><tr><td> Электрические ленты, зеленая </td><td> <a href="http://Amazon.com" target="_blank">Amazon.com</a> </td><td> 10851-BA-10 </td><td> СМИ: заказ 1 рулон. </td></tr><tr><td> Бутылка верхнего фильтра, 1л, 0,2 мкм, 45 мм </td><td> VWR </td><td> 29442-978 </td><td> СМИ: Заказ: (1 случай из 12) </td></tr><tr><td> 5000 мл бутылью с нижней выход: вакуумит безопасной </td><td> VWR </td><td> 89003-384 </td><td> СМИ: (необязательно) </td></tr><tr><td> Синий пробки силиконовой пеной, nonstandardsize 10 1/2 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-18 </td><td> СМИ: (необязательно) </td></tr><tr><td> 205S/CA16, 16 картриджей насоса </td><td> Watson-Marlow </td><td> 020.3716.00A </td><td> Медиа насоса: заказ: 1 </td></tr><tr><td> 16-канальный 205CA расширение насоса </td><td> Watson-Marlow </td><td> 023.1401.000 </td><td> Медиа насоса: заказ: 2 расширение главы насоса </td></tr><tr><td> Силиконовый герметик аквариуме </td><td> Рыбак </td><td> S18180B </td><td> Медиа насоса: заказ: 1 </td></tr><tr><td> 6-блок сухой ванне </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Теплоблока: заказ: 2 для 32 ministats или 1 на 16. </td></tr><tr><td> Блок для drybath, 6 х 25 мм пробирки в блок </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Теплоблока: Order: 12 на 32 ministats или 6 на 16. </td></tr><tr><td> Нейлон мембранные фильтры, размером пор 0,45 мкм; Диаметр: 25 мм. </td><td> Рыбак </td><td> R04SP02500 </td><td> Сбор урожая: Заказ: 1x (комплект из 100) (опционально) </td></tr><tr><td> Нейлон мембранные фильтры, размером пор 0,45 мкм, 45 мм </td><td> Рыбак </td><td> R04SP04700 </td><td> Сбор урожая: Заказ: 1x (комплект из 100) (опционально) </td></tr><tr><td> 47 мм, большой фильтр аппарата </td><td> Рыбак </td><td> XX10 047 30 </td><td> Сбор урожая: Заказ: 1 (опционально) </td></tr><tr><td> Glaсс держатель фильтра, 25 мм, небольшой фильтр аппарата </td><td> VWR </td><td> 26316-692 </td><td> Сбор урожая: Заказ: 1 (опционально) </td></tr><tr><td> Сосуд Дьюара, 1л для жидкого азота </td><td> VWR </td><td> 63380-052 </td><td> Сбор урожая: Заказ: 1 (опционально) </td></tr></tbody></table>

design and use of multiplexed chemostat arrays

Хемостаты непрерывных систем культуры, в которой клетки выращивают в жестко контролируемой, химически постоянной среде, где культура плотностью ограничен предельным конкретных питательных веществ. 1,2 Данные хемостаты являются высокая воспроизводимость для измерения количественных фенотипов, поскольку они обеспечивают постоянную скорость роста и окружающей среде в стационарном состоянии. По этим причинам, хемостаты стали полезным инструментом для мелкомасштабных характеристик физиологию через анализ экспрессии генов 3-6 и другие характеристики культуры в стационарном состоянии равновесия. 7 Долгосрочные эксперименты в хемостаты можно выделить конкретные траектории, микробных популяций принять в процессе адаптивной эволюции в контролируемой среде. В самом деле, хемостаты были использованы для экспериментальной эволюции с момента их изобретения. 8 общий результат эволюции экспериментов для каждой биологической повторных приобрести уникальный репертуар мутации. 9-13 Такое разнообразие позволяет предположить, что еще есть много предстоит открыть, выполнив эволюции эксперименты с гораздо большей пропускной способностью. Мы приведем здесь проектирования и эксплуатации относительно простых, низкая стоимость массив миниатюрных хемостаты или ministats и проверки их использование в определении физиологии и эволюции эксперименты с дрожжами. Такой подход влечет за собой рост десятков хемостаты работать от одного мультиплексированных перистальтического насоса. Культур поддерживается на уровне 20 мл рабочего объема, что является практичным для различных приложений. Мы надеемся, что увеличение пропускной способности, снижения расходов и предоставления подробной строительства и эксплуатации инструкции могут также стимулировать научные исследования и промышленного применения этой конструкции в качестве общей платформы для функционально характеризующих большого числа штаммов, видов и параметров роста, а также генетические или библиотек наркотиков.

