Name: design and use of multiplexed chemostat arrays
Uploaded: 2013-02-23T00:00:00
Duration: 19 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays at JoVE.com

Skapandet av videon har finansierats med bidrag från National Center for Research Resources (5P41RR011823-17) och National Institute of General Medical Sciences (8 P41 GM103533-17) från National Institutes of Health. Detta arbete stöddes också av NSF bidrag 1.120.425. MJD är en Rita Allen Foundation Scholar. AWM stöds delvis av NIH T32 HG00035. Vi tackar Anna Sunshine för hjälp med att förbättra protokoll. Dessutom erkänner vi Sara DiRienzi, Celia Payen, och Amy Sirr som tidiga användare av ministats.

Använd lämplig steril teknik i hela protokollet. 1. Montering delar för och förbereda Ministat Array <ol><li> Beställ alla delar. </li><li> Rengör glasrör. Markera rören vid 20 ml volym. </li><li> Gör kork församlingar med luft, media och utflödet hamnar och placera dem på toppen av de rengjorda glasrör kultur. </li><li> Förbered befuktning kammare och ordna alla icke-autoklaverade delar. </li><li> Gör luft, avloppsvatten och media rör med tillräcklig slangar längder och kompatibel kopplingar. </li><li> Anslut varje typ av slang (luft, media och avloppsvatten) till kork församlingar och filter folie och media quick-anslutning för att förbereda dem för autoklav. </li><li> Förbered en damejeanne för användning vid framställning sterilt kemostat mediet. </li><li> Förbered flaskorna kultur provtagning genom att sätta en två hål gummipropp med lämpliga tillbehör. Folie varje filter för att förbereda dem för autoklav. </li><li> Fit den sammansatt apparat prydligt i en eller flera autoklav brickor och autoklaveras alla delar. </li><li> Gör och filtrera kemostat medier i autoklaverade dunkar. </li></ol> 2. Ställa in ett experiment <ol><li> Fyll varje hydrering kolv med 700 ml DDH 2 O. </li><li> Placera autoklaverade ministats i värmeblocket inställd på önskad temperatur. </li><li> Placera flygbolagen i 4-ports grenrör och slå på luftpumpen. </li><li> Anslut utflödet ledningar till 100 ml samling flaskor. </li><li> Ta bort folien från slutet av media rör och media damejeanne och anslut två snabb ansluter. Trä varje längd av pumpslang genom en peristaltisk pump patron och klicka på dem på plats. Slå på mediernas pumpen. </li><li> Låt kamrarna fylla. Stäng av medierna pumpen. </li><li> Spraya kork aggregaten med 70% etanol och inokulera kulturer med användning av en spruta. Spara ett prov av inokulum som en frusen glycerol-lagerom så önskas. Låt kulturerna växa under 30 timmar. </li><li> Justera höjden av utflödet nålen tills kulturen volymen är inställd på 20 ml med luftflödet avstängd. Det kan ta flera justeringar under loppet av en timme. När klar slår luftflödet igen. </li><li> Vänd media pumpen. </li><li> Töm avloppsvatten provtagning flaskor, som innehåller material samlats när du ställer arbetskultur volym och registrera tiden. </li><li> Att ta en time-nollmätning plats de utflödet linjerna till sterila uppsamlingsrör för 15 minuter-2 timmar (beroende på vilken volym du vill prova för DNA-analys). Också göra en glycerol fryst lager för varje kultur vid denna tid om så önskas. </li></ol> 3. Dagliga mätningar <ol><li> Som med din tid noll mätning, prov på is i 15 min-2 h (som krävs för experimentet) på is och registrera den tid prov för DNA och frysta prover lager. </li><li> För RNA-prover samlas antingen en liten volymUme med spruta och 22G 5 &quot;nålen från kulturen eller korka varje ministat att skörda hela kulturen. Proverna skall tas snabbt upp genom filtrering och fryses omedelbart i flytande kväve. </li><li> Mät det utflöde som samlats sedan den senaste provtagningen för varje ministat att kvantifiera utspädning takt. Justera utspädning priser om det behövs genom att justera pumpens inställning eller avstämning av finjustera på enskilda pump linjer. </li><li> Ersätt utflödet linjer i tomma samling flaskor. </li><li> Kvantifiera celler / ml samt andra slutpunkter av intresse och gör en glycerol fryst lager. </li></ol> 4. Post-experiment Cleanup <ol><li> Placera alla rör i separata fack och skölj överdrivet med DDH 2 O Torr slangen med ett akvarium pump. </li><li> Rengör kork församlingar med DDH 2 O och använd nål insats för att rengöra nålar, aspirera och fördela vatten i tur. Torka utsidan av nålar och kork för att avlägsna eventuelltkvarvarande media. </li><li> Rengör glasrör med vatten och etanol, och ta bort fysiska föroreningar med 3 balled upp Kimwipes och pincett. </li><li> Skölj och torka alla delar igen före användning. </li></ol>

