Name: post-embedding immunogold labeling of synaptic proteins in hippocampal slice cultures
Uploaded: 2013-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures at JoVE.com

De auteurs willen graag Matthew Florence bedanken voor de voorbereiding van de hippocampus slice culturen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van US National Institute on Aging en Alzheimer&#39;s Association te NZG.

1. Bevestiging Fixatieven zijn kankerverwekkend, draag handschoenen en omgaan met de fixeermiddelen in een zuurkast. Tenzij anders vermeld, zijn alle incubaties uitgevoerd op ijs en alle oplossingen worden gefiltreerd voor gebruik. Gebruik elektronenmicroscopie-grade reagentia. Dag 1 <ol><li class="jove_content"> Na experimentele omstandigheden (bijv. virale injectie, drugsbehandeling) moet het membraan met organotypische hippocampus plakken in een 60 x 1...

<ol>
	<li>Faulk, W. P., Taylor, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunocolloid+method+for+the+electron+microscope.">An immunocolloid method for the electron microscope.</a> Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).</li><li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-+and+affinity+probes+for+electron+microscopy:+a+review+of+labeling+and+preparation+techniques.">Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques.</a> J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).</li><li>Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+optimize+post-embedding+single+and+double+staining+for+amino+acid+neurotransmitters.">Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).</li><li>Berryman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tannic+acid+on+antigenicity+and+membrane+contrast+in+ultrastructural+immunocytochemistry.">Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+ultracryotomy+of+CNS+tissue+for+ultrastructural+and+immunogold+analyses.">Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses.</a> J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).</li><li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructual+localization+of+lysozyme+in+human+colon+eosinophils+using+the+protein+A-gold+technique:+effects+of+processing+on+probe+distribution.">Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution.</a> J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).</li><li>Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+osmium-free+method+of+epon+embedment+that+preserves+both+ultrastructure+and+antigenicity+for+post-embedding+immunocytochemistry.">An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> Embo J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li><li>Zhong, L., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+targets+calmodulin+and+lowers+the+threshold+for+the+induction+of+long-term+potentiation.">Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation.</a> PloS one. 7, e41275 (2012).</li><li>Horisberger, M., Vauthey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+of+colloidal+gold+with+protein.+A+quantitative+study+using+beta-lactoglobulin.">Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin.</a> Histochemistry. 80, 13-18 (1984).</li><li>Bendayan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+potential+and+versatility+of+colloidal+gold+cytochemical+labeling+for+molecular+morphology.">A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology.</a> Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).</li><li>Racz, B., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+coflin+in+dendritic+spines.">Spatial organization of coflin in dendritic spines.</a> J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).</li><li>Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+the+immunogold+technique+in+quantitation+of+a+soluble+protein+in+ultra-thin+sections.">Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).</li><li>Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+antigen,+one+gold?+A+quantitative+analysis+of+immunogold+labeling+of+plasma+membrane+5'-nucleotidase+in+frozen+thin+sections.">One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections.</a> Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 .</li><li>Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Immunologic+analysis+of+families+with+complement+receptor+deficiency].">[Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency].</a> Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).</li><li>Kehle, T., Herzog, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+protein-gold+complexes+and+cell+surfaces:+a+method+for+precise+quantitation.">Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation.</a> Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).</li><li>Bozzola, J. R., Lonnie, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Electron Microscopy. 30, (1992).</li><li>Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rat+brain+postsynaptic+density+fraction+contains+a+homolog+of+the+Drosophila+discs-large+tumor+suppressor+protein.">The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein.</a> Neuron. 9, 929-942 (1992).</li><li>Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSD-95+is+associated+with+the+postsynaptic+density+and+not+with+the+presynaptic+membrane+at+forebrain+synapses.">PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses.</a> J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).</li><li>Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+localization+of+B-50+phosphoprotein:+the+(ACTH)-sensitive+protein+kinase+substrate+involved+in+rat+brain+polyphosphoinositide+metabolism.">Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism.</a> Brain Research. 328, 381-385 (1985).</li><li>Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+phosphoprotein+B-50/GAP-43+in+neuronal+and+synaptic+plasticity.">Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity.</a> Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).</li><li>Maunsbach, A. A., Bjorn, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+16.">Ch. 16.</a> Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , 383-426 (1999).</li></ol>