Массив Ministat описано выше и в (рис. 1а, б) была использована для культуры гаплоидных Мата лабораторного штамма дрожжей бутонизации (S288c) в сульфат-предельных условиях, как описано выше 10. Мы протестировали эффективность для общего применения хемостат в том числе определение физиологии и экспериментальной эволюции. Для проверки ministats, мы повторили несколько экспериментов, которые ранее выполнялись в промышленных ферментеров модифицированы для использования хемостат. 10,20,21 ATR Sixfors ферментеров были проведены в 300 мл рабочего объема, в десять раз объем ministats, и имеют значительно различных режимах аэрации культуры и агитации. Мы попытались воспроизвести оборудование стабильность, устойчивое состояние физиологии, экспериментальные результаты эволюции, и закономерности экспрессии генов, полученных с этих ферментеров. Так как равномерность скорости разбавления и аэрация являются важными аспектами хемостат дизайн, мы меняasured фактическая скорость разбавления в 32 ministats после 15 поколений роста и обнаружил, что с целевой скорости разбавления 0,17 об / ч (4-5 капель / мин) мы получили среднюю скорость разбавления 0,17208 со стандартным отклонением 0,0075 через 32 повторностях. Этот диапазон был в пределах нашего типичного допуск + / -0,01 об / час отличие от целевых показателей, за которыми масштабные изменения в экспрессии генов наблюдается. 22-23 на 4 ministats расхода воздуха была определена в 307,5 ​​мл / мин при стандартном отклонении 9,57 мл / мин. Это означает, что поток воздуха в камеры является надежной и равномерно распределены между 4 камер и ценность, аналогичной описанной для аэрации в промышленных ферментеров 20. Ранее мы наблюдали периодические усиления высоким сродством серы-ионных транспортеров SUL1 в 8/8 сульфат ограниченной эволюции экспериментах на дрожжах 10. Учитывая согласованность результатов по Тхис условием мы выбрали сульфатно-ограничения для проверки способности нашей системы. Необходимого элемента хемостатной культуры является необходимость поддержания постоянной химической среде. Колебания в изобилии является важнейшим питательным веществом или другим изменениям в окружающей среде, как правило, приводят к изменению количества клеток в той или иной культуры. Мы измеряли оптическую плотность в качестве прокси для числа клеток (рис. 2A) и воспроизводимость измерений в 16 повторных культур, найти среднюю A600 от 1,12 (~ 10 9 клеток) после ~ 15 поколений роста со стандартным отклонением 0,057 единиц, или на 5,1 %. Для сравнения, измерения, сделанные из 4 повторных культур, выращенных в промышленных ферментеров показал, стандартное отклонение 2,5%. Клетки были хорошо смешиваются в камере роста: измерение OD и клеток, взятых из сточных водах дорожке были эквивалентны образцы, взятые непосредственно из культуры трубки (данные не представлены). Эти результаты свидетельствуют о надежности нашей платформыD способности поддерживать постоянную химическую среду в аналогичной толерантности как промышленный ферментер. В более чувствительны считывания физиологии, мы сравнили генома устойчивой экспрессии генов государства от культур, выращенных в сульфат ограничения в ministats и в промышленном ферментере. Экспрессия генов в ministats показал высокую степень сходства в трех биологических повторяет (рис. 2В). Ранее мы отметили, что для РНК, полученных из двух одинаковых хемостаты Sixfors и сотрудничество гибридизовали с микрочипов, выражение 99% генов снизилась, в пределах 1,5-кратный диапазон, что позволяет использовать 1.5X как эмпирическое значение отсечки 21. Экспрессия генов от три одинаковых ministats, по сравнению попарно, показали 99% генов снизилась, в пределах 1.5-1.7 раза диапазон, сопоставимый с результатами промышленных ферментеров. Трех образцов гибридизовали отдельных массивов и парных отношений рассчитывается после этого, так что эти васифилиса включают, в частности массива шума в дополнение к биологическим шум, возможно, переоценивает различия между повторяет по сравнению с опубликованными, со-гибридизированных результаты. 138 генов дифференциально экспрессируются&gt; в 1,5 раза во всех трех повторностях Ministat по сравнению с образцом собраны из соответствующих культура выращивается в промышленных ферментер. Гены снизилась в выражение в ministats были сильно обогащенные для метаболизма железа. Эта подпись может отражать различные композиции из металла каждой конфигурации устройства: Sixfors устройство включает в себя рабочее колесо металл и аэрации сборки погружен в культуру и средства массовой информации бутыли ранее использовались также требуется металлоконструкций. Ministat используются иглы из нержавеющей стали, но никаких других металлических компонентов. Гены с повышенной экспрессией были в значительной степени связан с клеточными мембранами, хотя биологическое значение этой ассоциации остается неясным. Наконец, мы протестировали экспериментальный недеформированной эволюцииГ эти условия. После 250 поколений сульфатно-ограниченный рост, 4/4 клонов испытания с 4 независимыми развивается населения показали усиление SUL1 как обнаружено множество сравнительной геномной гибридизации (CGH, рисунок 2С). Этот результат согласуется с выводами в большем объеме хемостаты по сравнению с аналогичными интервалами времени 10. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1.jpg" alt="Рисунок 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1highres.jpg"/> Рисунок 1. А. Конструкция и расположение массива Ministat. B. Дизайн культуры камеру. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2.jpg" alt="Рисунок 2" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2highres.jpg"/> Рисунок 2. А. Experimental данные, свидетельствующие о том, что культуры достижения равновесия в течение десяти поколений роста (п = 16). В. Выражение данные за три биологических повторяет S1-3 пробы в устойчивом состоянии под сульфат ограничения по сравнению с общим опорным выращенных в соответствие сульфата ограниченной хемостат Sixfors . C. SUL1 усилений восстановлены в ministats через 250 поколений роста сульфата ограниченной среде. Геномной ДНК из каждого клона развивались по сравнению с родовой ДНК, как описано CGH 21. Среднее число копий рассчитывается для каждого региона усиливаются и показывается рядом с каждым ампликона. Все микрочипов данные хранятся в базе данных GEO при присоединении GSE36691. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50262/50262fig2large.jpg" target="_blank">Нажмите, чтобы увеличить цифру.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays at JoVE.com