<ol>
	<li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R&#233;cherches+sur+la+Croissance+des+Cultures+Bacteriennes.">R&#233;cherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes.</a> Ann. I. Pasteur. 79, 390-410 (1950).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+the+chemostat.">Description of the chemostat.</a> Science. 15, 715-716 (1950).</li><li>Daran-Lapujade, P., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., de Winde, J. H., Pronk, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemostat-based+micro-array+analysis+in+baker's+yeast.">Chemostat-based micro-array analysis in baker's yeast.</a> Adv. Microb. Physiol. 54, 257-311 (2009).</li><li>ter Linde, J. J. M., Pronk, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transcriptional+analysis+of+aerobic+and+anaerobic+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 181, 7409-7413 (1999).</li><li>Boer, V., de Winde, J., Pronk, J., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome-wide+transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisiae+grown+on+glucose+in+aerobic+chemostat+cultures+limited+for+carbon,+nitrogen,+phosphorus,+or+sulfur.">The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur.</a> J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).</li><li>Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K., Oliver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+nutrient+control+of+gene+expression+in+Saccharomyces+cerevisiae+during+growth+and+starvation.">Global analysis of nutrient control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae during growth and starvation.</a> 101, 3148-3153 (2004).</li><li>Diderich, J. A., Kruckeberg, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Uptake+Kinetics+and+Transcription+of+HXT+Genes+in+Chemostat+Cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Glucose Uptake Kinetics and Transcription of HXT Genes in Chemostat Cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 274, 15350-15359 (1999).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria.">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).</li><li>Kubitschek, H. E., Bendigkeit, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+continuous+cultures.+I.+Dependence+of+mutational+response+upon+growth-limiting+factors.">Mutation in continuous cultures. I. Dependence of mutational response upon growth-limiting factors.</a> Mutation Res. 1, 113-120 (1964).</li><li>Gresham, D., Dunham, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+and+Dynamics+of+Evolutionary+Adaptations+to+Controlled+Nutrient-Limited+Environments+in+Yeast.">The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast.</a> PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).</li><li>Kao, K. C., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+clonal+interference+during+adaptive+evolution+in+asexual+populations+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).</li><li>Kvitek, D. J., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Sign+Epistasis+between+Frequently+Experimentally+Evolved+Adaptive+Mutations+Causes+a+Rugged+Fitness+Landscape.">Reciprocal Sign Epistasis between Frequently Experimentally Evolved Adaptive Mutations Causes a Rugged Fitness Landscape.</a> PLoS Genet. 7, e1002056 (2011).</li><li>Helling, R. B., Adams, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+during+Growth+in+a+Constant+Environment.">Evolution of Escherichia coli during Growth in a Constant Environment.</a> Genetics. 116, 349-358 (1987).</li><li>Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Evolution+in+Yeast:+A+Practical+Guide.">Experimental Evolution in Yeast: A Practical Guide.</a> Methods Enzymol. 470, (2010).</li><li>Hoskisson, P. A., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+-+making+a+comeback.">Continuous culture - making a comeback.</a> Microbiology. 151, 3153-3159 (2005).</li><li>Nanchen, A., Schicker, A., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+dependency+of+intracellular+fluxes+on+growth+rate+in+miniaturized+continuous+cultures+of+Escherichia+coli.">Nonlinear dependency of intracellular fluxes on growth rate in miniaturized continuous cultures of Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 1164-1172 (2006).</li><li>Klein, T., Schneider, K., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+miniaturized+stirred+bioreactors+for+parallel+continuous+cultivation+of+yeast+with+online+measurement+of+dissolved+oxygen+and+off-gas.">A system of miniaturized stirred bioreactors for parallel continuous cultivation of yeast with online measurement of dissolved oxygen and off-gas.</a> Biotechnol. and bioeng. , (2012).</li><li>Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+bacteria+undergoing+programmed+population+control+in+a+microchemostat.">Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat.</a> Science. 309, 137-140 (2005).</li><li>Groisman, A., Lobo, C., Cho, H., Campbell, J. K., Dufour, Y. S., Stevens, A. M., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chemostat+for+experiments+with+bacterial+and+yeast+cells.">A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells.</a> Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).</li><li>Brauer, M. J., Botstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Adjustment+and+Metabolic+Remodeling+in+Glucose-limited+Yeast+Cultures.">Homeostatic Adjustment and Metabolic Remodeling in Glucose-limited Yeast Cultures.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 2503-2517 (2005).</li><li>Torres, E. M., Amon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aneuploidy+on+Cellular+Physiology+and+Cell+Division+in+Haploid+Yeast.">Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast.</a> Science. 317, 916-924 (2007).