In dit protocol hebben we aangenomen Phend en Weinberg methode voor de hersenen en het ruggenmerg weefsels om dendritische spines in rat hippocampale slice culturen te bestuderen. Dendritische spines in de hippocampus CA3-CA1 gebied zijn delicate structuren met een grote verscheidenheid aan eiwitten die een belangrijke rol spelen bij het reguleren van neuronale functies. De onderhavige methode biedt een evenwicht te bereiken verbeterde antigeniciteit met behoud van goede conservering ultrastructurele (Figuur 2A)...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>NAME OF REAGENT</td>
 <td>COMPANY</td>
 <td>CATALOG NUMBER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 x 15 mm polystyrene Petri dish</td>
 <td>Falcon</td>
 <td>351007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable scalpel</td>
 <td>EXELINT</td>
 <td>29552</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell culture inserts</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>PICM03050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 nm Goat-anti-rabbit gold</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>25108</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Neurogranin antibody</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AB5620</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Picric acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>19550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96% Paraformaldehyde</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>AC41678-0030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25% Glutaraldehyde (EM grade)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p-Phenylenediamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P6001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum (IV) chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>379840</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

post-embedding immunogold labeling of synaptic proteins in hippocampal slice cultures

Immuno microscopie is een krachtig hulpmiddel om biologische moleculen te bestuderen op het subcellulaire niveau. Antilichamen gekoppeld aan elektron-dichte markers zoals colloïdaal goud kan onthullen de lokalisatie en distributie van specifieke antigenen in verschillende weefsels 1. De twee meest gebruikte technieken zijn pre-embedding en na inbedding technieken. In pre-embedding immunogoud-elektronenmicroscopie (EM) techniek, moet het weefsel worden gepermeabiliseerd om antilichaam kan binnendringen voordat het wordt ingebed. Deze technieken zijn ideaal voor het bewaren van organen, maar slechte penetratie van het antilichaam (vaak alleen de eerste paar micrometer) een aanzienlijk nadeel 2. De post-embedding labeling methoden kunnen voorkomen dat dit probleem, omdat de etikettering vindt plaats op delen van vaste weefsels waar antigenen zijn gemakkelijker toegankelijk. Over de jaren zijn een aantal wijzigingen verbeterde de post-embedding methoden immunoreactiviteit verbeteren en ultrastructuur behouden <sup&gt; 3-5. Tissue fixatie is een cruciaal onderdeel van EM studies. Fixatieven chemisch verknopen de macromoleculen om het weefsel structuren te vergrendelen. De keuze van fixatief beïnvloedt niet alleen structurele conservering maar ook antigeniciteit en contrast. Osmiumtetroxide (OSO 4), formaldehyde en glutaaraldehyde zijn de standaard fixatieven decennia, met inbegrip van het centrale zenuwstelsel (CNS) weefsels die vooral gevoelig voor structurele schade tijdens chemische of fysische bewerkingen. Helaas OSO 4 is zeer reactief en is aangetoond dat maskeren antigenen 6, resulterend in slechte en onvoldoende labeling. Alternatieve benaderingen van chemische fixatie te vermijden onder meer het bevriezen van de weefsels. Maar deze technieken zijn moeilijk en vereisen dure apparatuur. Om sommige van deze problemen aan te pakken en CZS etikettering Phend et al. verbeteren. vervangen OSO 4 met uranylacetaat (UA) en tannine acid (TA), en met succes bijkomende wijzigingen van de gevoeligheid van antigeen en structurele conservering hersenen en ruggenmerg weefsels 7 verbeteren. We hebben deze osmium-vrij na inbedding methode om ratten hersenweefsel en geoptimaliseerd de immunogoud etikettering techniek voor het opsporen en bestuderen synaptische eiwitten. We presenteren hier een methode om de ultrastructurele lokalisatie van synaptische eiwitten in rat hippocampale CA1 pyramidale neuronen te bepalen. We maken gebruik van organotypische hippocampus gekweekte plakjes. Deze schijfjes handhaven van de trisynaptic circuit van de hippocampus, en zijn dus vooral handig voor het bestuderen van synaptische plasticiteit, een mechanisme in brede kring te leren en geheugen ten grondslag liggen. Organotypische hippocampale plakken van postnatale dag 5 en 6 muizen / ratten worden bereid zoals eerder beschreven 8 en zijn bijzonder nuttig om acute knockdown of overexpressie exogene eiwitten. We hebben eerder gebruikt dit protocol om characterize neurogranin (Ng), een neuron-specifiek eiwit een kritische rol in het reguleren synaptische functie 8,9. We hebben ook gebruikt om de lokalisatie van ultrastructurele calmoduline (CaM) en Ca 2 + / CaM-afhankelijke proteïne kinase II (CaMKII) 10 karakteriseren. Zoals weergegeven in de resultaten, dit protocol zorgt voor een goede ultrastructurele behoud van dendritische spines en efficiëntie-etikettering van Ng te helpen karakteriseren te verspreiden over de rug 8. Bovendien is de hier beschreven procedure kan brede toepasbaarheid hebben bij het bestuderen van vele andere eiwitten betrokken bij neuronale functies.