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Мы разработаны и утверждены компактных массива миниатюрных хемостаты построены из легко доступных частей для низкой стоимости. Физиологические и экспериментальные результаты эволюции были похожи на большие хемостаты объеме. Массив Ministat обеспечивает компактную, недорогую и доступную платформу для традиционных экспериментов хемостат, функциональной геномики и приложения химического скрининга.

Разработка и использование Мультиплексированный массивы хемостата

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

Микрожидкостных фишки Контролируемые с массивами эластомерных Microvalve

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

Анализ биоэлектрического Osseointegrated Интеллектуальная система Дизайн имплантатов для Инвалиды

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays MEAs

Как культуре, запись и стимулировать нейронных сетей на микро-электрод массивы (МЭС)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Профилирование Предварительно микро-РНК и микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени (КПЦР) Массивы

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

Мультиплексированный Флуорометрический Методология тестирования иммунологического анализа и устранение неисправностей

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Сопоставление бактериальных функциональных сетей и путей в<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Использование синтетических генетических массивы

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

Изготовление и использование микроокружения микрочипов (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Ассамблея нуклеосомной массивов из рекомбинантных стержневых гистонов и позиционированием нуклеосом ДНК

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Дизайн и анализ поведения предпочтения температуры и его циркадный ритм в Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Выявление белок-белковых сайтов взаимодействие по пептидов массивов

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...