</li><li>Regenberg, B., Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-rate+regulated+genes+have+profound+impact+on+interpretation+of+transcriptome+profiling+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Biology. 7, R107 (2006).</li><li>Castrillo, J. I., Oliver, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control+of+the+eukaryote+cell:+a+systems+biology+study+in+yeast.">Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast.</a> Journal of Biology. 6, 4 (2007).</li><li>Brauer, M. J., Botstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).</li><li>Ferenci, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+physiology,+regulation+and+mutational+adaptation+in+a+chemostat+environment.">Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment.</a> Adv. Microb. Physiol. 53, 169-229 (2008).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Kemostat odling i ministats, som med alla kemostat kräver uppmärksamhet på detaljer och felsökning. Eftersom föroreningar är av stor oro i kontinuerlig odling experiment ser vi vanligtvis via mikroskop för bakterier och svampar föroreningar vid ympning och var 50 generationer under långsiktiga utvecklingen experiment. Hittills har vi inte observerat kontaminering över 96 evolution experiment större än 300 generationer (data ej visade). För att testa korskontaminering mellan ministats och potentialen för mikrober att kolonisera odlingskammare via utflödet linjen vi körde 16 ministats så att varannan ministat ympades med jäst som ovan och resten var inte ympas med någon kultur. Odlingarna provtogs i en gemensam avfallsbehållare, som tömdes varannan dag. Alltså, om det vore möjligt för föroreningar att komma in genom den utgående linje vi sannolikt skulle ha observerat att i detta experiment. Under tre veckor och mer än 100 generationer av tillväxt i denna rutmönster av ympade och icke-ympade kulturer vi inte observerar tillväxten i icke-ympade ministat odlingsrör, vilket tyder på att föroreningar utifrån jäst eller andra mikrober är osannolikt att ske i experiment liknande tidsramar. Även om ministats var utformade för att fungera på ett sätt analogt med kommersiella kemostater medger modulära karaktären av detta arrangemang för optimering för att passa användarnas behov och budget. Den peristaltiska pumpen som används i detta protokoll kan uppnå flödeshastigheter mellan 0,0186 vol / h till 3,6 vol / h (data ej visade). Ökad kontroll över utspädning priser skulle kunna uppnås med alternativa pumpmodeller. Observera att drift vid lägre utspädningsgrader kan kräva ersättning av en högre nål för att uppnå samma frekvens droppe leverans. Befolkningens storlek är en viktig faktor för korrekt utformning av evolutionen experiment.Standarden utspädning ränta och koncentrationen av näringsämnen som används här ger en relativt stor befolkning storlek (~ 10 9 celler) av samma storleksordning som publicerats evolution studier. 11 Större eller mindre populationer kan upprätthållas genom att ändra arbetsvolym eller begränsa koncentrationen av näringsämnen. Ökad mutation utbudet kan också erhållas genom att arbeta med stammar med förhöjda mutation priser. De ministats skulle också kunna förbättras över vår nuvarande utformning. Exempelvis kondens kan ansamlas på väggarna odlingsrör och kan minskas väsentligt genom användning av en djup vattenbad, inkubator, eller rum med konstant temperatur. Även klumpar och vägg tillväxt sulfat begränsade kulturer verkar vara relativt sällsynt, förekommer i 5/48 evolution experiment med 300 generationer (data visas inte), en mängd tensider är tillgängliga som kan hjälpa minska eller fördröja denna egenskap. I händelse av att klumpbildning stör tillräcklig kulturblandning, ökad omröring kan åstadkommas genom att minska antalet olika sätt varje luftpump delas, eller genom tillsats av en omrörare. Ytterligare prober för löst gas koncentration, pH, eller andra parametrar kan också inkluderas liksom i en del andra konstruktioner. 17 Trots potentiella ändringar, med hjälp av ministats som beskrivs i detta protokoll, observerade vi mycket konsekvent experimentella parametrar och reproducerbara resultat när man jämför vår enhet till rapporterade data för större volymer kommersiella kemostater. Detta inkluderade reproducerbarhet av cellulär fysiologi sett genom nå steady state jämvikt inom 10-15 generationer (figur 2A) och erhålla liknande kultur densiteter vid jämvikt. Gene expression patterns var konsekvent mellan tre biologiska replikat i ministats och mellan ministats och kommersiella stora volymer plattformar (Figur 2B), med undantag av gener järn metabolism. Dessa expression skillnader troligen orsakade av förändringar i metallinnehåll av de två enheterna eller förbättringar i kvaliteten på media ingredienser. Våra data tyder på att ministats kommer att vara användbar för fysiologi eller tävling experiment där en konsekvent miljö krävs. För att testa om ministat designen är tillräcklig för experimentell utveckling applikationer vi utvecklade kulturer enligt sulfat begränsning för 250 generationer och används CGH att karakterisera förstärkning på SUL1 locus -. Kännetecknande för långsiktiga utvecklingen under dessa förhållanden i större volymer kemostater 10 Vi observerade amplifiering av SUL1 i kloner från 4/4 oberoende evolution experiment i sulfat-begränsad media (Figur 2C). Sammantaget antyder dessa data att ministats är en stabil plattform som kan vara användbara för en mängd olika traditionella kemostat applikationer. Även om vi visade deras användning i odling knoppande jäst, de ministats böräven kompatibel med andra organismer och liknande konstruktioner faktiskt har använts för odling av bakterier och andra arter jäst. kan göra ministats ett attraktivt alternativ för experiment som kräver 16,17,25 dessutom den mindre kultur volym och korrelerad minskat behov av media dyrt eller exotiska reagens som kan vara fallet i kemiska eller genetiska skärmar.

