Name: generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)
Uploaded: 2013-04-19T13:00:00
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Il lavoro è supportato da un Premio Istituto per lo sviluppo da Ospedale Pediatrico di Filadelfia.

1. Cross-Link cromatina <ol><li> Crescere le cellule in piatti di coltura di cellule 100x20mm. La quantità di celle può variare da 1 a 10 milioni di cellule per piastra seconda del tipo cellulare. Circa 2 milioni di cellule è sufficiente per una immunoprecipitazione. </li><li> Cellule del legame incrociato a 1% di formaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente con dondolo occasionale. </li><li> Quench reticolazione aggiungendo una concentrazione finale di 125 mM glicina e incubare per 5 min a temperatura ambiente...

<ol>
	<li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li><li>Reich, N. C., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+STAT+nuclear+traffic.">Tracking STAT nuclear traffic.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612 (2006).</li><li>Lodige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+export+determines+the+cytokine+sensitivity+of+STAT+transcription+factors.">Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).</li><li>Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+between+IFNgamma+and+TLR+signalling+pathways+in+macrophages.">Signal integration between IFNgamma and TLR signalling pathways in macrophages.</a> Immunobiology. 211, 511-524 (2006).</li><li>Vinkemeier, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+message+across,+STAT!+Design+principles+of+a+molecular+signaling+circuit.">Getting the message across, STAT! Design principles of a molecular signaling circuit.</a> The Journal of Cell Biology. 167, 197-201 (2004).</li><li>Brierley, M. M., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stats:+multifaceted+regulators+of+transcription.">Stats: multifaceted regulators of transcription.</a> J. Interferon Cytokine Res. 25, 733-744 (2005).</li><li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+re-sequencing.">Whole-genome re-sequencing.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 16, 545-552 (2006).</li><li>Grant, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+gene+confers+risk+of+type+2+diabetes.">Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 38, 320-323 (2006).</li><li>Sladek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+identifies+novel+risk+loci+for+type+2+diabetes.">A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes.</a> Nature. 445, 881-885 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wellcome+Trust+Case+Control+Consortium.+Genome-wide+association+study+of+14,000+cases+of+seven+common+diseases+and+3,000+shared+controls.">Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li><li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels.">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li><li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes.">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li><li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants.">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li><li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes.">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li><li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations:+The+DiaGen+Consortium.">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li><li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCF7L2:+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA.">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li><li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+TCF7L2.">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li><li>Hattersley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+suspect:+the+TCF7L2+gene+and+type+2+diabetes+risk.">Prime suspect: the TCF7L2 gene and type 2 diabetes risk.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 2077-2079 (2007).</li><li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells.">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li><li>Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+the+TCF-4+gene+(TCF7L2)+to+human+chromosome+band+10q25.3.">Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3.</a> Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).</li><li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer.">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li><li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling.">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li><li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+in+vivo.">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li><li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate.">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li></ol>

E &#39;ora possibile effettuare un genoma profilo di proteina-DNA associazione interazioni utilizzando ChIP-Seq, come è stato di recente dimostrato con altri fattori di trascrizione 2,3. La chiave per un esito sequenziamento di successo è la generazione di un modello di alta qualità cromatina immunoprecipitazione DNA. Una volta che il DNA templato è stato generato e accertato essere opportunamente arricchito, si può poi prendere in preparazione per la successiva raccolta sequ...

