Name: high-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay
Uploaded: 2014-06-01T14:00:00
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Wir danken John Darga der MGH DNA-Core für die Erstellung des DNA-Screening-Bibliothek. Christopher Chigas von Perkin Elmer unschätzbare Unterstützung für unsere Wallac 1420 Luminometer. Steven Ciacco und Martin Thomae von Agilent unterstützte die Bravo-Roboter. Wir danken Ron Johnson und Steve Titus am NIH für die großzügige Bereitstellung ihrer Dual-Luciferase-Assay-Protokoll glühen.

Für eine experimentelle Übersicht siehe Abbildung 1. 1. Bereiten Reporter Plasmide, die die Alpha-Synuclein Promoter Regulatorischen Elemente des alpha-Synuclein-Gen (Fig. 2) erstrecken etwa 10 kb, von der stromaufwärts NACP (Nicht-A-beta-Peptid Amyloid-Komponente) 1,2-Dinukleotid-Repeat-Sequenz durch Introns 2 3. Wir schließen einen Teil dieser Region unsere Reporter-Konstrukt. Wir fanden, daß Plasmide, ...

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	<li>Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+allelic+variation+at+the+NACP-Rep1+repeat+upstream+of+the+&#945;-synuclein+gene+(SNCA)+on+transcription+in+a+cell+culture+luciferase+reporter+system.">Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the &#945;-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).</li><li>Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+intra-allelic+variation+at+NACP-Rep1+in+the+alpha-synuclein+gene.">Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene.</a> 113 (5), 426-431 (2003).</li><li>Scherzer, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA+transcription+factors+directly+regulate+the+Parkinson's+disease-linked+gene+&#945;-synuclein.">GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene &#945;-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).</li><li>Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+in+Lewy+Bodies.">&#945;-Synuclein in Lewy Bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li><li>Pankratz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+Parkinson's+disease:+identification+of+a+novel+locus,+RIT2.">Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2.</a> Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).</li><li>Satake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+common+variants+at+four+loci+as+genetic+risk+factors+for+Parkinson's+disease.">Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).</li><li>Sim&#243;n-S&#225;nchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+reveals+genetic+risk+underlying+Parkinson's+disease.">Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).</li><li>Polymeropoulos, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+the+alpha-synuclein+gene+identified+in+families+with+Parkinson's+disease.">Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease.</a> Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).</li><li>Ib&#225;&#241;ez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+relationship+between+a-synuclein+gene+duplication+and+familial+Parkinson's+disease.">Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).</li><li>Chartier-Harlin, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a-Synuclein+locus+duplication+as+a+cause+of+familial+Parkinson's+disease.">a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).</li><li>Singleton, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a-Synuclein+locus+triplication+causes+Parkinson's+disease.">a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease.</a> Science. 302 (5646), 841 (2003).</li><li>Ahn, T. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a-Synuclein+gene+duplication+is+present+in+sporadic+Parkinson+disease.">a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease.</a> Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).</li><li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells.">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li><li>Montigny, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+influencing+high-efficiency+transfection+of+bacterial+artificial+chromosomes+into+cultured+mammalian+cells.">Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells.</a> Biotechniques. 35, 796-807 (2003).</li><li>Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+genomes+which+express+chloramphenicol+acetyltransferase+in+mammalian+cells.">Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).</li><li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ORC6,+a+Component+of+the+Yeast+Origin+Recognition+Complex+by+a+One-Hybrid+System.">Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System.</a> Science. 262, 1870-1874 (1993).</li><li>Dejardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Proteins+Associated+with+Specific+Genomic+Loci.">Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci.</a> Cell. 136, 175-186 (2009).</li><li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouseGenome.">A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome.</a> Nature. 488, 116-120 (2012).</li><li>Fan, F., Wood, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+assays+for+high-throughput+screening.">Bioluminescent assays for high-throughput screening.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).</li><li>Hampf, M., Gossen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+combined+Photinus+and+Renilla+luciferase+quantification+compatible+with+protein+assays.">A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays.</a> Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).</li><li>Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+PTC124+activity+in+cell-based+luciferase+assays+of+nonsense+codon+suppression.">Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).</li><li>Pearlberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screens+using+RNAi+and+cDNA+expression+as+surrogates+for+genetics+in+mammalian+tissue+culture+cells.">Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells.</a> Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).</li></ol>