Dynamiken i mikrobiell tillväxt och utveckling är grundläggande för mikrobiologi, ekologi, genetik och bioteknik. Den vanligaste metoden för odling mikrober är satsvis, där celler inokuleras vid låg densitet i näringsrik buljong och odlades till mättnad. Även enkel att utföra med standard laboratorieutrustning, batch kulturer upplever en fluktuerande kemisk miljö och motsvarande förändring cellulär fysiologi. Denna heterogena tillväxtmiljö kan resultera i sekundära tillväxt och stress effekter som kan maskera subtila fysiologiska skillnader. Experimentell evolution genom seriell parti överföring kan välja för komplexa blandningar av tillväxt-fas specifika undergrupper, komplicerar försök att ansluta anpassningar till specifika selektiva betingelser. Mätning av kvantitativa fenotyper kan vara svårt på grund av buller från oprecis prov timing och variation i funktioner som fördröjning. Kontinuerliga kulturer ger ett alternativtillväxt regim där celler kan reproducerbart odlas i ett kemiskt homogen miljö vid en definierad tillväxt för att nå ett fysiologiskt steady state. På grund av dessa fördelar, studier av experimentell utveckling och karakterisering av cellulära tillstånd använder ofta kontrollerad miljö av kontinuerliga kulturer som kemostat. 14 Värdering av dessa fördelar har lett till ett uppsving i intresset för kemostat kulturer. 15 Sedan de infördes 1950, har 1,2 kemostat system utvecklats för att fungera på en mängd olika skalor, från liter till mikroliter och för en mängd olika tillämpningar. 16 -19 Dessa olika utföranden, som sträcker sig från kommersiellt producerade bioreaktorer till glassblown fartyg till anpassade mikrofluidik plattformar, dela allmänna konstruktionsprinciper. En kultur kammare rörs och luftas (vanligtvis genom bubbling av luft genom det) och mikroberna däri hålls homogenaly dispergerat genom odlingskammare vid alla tidpunkter. Färskt medium med definierad komposition tillsätts kontinuerligt och tillsatshastigheten reglerar tillväxthastigheten och påverkar den kemiska miljön som upplevs av kulturen. Ett överflöde sätter odlingsvolymen i tillväxten röret, och genom denna bräddavlopp kulturen kommer att samplas vid samma takt som färskt medium in. På detta sätt kulturerna når snabbt ett fysiologiskt stationärt tillstånd vid vilken många biologiska parametrar förblir konstanta. Trots fördelarna med kemostater och rapporterna från dessa olika plattformar i litteraturen, har allmänt antagande begränsats av svårigheter att bygga och driva dessa system, och höga kostnader som är förknippade med kommersiella alternativ. Dessutom beskrivningar av hur man gör och använder dessa enheter kan vara ogenomskinligt. Vi presenterar design och instruktioner för användning av en liten fotavtryck uppsättning miniatyr kemostater byggda från lättillgängliga delar till låg kostnad. Vi obsErve mycket konsekvent experimentella parametrar och reproducerbara resultat när man jämför vår enhet till rapporterade data för jäst odlas i större volymer kommersiella bioreaktorer. Detta inkluderar reproducerbarhet cellulär fysiologi sett genom att nå steady state jämvikt inom 10-15 generationer och få liknande kultur densiteter vid jämvikt. Dessutom genuttryck mönster är konsekventa mellan ministats och en kommersiell större volym plattform. Stabilitet av utspädning takt, optisk densitet och reproducerbarhet av genuttryck mellan tre likadana kulturer visar robustheten i vår plattform. Vi visar också att samma adaptiva mutationer uppstår jämfört med liknande experimentella evolution tidsskalor som med större volym kemostater.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> 3/32 &quot;x 7/32&quot; silikonslang </td><td> VWR </td><td> 63009-260 </td><td> Slang: Beställ: (50 &#39;spolpaketet) </td></tr><tr><td> 1/2 &quot;x 5/8&quot; silikonslang (extra stor) </td><td> VWR </td><td> 63009-299 </td><td> Slang: Beställ: (50 &#39;spolpaketet) </td></tr><tr><td> 1/4 &quot;x 3/8&quot; silikonslang (medium) </td><td> VWR </td><td> 63009-279 </td><td> Slang: Beställ: (50 &#39;spolpaketet) </td></tr><tr><td> Orange grön Marprene pumpslang </td><td> Watson-Marlow </td><td> 978.0038.00 + </td><td> Slang: Order: 6x (paket om 6) </td></tr><tr><td> Honluerkoppling, 1/8 &quot;hulling </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45.500-04 </td><td> Anslutningar: Beställ: 4x (pack 25) </td></tr><tr><td> Man luer lås, 1/8 &quot;hulling </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45.503-04 </td><td> Anslutningar: Ordning: 1x (pack av 25) </td></tr><tr><td> Minska kontakt, &quot;till 1/8&quot; PVDF, 1/4 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30.703-50 </td><td> Anslutningar: Ordning: 1x (paket om 10) </td></tr><tr><td> Barbed Y-kontakt, 1/8 &quot;ID </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-30.703-92 </td><td> Anslutningar: Beställ: 3x (paket om 10) </td></tr><tr><td> Medium slangklämmor </td><td> VWR </td><td> 63022-405 </td><td> Klämmor: Beställ: 1x (paket om 12) </td></tr><tr><td> Dag Pinchcock (metallklämma för slang) </td><td> VWR </td><td> 21730-001 </td><td> Klämmor: Beställ: 1x (paket om 10) </td></tr><tr><td> Man inline ventil snabb kontakt, Passar slang: 1/4 tum </td><td> Fisher </td><td> 05-112-39 </td><td> Anslutningar: Ordning: 1x (pack av 25) </td></tr><tr><td> Kvinna inline ventil snabb-kontakt, Passar slang: 1/4 tum ID, polypropylen </td><td> Fisher </td><td> 05-112-37 </td><td> Anslutningar: Ordning: 1x (pack om 5) </td></tr><tr><td> Silent luftpumpar </td><td> <a href="http://www.aquariumguys.com/" target="_blank">Akvarium Guys.com</a> </td><td> 212.422 </td><td> Lufttillförsel: Beställ: 4 pumpar </td></tr><tr><td> PTFE filter, 0,45 um, för luftfiltrering </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-02.915-22 </td><td> Lufttillförsel: Beställ: 1x (förpackning med 100) </td></tr><tr><td> 1L flaska med pistol </td><td> Fisher </td><td> 10-181F </td><td> Lufttillförsel: Beställ: 2x (pack 6) </td></tr><tr><td> # 8 silikon propp, 3/8 i hål, för sidoarm kolvar </td><td> Fisher </td><td> K953715-0801 </td><td> Lufttillförsel: Beställ: 8 proppar </td></tr><tr><td> 4-Port grenrör </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.464-85 </td><td> Lufttillförsel: Beställ: 8 grenrör </td></tr><tr><td> 55 ml Skruvlock odlingsrör </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 9825-25 </td><td> Odlingskammare: Beställ: 2x (pack 48) </td></tr><tr><td> Regelbunden hypodermisk vit nav nål, 16G, 5 tum längd för utloppsledningen </td&gt; <td> Fisher </td><td> 14-817-105 </td><td> Odlingskammare: Beställ: 1x (paket om 100) </td></tr><tr><td> Spinal Tap nål </td><td> VWR </td><td> BD40836 </td><td> Odlingskammare: Beställ: 4x (paket om 10) </td></tr><tr><td> Regelbunden subkutan rosa nål </td><td> Fisher </td><td> 14-817-104 </td><td> Odlingskammare: Beställ: 1x (paket om 100) </td></tr><tr><td> Skum Silikon propp storlek &quot;2&quot;, rosa </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.298-06 </td><td> Odlingskammare: Beställ: 2x (pack 20) </td></tr><tr><td> 8-Well rör Rack </td><td> VWR </td><td> 82024-452 </td><td> Odlingskammare: Beställ: 4 rack </td></tr><tr><td> 10L Reservoir flaska med botten utlopp: vacuum säker </td><td> VWR </td><td> 89001-530 </td><td> Media: Ordning: 2 eller fler </td></tr><tr><td> Gult skum silikon propp, icke-standardiserade storlek 12 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.298-22 </td><td> Media: Ordning: 2 eller fler </td></tr><tr><td> Damejeannen Avluftning filter </td><td> Fisher </td><td> SLFG 050 10 </td><td> Media: Ordning: 1x (paket om 10) </td></tr><tr><td> Eltejp, grön </td><td> <a href="http://Amazon.com" target="_blank">Amazon.com</a> </td><td> 10.851-BA-10 </td><td> Media: Beställ 1 rulle. </td></tr><tr><td> Korken filter 1L, 0,2 um, 45 mm </td><td> VWR </td><td> 29442-978 </td><td> Media: ordning: (1 fall av 12) </td></tr><tr><td> 5000 ml Reservoir flaska med bottenutlopp: Vacuum säker </td><td> VWR </td><td> 89003-384 </td><td> Media: (tillval) </td></tr><tr><td> Blå Skum Silikon propp, nonstandardsize 10 1/2 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.298-18 </td><td> Media: (tillval) </td></tr><tr><td> 205S/CA16, 16 Cartridge pump </td><td> Watson-Marlow </td><td> 020.3716.00A </td><td> Media Pump: Beställ: 1 </td></tr><tr><td> 16-kanals 205CA Extension pumphuvud </td><td> Watson-Marlow </td><td> 023.1401.000 </td><td> Media Pump: Beställ: 2 förlängning pumphuvuden </td></tr><tr><td> Silikon akvarium sealer </td><td> Fisher </td><td> S18180B </td><td> Media Pump: Beställ: 1 </td></tr><tr><td> 6-blocket torr bad </td><td> VWR </td><td> 12.621-120 </td><td> Heatblock: Beställ: 2 för 32 ministats eller 1 för 16. </td></tr><tr><td> Block för drybath, 6 x 25 mm provrör per block </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Beställ: 12 för 32 ministats eller 6 för 16. </td></tr><tr><td> Nylonmembranfilter, 0,45 um porstorlek, Dia: 25 mm. </td><td> Fisher </td><td> R04SP02500 </td><td> Skörd: Beställ: 1x (paket om 100) (tillval) </td></tr><tr><td> Nylonmembranfilter, 0,45 um porstorlek, 45 mm </td><td> Fisher </td><td> R04SP04700 </td><td> Skörd: Beställ: 1x (paket om 100) (tillval) </td></tr><tr><td> 47 mm, stor filteranordning </td><td> Fisher </td><td> XX10 047 30 </td><td> Skörd: Beställ: 1 (tillval) </td></tr><tr><td> Glass filterhållare, 25 mm, litet filter apparat </td><td> VWR </td><td> 26316-692 </td><td> Skörd: Beställ: 1 (tillval) </td></tr><tr><td> Dewar-kolv, 1L för flytande kväve </td><td> VWR </td><td> 63380-052 </td><td> Skörd: Beställ: 1 (tillval) </td></tr></tbody></table>

