Name: generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)
Uploaded: 2013-04-19T13:00:00
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काम फिलाडेल्फिया के बच्चों के अस्पताल से एक संस्थान विकास पुरस्कार द्वारा समर्थित है.

1. क्रॉस लिंक Chromatin <ol><li> 100x20mm सेल संस्कृति बर्तन में कोशिकाओं को विकसित. कोशिकाओं की राशि 1 से सेल प्रकार के आधार पर पकवान प्रति 10 लाख की कोशिकाओं को लेकर कर सकते हैं. लगभग 2 मिलियन कोशिकाओं एक immunoprecipitation के लिए पर्...

<ol>
	<li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. 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Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li><li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels.">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li><li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes.">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li><li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants.">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li><li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes.">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li><li>Salonen, J. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+in+vivo.">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li><li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate.">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li></ol>

बहुत हाल ही में अन्य प्रतिलेखन कारक 2,3 के साथ प्रदर्शित किया गया है, क्योंकि यह अब चिप seq का उपयोग कर प्रोटीन डीएनए बातचीत संघ की एक जीनोम चौड़ा प्रोफ़ाइल से बाहर ले जाने के लिए संभव है. एक सफल अनुक्रमण...

कई सालों के लिए विशेष रूप से किसी दिए गए प्रोटीन जीनोम चौड़ा, प्रतिलेखन कारक वर्ग में उन लोगों से बंधे और विनियमित जीन के सेट की पहचान करने के लिए एक unmet की आवश्यकता हुई है. Odom एट अल. 1 व्यवस्थित मानव यकृत और अग्नाशय islets में पूर्व निर्धारित transcriptional नियामकों के कब्जे में जीनों की पहचान करने के लिए प्रमोटर प्रोटीन के साथ संयुक्त chromatin immunoprecipitation (चिप) का इस्तेमाल किया. इसके बाद जॉनसन एट अल. 2 व्यापक पूरे स्तनधारी जीनोम भर में प्रोटीन डीएनए बातचीत नक्शा करने के क्रम में प्रत्यक्ष अल्ट्रा उच्च throughput डीएनए अनुक्रमण (चिप seq) के आधार पर एक बड़े पैमाने पर chromatin immunoprecipitation परख विकसित. एक परीक्षण के मामले के रूप में, वे vivo में मानव जीनोम में 1946 स्थानों पर न्यूरॉन प्रतिबंधात्मक रवशामक कारक (NRSF) के बंधन मैप किया. डेटा मैं दोनों में मदद की जो बाध्यकारी स्थिति के तेज संकल्प (+ 50 आधार जोड़े), प्रदर्शितरूपांकनों और NRSF बाध्यकारी रूपांकनों की पहचान की solation. ये चिप seq डेटा भी उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता और सांख्यिकीय विश्वास (पी &lt;10 -4), नए उम्मीदवार बातचीत inferring के लिए महत्वपूर्ण हैं कि गुण था. रॉबर्टसन एट अल. 3 भी में STAT1 लक्ष्य नक्शा करने के क्रम में चिप seq इस्तेमाल किया इंटरफेरॉन γ (IFN-γ) उत्तेजित और vivo में मानव हेला S3 कोशिकाओं unstimulated. चिप seq करके, 15.1 और 12.9 मिलियन विशिष्ट मैप किया अनुक्रम पढ़ता है, और कम से कम 0,001 की अनुमानित झूठे खोज दर का उपयोग कर, वे