Alpha-Synuclein in der Parkinson-Krankheit (PD) als Bestandteil der Lewy-Körper 4, intrazellulären Einschlüssen als pathognomonisch für die Krankheit in Verbindung gebracht. Zahlreiche genomweiten Assoziationsstudien haben Einzel-Nukleotid-Polymorphismen im Alpha-Synuclein mit einem erhöhten Risiko für sporadische PD 5,6,7 verbunden. Obwohl weniger verbreitet als sporadische PD, familiäre PD kann auch durch Mutationen im Alpha-Synuclein 8 verursacht werden, sowie Vervielfältigung...

Die Fähigkeit, wichtige genetische Regulationselemente und die Faktoren, die auf sie einwirken zu identifizieren, ist für die Exploration von zahlreichen biologischen Prozessen fundamental. Jedoch Faktoren zu identifizieren, die die Expression von Genen in seltenen Zelltypen regulieren, wie spezifische neuronale Populationen, kann schwierig sein. Hier wird ein Protokoll zur Identifizierung von neuartigen Transkriptionsregulatoren der alpha-Synuclein (SNCA) präsentieren wir ein Gen, das mit der Parkinson-Krankheit und der dopaminergen Neuronen in der substantianigra ausgedrückt pars compacta Bereich des Mittelhirns. Wir erreichen dies mit einem Hochdurchsatz-, Dual-Luciferase, in-vitro-Reporter Bildschirm, um Alpha-Synuclein-Expression in 293T-Zellen zu dekonstruieren. Die alpha-Synuclein-Promotor wird zunächst in einem Reporterplasmid, das den Glühwürmchen-Luciferase-Gen kloniert. Ein handelsübliches Plasmid, das das Renilla-Luciferase unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven Promotors dient als interne Kontrolle. These-Reporter-Konstrukte in 293T-Zellen cotransfiziert in Mikrotiterplatten mit Plasmiden aus einer DNA-Expressionsbibliothek, so dass jede Vertiefung mit einer einzigen Bibliothek transfiziert. Nach 48 Stunden Luciferase-Aktivität für jeden Reporter sequentiell unter Verwendung eines Dual-Schein-Assay gemessen. Renilla-Luciferase-Aktivität in jeder Vertiefung (F: R-Verhältnis) nach der Plattenbasis Normalisierung der relativen Expression von alpha-Synuclein in Reaktion auf jede Bibliothek Gen wird durch das Verhältnis von Glühwürmchen abgeleitet. Dieses Protokoll stellt die Fähigkeit, eine große Anzahl von Genen (~ 2.500 pro Woche) auf ihre Fähigkeit, ein Reportergen zu trans Verwendung minimaler Arbeitskraft (1-2 Personen) und minimalen Kosten (etwa 3 $ Reagenzienkosten pro Mikroassay) zu screenen. Transkriptionsregulatoren der neuronalen Gene (z. B. alpha-Synuclein), die schwierig in kultivierten Neuronen refraktär genetische Manipulation zu studieren, können Seite an Seite in dieser direkten funktionellen Assay verglichen werden. Wir sind in unsererProtokoll eine ausführliche Verfahren für das Klonen und das Wachstum der Plasmide, die das Alpha-Synuclein-Promotor, da wir festgestellt, dass Plasmide, die diese Region instabil sind, wenn sie mit herkömmlichen Verfahren (siehe Diskussion) gewachsen. Wir berücksichtigen auch eine kostengünstige Alternative zu handelsüblichen Dual-Luciferase-Reagenzien für die Hochdurchsatz-Assays. Dieses Protokoll kann leicht an andere regulatorische Elemente von Interesse, oder zu jedem Prozess eine hohe Durchsatz transienten Transfektionen Ziel werden.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAQuick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink PCR Micro Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K310250</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bravo Robot</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>-</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips with Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-022</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips without Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clear-bottomed 96-well Plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3610</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reservoirs</td>
 <td>Axygen</td>
 <td>RES-SW96-HP-SI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polystyrene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adhesive Plate Covers</td>
 <td>CryoStuff</td>
 <td>#FS100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phusion DNA Polymerase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0530L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAC 2002-D6</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>2002-D6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calf Intestine Alkaline Phosphatase</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10713023001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA Ligase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0202L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.10</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6651</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.74</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6931</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ElectroMAX Stbl4 Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11635-018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Subcloning Efficiency DH5&alpha; Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>18265-017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM without Phenol Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>31053-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optifect</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12579017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ciprofloxacin</td>
 <td>CellGro</td>
 <td>61-277-RF</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Hydrochloride Powder</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93287</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Base Powder </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93286</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100 Pure Liquid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP151-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15508-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coenzyme A</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>309</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6419</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luciferin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>L2912</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>h-CTZ</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>301</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTC124</td>
 <td>SelleckBiochemicals</td>
 <td>S6003</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