design and use of multiplexed chemostat arrays

Kemostater är kontinuerlig odling i vilka celler odlas i en hårt kontrollerad, kemiskt konstant miljö där kultur densitet begränsas genom att begränsa vissa näringsämnen. 1,2 Data från kemostater är mycket reproducerbara för mätning av kvantitativa fenotyper som de ger en konstant tillväxt och miljö vid steady state. Av dessa skäl har kemostater blivit användbara verktyg för finskalig karakterisering av fysiologi genom analys av genuttryck 3-6 och andra egenskaper hos kulturer vid steady-state jämvikt. 7 långtidsförsök i kemostater kan lyfta specifika banor som mikrobiella populationer antar Under adaptiv evolution i en kontrollerad miljö. I själva verket har kemostater använts för experimentell utveckling eftersom deras uppfinning. 8 Ett vanligt resultat i evolution experiment för varje biologiska replikat att förvärva en unik repertoar av mutationer. 9-13 Denna mångfald tyder på att det mycket är kvar att upptäckas genom att utföra evolution experiment med mycket större kapacitet. Vi presenterar här konstruktionen och driften av en relativt enkel, billig uppsättning miniatyr kemostater-eller ministats-och validera deras användning i bestämning av fysiologi och evolution experiment med jäst. Detta tillvägagångssätt innebär tillväxt av tiotals kemostater rinna av en enda multiplexerad peristaltisk pump. Kulturerna hålls vid en 20 ml arbetsvolym, vilket är praktiskt för en mängd olika tillämpningar. Det är vår förhoppning att öka genomströmningen, minska kostnader, samt om bygg-och instruktioner drift kan också motivera forskning och industriell tillämpning av denna design som en allmän plattform för funktionellt karakterisera ett stort antal stammar, arter och parametrar tillväxt samt genetisk eller läkemedel bibliotek.