क्रमशः, उत्तेजित और unstimulated कोशिकाओं में 41582 और 11004 ख्यात STAT1 बाध्यकारी क्षेत्रों की पहचान की. STAT1 इंटरफेरॉन उत्तरदायी बाध्यकारी साइटों 4-8 रोकने के लिए जाना जाता है 34 स्थलों की, चिप seq 24 (71%) पाया. चिप seq लक्ष्य जाना जाता STAT1 बाध्यकारी रूपांकनों के लिए इसी तरह के दृश्यों में समृद्ध थे. दो मौजूदा चिप पीसीआर डेटा के साथ तुलना सुझाव सेटउस चिप seq संवेदनशीलता 70% और 92% और विशिष्टता थी कम से कम 95% के बीच था. इसके अतिरिक्त, यह चिप seq गहराई अनुक्रमण के साथ बढ़ जाती है कि कम विश्लेषणात्मक जटिलता और संवेदनशीलता दोनों प्रदान करता है कि स्पष्ट था. इस तरह, &quot;अगली पीढ़ी&quot; जीनोम अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों 9 पुराने प्रौद्योगिकियों पर उत्पन्न प्रभावी ढंग से लागत जा सकता है कि अनुक्रम की राशि में परिमाण वृद्धि 1-2 आदेश प्रदान करते हैं. चिप seq तरीकों इसलिए सीधे स्तनधारी प्रोटीन डीएनए बातचीत 3 के प्रभावी रूपरेखा के लिए पूरे जीनोम कवरेज प्रदान करते हैं. 2006 में, प्रतिलेखन कारक 2 7 की तरह (TCF7L2) टाइप 2 मधुमेह के साथ जीन में वेरिएंट की एक मजबूत संघ 10 की खोज की थी. अन्य जांचकर्ताओं पहले से ही स्वतंत्र रूप से प्रकृति 11,12 में प्रकाशित टाइप 2 मधुमेह के पहले जीनोम चौड़ा संघ अध्ययन से, दिलचस्प, विभिन्न जातियों में इस खोज दोहराया और है </sकहीं&gt;, विज्ञान 13-15 और 16,17 ऊपर, मजबूत सहयोग TCF7L2 साथ वास्तव में था, यह अब 18-20 तारीख करने के लिए टाइप 2 मधुमेह में सबसे महत्वपूर्ण आनुवंशिक निष्कर्ष माना जाता है. इसके अलावा, TCF7L2 कैंसर के खतरे को 21,22 से जोड़ा गया है, कोलोरेक्टल कार्सिनोमा सहित कैंसर के एक नंबर, के जीनोम चौड़ा संघ अध्ययन से पता चला 8q24 ठिकाना, एक चरम नदी के ऊपर के कारण होना दिखाया गया था, जब वास्तव में, इस संबंध में अधिक स्पष्ट हो गया TCF7L2 बाध्यकारी तत्व MYC 23,24 के प्रतिलेखन चला. जैसे, इस कुंजी प्रतिलेखन कारक द्वारा विनियमित बहाव के जीन का पता लगाने में बहुत रुचि है. कार्यप्रणाली का एक उदाहरण के रूप में TCF7L2 के साथ अनुभव के आधार पर, इस कागज उच्च गुणवत्ता चिप डीएनए टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए रूपरेखा. चिप एक उच्च Resol बनाने के क्रम में बाद में अनुक्रमण के लिए, कोलोरेक्टल कार्सिनोमा सेल लाइन, HCT116 में बाहर किया गया थाजटिल लक्षण के रोगजनन में अपनी प्रमुख भूमिका में आगे अंतर्दृष्टि उपज के लिए एक प्रयास में TCF7L2 25 से बंधे जीन की ution नक्शा.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-ChIP Kit </td>
 <td>Millipore </td>
 <td>17-371 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GoTaq Hot Start Polymerase </td>
 <td>Promega</td>
 <td>M5001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Misonix Sonicator</td>
 <td>Qsonica </td>
 <td>XL-2000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 NanoDrop 1000 Spectrophotometer </td>
 <td>
 Thermo-Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Positive control primer sequences (TCF7L2-1) 
 Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' 
 Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' 
 Negative control primer sequences (CTRL-1) 
 Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3'
 
 Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)