high-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay

Wir stellen eine schnelle und kostengünstige Hochdurchsatz-Screening-Protokoll zur Transkriptionsregulatoren der alpha-Synuclein-Gen mit einer Parkinson-Krankheit zu identifizieren. 293T-Zellen transient mit Plasmiden aus einem Array ORF Expressionsbibliothek transfiziert zusammen mit Luciferase-Reporter-Plasmide, in einem Ein-Gen-per-Well-Mikroformat. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wird nach 48 Stunden, um die Wirkungen von jeder Bibliothek Gen auf alpha-Synuclein-Transkription, normiert auf die Expression von einer internen Kontrollkonstrukt (hCMV-Promotor, eine Renilla-Luciferase) zu bestimmen, untersucht. Dieses Protokoll wird von einer Bank-Top-Roboter in einer Biosicherheitsschrank eingeschlossen, die aseptische Handhabung von Flüssigkeiten in 96-Well-Format führt erleichtert. Unsere automatisierten Transfektionsprotokolls ist leicht an Hochdurchsatz-Bibliothek lentivirale Produktion oder andere funktionelle Screening-Protokolle Triple-Transfektionen von einer großen Anzahl von einzigartigen Bibliothek Plasmide in konjugierte erfordernnktion mit einem gemeinsamen Satz von Helfer-Plasmide. Wir stellen auch eine kostengünstige und validiert Alternative zu handelsüblichen, Dual-Luciferase-Reagenzien, PTC124, EDTA und Pyrophosphat Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität vor der Messung der Renilla-Luciferase verwendet drücken. Mit Hilfe dieser Methoden, abgeschirmt wir 7670 menschliche Gene identifiziert und 68 Regulatoren der alpha-Synuclein. Dieses Protokoll ist leicht modifizierbar, um andere Gene von Interesse abzielen.

Typische Luciferase-Werte, F: R-Verhältnisse und Induktion Werte für ein einzelnes Halbplatte sind in Abbildung 4 dargestellt Beachten Sie die Hit in gut H2, einem 32-fach-Induktor.. Gene verursacht übermäßige Toxizität (z. B. auch E3), oder Brunnen, die schlecht transfiziert wurden, werden niedrige Werte sowohl für Glühwürmchen und Renilla Luciferase produzieren, aber eine durchschnittliche Induktionswert. Genen, die nicht-spezifische Induktion der Luciferase-Aktivität, möglicherwei...

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High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und kostengünstige Screening-Methode zur Identifizierung von Transkriptionsregulatoren mit Hochdurchsatz-Roboter-Transfektionen und ein hausgemachtes Dual-Luciferase-Assay glühen. Dieses Protokoll erzeugt schnell direkten Seite-an-Seite funktionellen Daten für Tausende von Genen und ist leicht modifizierbar, um jedes Gen von Interesse zielen.

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