Den ministat arrayen som beskrivs ovan och i (Figur 1A, B) användes för att odla en haploid MATa laboratorium stam av knoppande jäst (S288C) under sulfat-begränsande förhållanden som beskrivits tidigare. 10 Vi testade effekten för vanliga kemostat tillämpningar, inklusive bestämning av fysiologi och experimentell utveckling. Att validera ministats upprepade vi flera försök tidigare utfördes i industriella fermentorer modifierad för kemostat användning. 10,20,21 ATR Sixfors fermentorer kördes vid en 300 ml arbetsvolym över tio gånger volymen av ministats och har betydligt olika lägen av kultur luftning och omrörning. Vi försökte replikera utrustning stabilitet, stationära fysiologi, experimentella resultat evolution och genmönster uttryck erhålls med dessa fermentatorer. Eftersom enhetlighet utspädning hastighet och luftning är viktiga aspekter av kemostat designen, jag viasured den faktiska utspädningshastighet över 32 ministats efter 15 generationer av tillväxt och fann att med ett mål utspädning på 0,17 vol / h (4-5 droppar / min) vi uppnått en genomsnittlig utspädning andelen 0,17208 med en standardavvikelse på 0,0075 över 32 replikat. Detta intervall inom vår typiska tolerans av + / -0,01 vol / h skillnad från målformulering, bortom vilken storskaliga förändringar i genuttryck har observerats. 22-23 Över 4 ministats luftflödet bestämdes till 307,5 ​​ml / min med en standardavvikelse på 9,57 ml / min. Detta antyder att luftflöde in i kamrarna är robust och jämnt fördelade mellan de 4 kamrarna och är ett värde som liknar det som beskrivits för luftning i industriella fermentorer. 20 Vi observerade tidigare återkommande förstärkning av hög affinitet svavel-ion transportör SUL1 i 8/8 sulfat-begränsad utveckling experiment i jäst. 10 Med tanke på att resultaten blir konsekventa i this tillstånd vi valde sulfat-begränsning för att testa vårt system förmåga. En förutsättning inslag i kemostat kultur är behovet att bibehålla en konstant kemisk miljö. Fluktuationer i överflödet av ett begränsande näringsämne eller andra förändringar i miljön resulterar typiskt i en ändring i antalet celler i en given kultur. Vi mätte optisk densitet som en proxy för cellantal (figur 2A) och uppmätt reproducerbarhet över 16 upprepade kulturer, hitta en genomsnittlig A600 av 1,12 (~ 10 9 celler) efter ~ 15 generationer av tillväxt med en standardavvikelse på 0,057 enheter, eller 5,1 %. För jämförelse, visade mätningar tagna från 4 upprepade kulturer odlade i industriella fermentorer en standardavvikelse på 2,5%. Cellerna var väl blandas i odlingskammaren: mätningar av OD och cellantal tas från utflödet spåret var ekvivalent med prover tagna direkt från kulturen röret (data ej visade). Dessa resultat visar robustheten i vår plattform ettd förmågan att upprätthålla en konstant kemisk miljö inom en liknande tolerans som den industriella fermentorn. Som en känsligare avläsning av fysiologi, jämförde vi genomet hela stabilt uttryck state-gen från kulturer som odlats under sulfat begränsning i ministats och i den industriella fermentorn. Genuttryck i ministats visade en hög grad av likhet över tre biologiska replikat (figur 2B). Vi har tidigare noteras att för RNA härlett från två likadana Sixfors kemostater och co-hybridiserades till en mikromatris, föll expression av 99% av gener inom en 1,5-faldigt område, medger användning av 1,5 X som en empirisk betydelse cutoff. 21 Genexpression från tre likadana ministats, jämfört parvisa, visade 99% av gener föll inom ett 1,5-1,7 gånger sortiment, jämförbart med resultaten från de industriella fermentorer. De tre proven hybridiserades till enskilda arrayer och parvisa nyckeltal beräknade efteråt, så dessa vaSYFILIS hör bland-array brus förutom biologiskt brus, eventuellt överskatta variationen mellan replikat jämfört med de publicerade, co-hybridiserade resultat. 