Chromatin immunoprecipitation (चिप) के संयोजन और व्यापक समानांतर अनुक्रमण विवो में प्रतिलेखन कारकों से बंधे स्तनधारी डीएनए दृश्यों के प्रदर्शनों की सूची की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, जहां चिप अनुक्रमण (चिप seq) तरीकों सीधे, पूरे जीनोम कवरेज प्रदान करते हैं. &quot;अगली पीढ़ी&quot; जीनोम अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों हो सकता है कि अनुक्रम की राशि में परिमाण वृद्धि 1-2 आदेश प्रदान लागत प्रभावी ढंग से इस प्रकार सीधे स्तनधारी की प्रभावी रूपरेखा के लिए पूरे जीनोम कवरेज प्रदान करने के लिए चिप seq तरीकों की अनुमति के लिए पुराने प्रौद्योगिकियों पर उत्पन्न प्रोटीन डीएनए बातचीत. सफल चिप seq दृष्टिकोण के लिए, एक उच्च गुणवत्ता चिप डीएनए टेम्पलेट सबसे अच्छा अनुक्रमण परिणामों को प्राप्त करने के लिए उत्पन्न होगा. विवरण सबसे जोरदार टाइप 2 मधुमेह, अर्थात् प्रतिलेखन कारक प्रतिलेखन कारक 2 7 की तरह (TCF7L2 के रोगजनन में फंसा जीन के प्रोटीन उत्पाद के साथ अनुभव के आसपास आधारित है). यह पहलू भी विभिन्न तरह के कैंसर में फंसा दिया गया. दिये रोगजनन में अपनी प्रमुख भूमिका में और अधिक जानकारी देने, TCF7L2 से बंधे निर्धारित करने के जीन अनुक्रमण के माध्यम से एक उच्च संकल्प नक्शे बनाने के लिए, कोलोरेक्टल कार्सिनोमा सेल लाइन, HCT116 से व्युत्पन्न उच्च गुणवत्ता चिप डीएनए टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए है जटिल लक्षण की.

क्रोमेटिन sonicated किया गया है और RNase और proteinase के साथ इलाज किया गया है एक बार, 2% agarose जेल पर चलाने के नमूने वांछित आकार में डीएनए के थोक के साथ एक धब्बा मौजूद होना चाहिए. कई अलग चक्र का परीक्षण कर रहे हैं, आकार में एक क...

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Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

chromatin immunoprecipitation और अति उच्च throughput अनुक्रमण (चिप seq) के संयोजन एक दिया ऊतक या सेल लाइन में प्रोटीन डीएनए बातचीत की पहचान और नक्शा कर सकते हैं. दिये एक उदाहरण के रूप में प्रतिलेखन कारक TCF7L2 साथ अनुभव का उपयोग करते हुए बाद में अनुक्रमण के लिए एक उच्च गुणवत्ता चिप टेम्पलेट, उत्पन्न करने के लिए है.

उच्च throughput अनुक्रमण के लिए उच्च गुणवत्ता chromatin immunoprecipitation डीएनए टेम्पलेट की पीढ़ी (चिप seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

उच्च throughput अनुक्रमण द्वारा MicroRNA quantitation के लिए छोटे आरएनए अणुओं की अत्यधिक कुशल Ligation

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा लक्षित

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

पोस्ट-transcriptionally विनियमित जीन का रासायनिक Modulators के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

एराबिडोप्सिस प्रोटीन डीएनए बातचीत की पहचान के लिए chromatin immunoprecipitation परख<em&gt; Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-सेक: Adenine-methylated डीएनए टुकड़े के उच्च throughput अनुक्रमण द्वारा प्रोटीन डीएनए सहभागिता के जीनोम चौड़ा मानचित्रण

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

रेट्रोवायरल एकता स्थलों की प्रवर्धन, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, और जीनोमिक डीएनए का मिलान

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

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उच्च throughput CRISPR वेक्टर निर्माण और डीएनए संशोधनों की विशेषता टमाटर रोंआर जड़ें की पीढ़ी द्वारा

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

पूरे प्रोटीन संतृप्ति mutagenesis पुस्तकालय के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल का उपयोग उच्च throughput अनुक्रमण

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

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साइट-विशिष्ट डीएनए क्लीवेज के लिए समानांतर उच्च थ्रूपुट एकल अणु गतिज परख

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

उच्च थ्रूपुट डीएनए निष्कर्षण प्लेटों के लोडिंग के लिए संशोधित तरीके संदूषण के लिए क्षमता को कम करते हैं

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