Per molti anni c&#39;è stato un bisogno insoddisfatto per identificare l&#39;insieme di geni legati e regolata da una proteina determinato genoma, in particolare quelli della classe fattore di trascrizione. Odom et al. 1 usato immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in combinazione con microarrays promotore per identificare sistematicamente i geni occupati dai regolatori trascrizionali pre-specificati, in fegato umano e di isole pancreatiche. Successivamente, Johnson et al. 2 sviluppato un saggio di immunoprecipitazione della cromatina larga scala basata sul sequenziamento del DNA ultra high throughput diretto (ChIP-seq) per mappare completo interazioni proteina-DNA in interi genomi dei mammiferi. Come banco di prova, hanno mappato in vivo il legame del fattore silenziatore neurone-restrittivo (NRSF) a 1946 posizioni nel genoma umano. I dati visualizzati forte risoluzione di posizione di rilegatura (+ 50 paia di basi), che ha facilitato sia l&#39;isolation di motivi e l&#39;identificazione di motivi NRSF vincolanti. Questi dati di ChIP-Seq avevano anche elevata sensibilità e specificità e confidenza statistica (P &lt;10 -4), proprietà che sono importanti per inferire nuove interazioni candidati. Robertson et al. 3 utilizzato anche ChIP-seq, al fine di mappare STAT1 obiettivi in interferone-γ (IFN-γ)-stimolato e non stimolate le cellule HeLa S3 umane in vivo. Da Chip-Seq, con 15,1 e 12,9 milioni di sequenza mappata univocamente legge, e un tasso stimato falsa scoperta di meno di 0.001, hanno identificato 41.582 e 11.004 putative regioni STAT1 vincolanti in cellule stimolate e non stimolate, rispettivamente. Dei 34 loci noti per contenere STAT1 interferone-reattiva siti 4-8 vincolante, ChIP-seq trovato 24 (71%). Obiettivi di ChIP-Seq sono stati arricchiti in sequenze simili a note STAT1 motivi di legame. Confronti con due dati di ChIP-PCR esistenti set suggeritiche la sensibilità ChIP-seq era tra il 70% e il 92% e la specificità era almeno il 95%. Inoltre, era chiaro che ChIP-seq offre sia a bassa complessità analitica e la sensibilità che aumenta con la profondità di sequenziamento. Come tecnologie come, del genoma &quot;nuova generazione&quot; di sequenziamento forniscono 1-2 ordini di grandezza della quantità di sequenza che può essere costo-efficace generato più vecchie tecnologie 9. Metodi di ChIP-Seq quindi forniscono direttamente la copertura dell&#39;intero genoma per un efficace profiling delle interazioni proteina-DNA di mammifero 3. Nel 2006, una forte associazione di varianti del fattore di trascrizione 7-like 2 (TCF7L2) gene con diabete di tipo 2 è stato scoperto 10. Altri ricercatori hanno già replicato indipendentemente questo risultato in diverse etnie e, curiosamente, dai primi studi di associazione genome-wide di diabete di tipo 2 pubblicati su Nature 11,12 </sup&gt;, Scienza 13-15 e altrove 16,17, l&#39;associazione più forte era effettivamente con TCF7L2, questo è ormai considerata la più significativa scoperta genetica nel diabete di tipo 2 a data 18-20. Inoltre, TCF7L2 è stato collegato al rischio di cancro 21,22, anzi, questa connessione è diventato più evidente quando il locus 8q24 rivelato da genoma ampi studi di associazione di un certo numero di tumori, tra carcinomi colorettali, ha dimostrato di essere dovuto ad un estremo a monte elemento TCF7L2 vincolante guida la trascrizione di MYC 23,24. Come tale, non vi è un grande interesse per la determinazione dei geni a valle regolati da questo fattore di trascrizione chiave. Sulla base dell&#39;esperienza con TCF7L2 come un esempio della metodologia, questo documento descrive come generare modello di DNA chip ad alta qualità. Chip è stato effettuato nella linea cellulare di carcinoma colorettale, HCT116, per la successiva sequenza per costruire un alto risolution mappa dei geni legati da TCF7L2 25 nel tentativo di dare una visione più completa per il suo ruolo chiave nella patogenesi di tratti complessi.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-ChIP Kit </td>
 <td>Millipore </td>
 <td>17-371 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GoTaq Hot Start Polymerase </td>
 <td>Promega</td>
 <td>M5001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Misonix Sonicator</td>
 <td>Qsonica </td>
 <td>XL-2000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 NanoDrop 1000 Spectrophotometer </td>
 <td>
 Thermo-Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Positive control primer sequences (TCF7L2-1) 
 Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' 
 Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' 
 Negative control primer sequences (CTRL-1) 
 Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3'
 
 Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)

(ChIP-seq) metodi di ChIP-sequencing offrono direttamente la copertura dell&#39;intero genoma, in cui combina immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e il sequenziamento massivamente parallelo può essere utilizzato per identificare il repertorio di sequenze di DNA di mammifero vincolati da fattori di trascrizione in vivo. &quot;Next-generation&quot; tecnologie di sequenziamento del genoma forniscono 1-2 ordini di grandezza della quantità di sequenza che può essere costo-efficace generato più vecchie tecnologie consentendo metodi di ChIP-Seq per fornire direttamente la copertura dell&#39;intero genoma per un efficace profiling dei mammiferi interazioni proteina-DNA. Per successo approcci ChIP-Seq, si deve generare DNA stampo circuito integrato di alta qualità per ottenere i migliori risultati di sequenziamento. La descrizione è basata attorno esperienza con il prodotto proteico del gene più fortemente implicato nella patogenesi del diabete di tipo 2, cioè il fattore di trascrizione fattore di trascrizione 7-like 2 (TCF7L2). Questo fattore è stato anche implicato in vari tumori. Delineato è come generare modello di DNA circuito integrato di alta qualità derivato dalla linea cellulare di carcinoma del colon-retto, HCT116, al fine di costruire una mappa ad alta risoluzione attraverso il sequenziamento di determinare i geni legati da TCF7L2, dando una visione più completa per il suo ruolo chiave nella patogenesi di tratti complessi.

Una volta che la cromatina è stato sonicato e sono stati trattati con RNasi e proteinasi, i campioni eseguiti sul gel di agarosio 2% dovrebbero presentare uno striscio con il grosso del DNA alla dimensione voluta. Se più cicli differenti vengono testati, una graduale diminuzione della dimensione dovrebbe essere visto come il numero di cicli di aumento (Figura 2). Dopo aver completato la porzione immunoprecipitazione del protocollo di arricchimento può sia essere controlla...

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Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

La combinazione di immunoprecipitazione della cromatina e sequenziamento ultra-high-throughput (ChIP-seq) in grado di identificare e mappare le interazioni proteina-DNA in una determinata linea di tessuti o cellule. Delineato è come generare un modello di chip per la successiva sequenza di alta qualità, utilizzando l&#39;esperienza con il fattore di trascrizione TCF7L2 come esempio.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

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