Figuur 2B toont een voorbeeld van de verdeling van de endogene moleculen in Ng dendritische uitsteeksels van hippocampale CA1 pyramidale neuronen. Nikkel roosters met ultradunne (60 nm) weefsels die CA1 gebied van de hippocampus (zoals weergegeven in figuur 2A) werden bedekt met 1% T / PB, 50 mM glycine, vervolgens geblokkeerd met 2,5% BSA en 2,5% serum voorafgaand aan incubatie met anti Ng-antilichaam. Na wassen met T / PB werden grids vervolgens bedekt met anti-konijn secundair antili...

Watch this Scientific Journal Video about Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures at JoVE.com

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

De lokalisatie en distributie van eiwitten leveren belangrijke informatie voor het begrijpen van hun cellulaire functies. De superieure ruimtelijke resolutie van elektronenmicroscopie (EM) kan worden gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van een bepaald antigeen na immunohistochemie bepalen. Voor weefsels van het centrale zenuwstelsel (CNS), behouden de structurele integriteit behoud antigeniciteit is vooral moeilijk EM studies. Hier nemen we een procedure die is gebruikt om structuren en antigenen behouden in het CZS te bestuderen en synaptische eiwitten karakteriseren rat hippocampale CA1 pyramidale neuronen.

Post-inbedding immunogold Etikettering van Synaptic eiwitten in de hippocampus slice culturen

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Voorbereiding van oligomere β-amyloïde 1-42 En Inductie van synaptische plasticiteit Waardevermindering op hippocampus Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

De organotypische hippocampus Slice Cultuur Model is voor de behandeling Neuronale Letsel

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypische hippocampus Slice culturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

De Analyse van de Purkinje cel dendritische morfologie in organotypische slice culturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Gelijktijdig Pre-en post-synaptische Elektrofysiologische Opnemen vanaf<em&gt; Xenopus</em&gt; Zenuw-spier Co-culturen

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypische Slice culturen om te studeren Oligodendrocyte Dynamics en Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

De Analyse van Neurovascular Verbouwing in Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

High-Resolution Kwantitatieve immunogoud Analyse van membraanreceptoren op het netvlies Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic Hippocampal Slice culturen als een Model voor de studie neuroprotectie en invasiviteit van tumorcellen

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...