138 gener differentiellt uttryckta&gt; 1,5-faldig i alla tre ministat i replikat jämfört med ett prov som tagits på en matchad kultur odlas i industriell fermentorn. Gener minskade uttryck i ministats var kraftigt anrikad på järn metabolism. Denna signatur kan återspegla olika metaller sammansättningen av varje enhet konfiguration: det Sixfors apparaten innefattar en metall impeller och luftning montering nedsänkt i kultur och media dunkar tidigare använts krävs också metall. Den ministat använder rostfritt stål nålar, men inga andra metallkomponenter. Gener med ökad expression i stor utsträckning associerade med cellmembran, fastän den biologiska betydelsen av denna association är oklar. Slutligen testade vi experimentell utveckling under dessa villkor. Efter 250 generationer av sulfat-begränsad tillväxt, uppvisade 4/4 kloner testade från 4 oberoende evolverande populationer amplifiering av SUL1 såsom detekteras av uppsättning jämförande genomisk hybridisering (CGH, figur 2C). Detta resultat stämmer överens med resultaten i större volym kemostater jämfört med liknande tidsintervall. 10 <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1.jpg" alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1highres.jpg"/> Figur 1. A. Utformning och placering av ministat arrayen. B. Design av kulturen kammaren. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2.jpg" alt="Figur 2" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2highres.jpg"/> Figur 2. A. Experimejömässig uppgifter som visar att kulturer når jämvikt inom tio generationer av tillväxt (n = 16). B. Expression för tre biologiska replikat S1-3 samplas under steady-state i sulfat begränsning jämfört med en gemensam referens odlas i en matchad sulfat-begränsad Sixfors kemostat . C. SUL1 förstärkningar återhämtade sig ministats efter 250 generationer av tillväxt i en sulfat-begränsad miljö. Genomiskt DNA från varje utvecklad klon jämfördes med förfäders DNA genom CGH som beskrivs. Medelvärde antal kopior beräknades för varje förstärkt område och visas bredvid varje amplikon 21. Samtliga microarray data deponeras i GEO databasen under anslutningen GSE36691. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50262/50262fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays at JoVE.com

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Vi utvecklade och validerade en liten fotavtryck uppsättning miniatyr kemostater byggda från lättillgängliga delar för låg kostnad. Fysiologiska och experimentell utveckling resultat liknade större volym kemostater. Den ministat arrayen ger en kompakt, billig och lättillgänglig plattform för traditionella kemostat experiment, funktionell genomik och kemiska applikationer screening.

Utformning och användning av Multiplexad kemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

Mikroflödessystem Chips kontrolleras med Arrays Elastomerisk Microvalve

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

Bioelektrisk Analyser av en osseointegreras intelligent Implant Design System för amputerade

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays MEAs

Hur Kultur, Spela in och stimulera neurala nätverk på mikro-elektrod Arrays (MEA)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Profilering av Pre-mikro-RNA och mikroRNA hjälp av kvantitativ realtids-PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

Multiplexade Fluorometrisk immunoassay testmetoder och felsökning

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kartläggning Bakteriella funktionella nätverk och vägar i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Använda syntetiska genetiska Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

Tillverkning och användning av mikromiljö microarrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Montering av nucleosomal arrayer från rekombinanta Kärn Histoner och nukleosom Positionering DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design och analys av temperaturpreferensbeteende och dess dygnsrytm i Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Identifiera protein-proteininteraktion webbplatser Använda peptid Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...