Name: generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)
Uploaded: 2013-04-19T13:00:00
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Die Arbeit wird von einem Institut Development Award aus dem Kinderkrankenhaus von Philadelphia unterstützt.

Ein. Querverbindung Chromatin <ol><li> Wachsen Zellen in 100x20mm Zellkulturschalen. Die Menge der Zellen können von 1 bis 10 Millionen Zellen pro Schale je nach Zelltyp reichen. Etwa 2 Millionen Zellen ist ausreichend für eine Immunpräzipitation. </li><li> Querverbindung Zellen in 1% Formaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schaukelstuhl. </li><li> Quench Vernetzung durch Zugabe einer Endkonzentration von 125 mM Glycin und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur gerührt. </li><li> Waschen ...

<ol>
	<li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. 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Immunol. 6, 602-612 (2006).</li><li>Lodige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+export+determines+the+cytokine+sensitivity+of+STAT+transcription+factors.">Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).</li><li>Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. 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Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li><li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels.">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li><li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes.">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li><li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants.">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li><li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes.">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li><li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations:+The+DiaGen+Consortium.">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li><li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCF7L2:+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA.">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li><li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+TCF7L2.">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li><li>Hattersley, A. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells.">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li><li>Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+the+TCF-4+gene+(TCF7L2)+to+human+chromosome+band+10q25.3.">Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3.</a> Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).</li><li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer.">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li><li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling.">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li><li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+in+vivo.">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li><li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate.">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li></ol>

Es ist nun möglich, die Durchführung einer genomweiten Profil von Protein-DNA-Wechselwirkungen Assoziation mit ChIP-seq, wie bereits vor kurzem mit anderen Transkriptionsfaktoren 2,3 demonstriert. Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Sequenzierung Ergebnis ist die Erzeugung eines hochwertigen Chromatinimmunpräzipitation DNA-Vorlage. Sobald die DNA-Matrize erzeugt wurde und festgestellt, angemessen angereichert werden, kann man dann nehmen Sie es in der Bibliothek Vorbereitung ...

Seit vielen Jahren hat es einen unerfüllten Bedarf, um den Satz von Genen, gebunden und durch ein bestimmtes Protein genomweiter, insbesondere in den Transkriptionsfaktor reguliert Klasse zu identifizieren. Odom et al. 1 verwendet Chromatinimmunpräzipitation (Chip) mit Promoter Microarrays systematisch zu identifizieren, die Gene von vorgegebenen Transkriptionsfaktoren in der menschlichen Leber und Pankreas-Inseln besetzt kombiniert. Anschließend entwickelte Johnson et al. 2 eine groß angelegte Chromatinimmunpräzipitation Assay auf direkte Ultra Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-seq), um umfassend abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen über die gesamte Säugergenomen basiert. Als Testfall sie in vivo der Bindung des Neuron-einschränkende Faktor Schalldämpfer (NRSF) bis 1946 Stellen im menschlichen Genom abgebildet. Die angezeigten Daten scharfen Auflösung von verbindlichen Position (+ 50 Basenpaare), die sowohl die i erleichtertsolation der Motive und der Identifizierung von NRSF-bindende Motive. Diese ChIP-seq Daten hatten auch hohe Sensitivität und Spezifität und statistische Sicherheit (P &lt;10 -4), Eigenschaften, die wichtig für die Ableitung neuer Kandidat Wechselwirkungen sind. Robertson et al. 3 auch ChIP-seq verwendet werden, um Ziele in der Karte STAT1 Interferon-γ (IFN-γ)-stimulierten und unstimulierten humanen HeLa S3-Zellen in vivo. Durch ChIP-seq, mit 15,1 und 12,9 Mio. eindeutig zugeordnet Sequenz liest, und eine geschätzte False Discovery Rate von weniger als 0.001, identifizierten sie 41.582 und 11.004 mutmaßliche STAT1-bindenden Regionen in stimulierten und unstimulierten Zellen. Von den 34 Loci bekannt STAT1 auf Interferon ansprechenden Bindungsstellen 4-8 enthalten, gefunden ChIP-seq 24 (71%). ChIP-seq Ziele wurden in Sequenzen ähnlich bekannt STAT1 Bindungsmotive bereichert. Vergleiche mit zwei bestehenden ChIP-PCR-Datensätze vorgeschlagendass ChIP-seq Sensitivität lag zwischen 70% und 92% und eine Spezifität von mindestens 95%. Darüber hinaus war es klar, dass ChIP-seq sowohl niedrige analytische Komplexität und Sensibilität, die mit zunehmender Tiefe Sequenzierung bietet. Als solche &quot;nächsten Generation&quot; Genom-Sequenzierung Technologien bieten 1-2 Größenordnungen Anstieg in Höhe von Sequenz, die kostengünstig gegenüber älteren Technologien 9 erzeugt werden können. ChIP-seq Methoden daher direkt liefern Ganzgenom Abdeckung für wirksame Profilierung der Säuger Protein-DNA-Wechselwirkungen 3. Im Jahr 2006 wurde eine starke Assoziation von Varianten in den Transkriptionsfaktor 7-like 2 (TCF7L2) Gen mit Typ-2-Diabetes 10 entdeckt. Andere Forscher haben bereits unabhängig diese Feststellung in verschiedenen Ethnien repliziert und interessanterweise von den ersten genomweiten Assoziationsstudien von Typ-2-Diabetes in Nature veröffentlicht 11,12 </sup&gt;, Wissenschaft und anderswo 13-15 16,17 war die stärkste Assoziation mit der Tat TCF7L2, dies ist nun die wichtigste genetische Befund bei Typ-2-Diabetes als 18-20 Laufenden. Darüber hinaus hat TCF7L2 das Krebsrisiko 21,22 in Verbindung gebracht worden, ja, wurde diese Verbindung noch deutlicher, wenn der Locus 8q24 durch genomweite Assoziationsstudien von einer Reihe von Krebsarten, einschließlich kolorektalen Karzinomen ergab, wurde gezeigt, dass durch eine extreme stromaufwärts TCF7L2 bindende Element der Fahrt die Transkription von MYC 23,24. Daher besteht ein großes Interesse an der Feststellung der nachgeschalteten Gene durch diese Taste Transkriptionsfaktor reguliert. Basierend auf den Erfahrungen mit TCF7L2 als Beispiel der Methodik, umreißt dieses Papier wie man qualitativ hochwertige ChIP-DNA-Template zu erzeugen. Chip wurde im kolorektalen Karzinom-Zelllinie HCT116, z. anschließende Sequenzierung, um Aufbau eines High-Resolution Karte der Gene durch TCF7L2 25 in dem Bestreben, weitere Einblicke in seine wichtige Rolle in der Pathogenese von komplexen Merkmalen ergeben gebunden.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-ChIP Kit </td>
 <td>Millipore </td>
 <td>17-371 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GoTaq Hot Start Polymerase </td>
 <td>Promega</td>
 <td>M5001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Misonix Sonicator</td>
 <td>Qsonica </td>
 <td>XL-2000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 NanoDrop 1000 Spectrophotometer </td>
 <td>
 Thermo-Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Positive control primer sequences (TCF7L2-1) 
 Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' 
 Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' 
 Negative control primer sequences (CTRL-1) 
 Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3'
 
 Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)

ChIP-Sequenzierung (ChIP-seq) Methoden direkt anbieten Ganzgenom Deckung, wo die Kombination Chromatinimmunpräzipitation (Chip) und massiv parallele Sequenzierung genutzt werden, um das Repertoire der Säuger-DNA-Sequenzen, die von Transkriptionsfaktoren in vivo gebunden zu identifizieren. &quot;Next-Generation&quot; Genom-Sequenzierung Technologien bieten 1-2 Größenordnungen Anstieg in Höhe von Sequenz, die sein können kostengünstig im Vergleich zu älteren Technologien erzeugt so dass für ChIP-seq Methoden, um direkt zur Verfügung Ganzgenom Abdeckung für wirksame Profilierung von Säugetieren Protein-DNA-Wechselwirkungen. Für eine erfolgreiche ChIP-seq Ansätze, muss man erzeugen hochwertige ChIP DNA-Vorlage, um die besten Ergebnisse zu erhalten Sequenzierung. Die Beschreibung ist um Erfahrungen mit dem Proteinprodukt des Gens am stärksten in der Pathogenese von Diabetes Typ 2, nämlich der Transkriptionsfaktor Transkriptionsfaktor 7-like 2 (TCF7L2 gebracht basierend). Dieser Faktor ist auch in verschiedenen Tumoren in Verbindung gebracht. Skizziert ist wie man qualitativ hochwertige ChIP DNA-Vorlage aus dem kolorektalen Karzinom Zelllinie HCT116 abgeleitet zu erzeugen, um eine hochauflösende Kartendarstellung durch Sequenzierung der Gene von TCF7L2 gebunden bestimmen zu bauen, geben weitere Einblicke in seine wichtige Rolle in der Pathogenese von komplexen Merkmalen.

Sobald das Chromatin wurde mit Ultraschall behandelt wurde, und wurden mit RNase und Proteinase behandelt, sollten die Proben auf der 2% igen Agarosegel aufgetrennt ein Abstrich mit der Masse der DNA, die in der gewünschten Größe. Wenn mehrere Zyklen geprüft, ist eine allmähliche Abnahme in der Größe der Anzahl von Zyklen erhöht (Abbildung 2) zu sehen. Nach Abschluss der Immunopräzipitation des Protokolls ist die Anreicherung kann entweder durch PCR oder Echtzeit-PC...

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Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Die Kombination von Chromatinimmunpräzipitation und ultra-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (Chip-seq) zu identifizieren und abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen in einem bestimmten Gewebe oder Zelllinie. Skizziert ist, wie man eine hohe Qualität ChIP Vorlage für anschließende Sequenzierung mit Erfahrung mit dem Transkriptionsfaktor TCF7L2 als Beispiel zu generieren.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Forschung

Biologie

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen<em&gt; In-vivo-</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DAMiD-seq: Genomweite Mapping von Protein-DNA-Wechselwirkungen von Hochdurchsatz-Sequenzierung von Adenin-methylierten DNA-Fragmenten

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Paralleler Hochdurchsatz-Single Molecule Kinetic Assay für standortspezifische DNA-Spaltung

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Modifizierte Methoden zum Laden von DNA-Extraktionsplatten mit hohem Durchsatz reduzieren das Kontaminationspotenzial

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...