Name: generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)
Uploaded: 2013-04-19T13:00:00
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仕事はフィラデルフィアの小児病院から研究所開発賞によってサポートされています。

1。クロスリンククロマチン<ol><li> 100x20mm細胞培養皿で細胞を成長させる。細胞の量は、1〜細胞型に応じてディッシュあたり10万個の細胞の範囲とすることができる。約200万個の細胞は、一免疫沈降のために十分である。 </li><li>時折揺らしながら室温で10分間、1％ホルムアルデヒドでクロスリンク細胞。 </li><li>室温で5分間、125mMのグリシンとインキュベートの最終濃度を加えることによっ?...

<ol>
	<li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li><li>Reich, N. C., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+STAT+nuclear+traffic.">Tracking STAT nuclear traffic.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612 (2006).</li><li>Lodige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+export+determines+the+cytokine+sensitivity+of+STAT+transcription+factors.">Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).</li><li>Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+between+IFNgamma+and+TLR+signalling+pathways+in+macrophages.">Signal integration between IFNgamma and TLR signalling pathways in macrophages.</a> Immunobiology. 211, 511-524 (2006).</li><li>Vinkemeier, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+message+across,+STAT!+Design+principles+of+a+molecular+signaling+circuit.">Getting the message across, STAT! Design principles of a molecular signaling circuit.</a> The Journal of Cell Biology. 167, 197-201 (2004).</li><li>Brierley, M. M., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stats:+multifaceted+regulators+of+transcription.">Stats: multifaceted regulators of transcription.</a> J. Interferon Cytokine Res. 25, 733-744 (2005).</li><li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+re-sequencing.">Whole-genome re-sequencing.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 16, 545-552 (2006).</li><li>Grant, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+gene+confers+risk+of+type+2+diabetes.">Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 38, 320-323 (2006).</li><li>Sladek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+identifies+novel+risk+loci+for+type+2+diabetes.">A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes.</a> Nature. 445, 881-885 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wellcome+Trust+Case+Control+Consortium.+Genome-wide+association+study+of+14,000+cases+of+seven+common+diseases+and+3,000+shared+controls.">Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li><li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels.">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li><li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes.">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li><li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants.">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li><li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes.">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li><li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations:+The+DiaGen+Consortium.">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li><li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCF7L2:+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA.">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li><li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+TCF7L2.">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li><li>Hattersley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+suspect:+the+TCF7L2+gene+and+type+2+diabetes+risk.">Prime suspect: the TCF7L2 gene and type 2 diabetes risk.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 2077-2079 (2007).</li><li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells.">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li><li>Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+the+TCF-4+gene+(TCF7L2)+to+human+chromosome+band+10q25.3.">Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3.</a> Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).</li><li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer.">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li><li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling.">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li><li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+in+vivo.">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li><li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate.">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li></ol>

ごく最近他の転写因子2,3で実証されているように、それは、現在のChIP-以降を用いてタンパク質-DNA相互作用アソシエーションのゲノムワイドなプロファイルを行うことが可能である。成功したシークエンシングの結果への鍵は、高品質のクロマチン免疫沈降DNAテンプレートの生成である。 DNAテンプレートが生成され、適切に濃縮されたことが確認された後、一?...

長年にわたり、特に所定のタンパク質のゲノムワイド、転写因子のクラスのものに拘束され、規制を受けた遺伝子のセットを識別するために満たされていない必要があった。 オドムら 1は、系統的にヒト肝及び膵島であらかじめ指定された転写調節因子によって占有された遺伝子を同定するためのプロモーターマイクロアレイと結合しクロマチン免疫沈降（チップ）を使用しました。その後、ジョンソンら 2総合的全体哺乳類ゲノムにわたるタンパク質-DNA相互作用をマッピングするために直接超高スループットDNAシークエンシング（チップ-SEQ）に基づく大規模なクロマチン免疫沈降アッセイを開発しました。テストケースとして、彼らは、生体内でヒトゲノムに1946の場所にニューロン制限サイレンサー因子（NRSF）の結合をマップしました。 iの両方を促進結合位置のシャープな解像度（+ 50塩基対）を表示されたデータ、モチーフとNRSF結合モチーフの同定ゾル化。これらのChIP-seqのデータはまた、高感度、特異性および統計的信頼度（P &lt;10 -4）、新しい候補の相互作用を推定するために重要である特性を有していた。 ロバートソンら 3もでSTAT1ターゲットをマッピングするためにのChIP-seqのを使用したインターフェロン-γ（IFN-γ）で刺激し、 生体内でのヒトのHeLa S3細胞を刺激していない。のChIP-seqのことで、15.1と1290万一意にマッピングされたシーケンスが読み取り、0.001未満の推定偽発見率を使用して、彼らはそれぞれ、刺激し、刺激されていない細胞では41582と11004推定STAT1結合領域を同定した。 STAT1インターフェロン応答性結合部位の4-8を含むことが知られている34の遺伝子座のうち、チップseqが24（71％）を発見。のChIP-seqのターゲットは知らSTAT1結合モチーフに類似した配列に富んでいた。 2既存のChIP-PCRデータとの比較が示唆セットのChIP-seqの感度は70％と92％の特異性との間であったことは、少なくとも95％であった。さらに、それは、チップseqの深さを配列とともに増加低く、分析の複雑さと感度の両方を提供することが明らかになった。 このように、 &quot;次世代の&quot;ゲノムシーケンシング技術は、費用対効果的に古い技術9経由で生成することができます順序の量の大きさの増加の1-2注文を提供します。のChIP-seqの方法は、したがって、直接哺乳類タンパク質-DNA相互作用の3の効果的プロファイリングに全ゲノムカバレッジを提供。 2006年には、転写因子2 7-様（TCF7L2）2型糖尿病と遺伝子の変異の強い関連は10を発見されました。他の研究者は、すでに独立して自然 11,12年に出版、2型糖尿病の最初のゲノムワイド関連研究から、興味深いことに、さまざまな民族ではこの知見を複製しています</s他の場所で&gt;、 科学 13-15と16,17アップ、最強協会はTCF7L2と確かにあったが、これは今では2型糖尿病の中で最も重要な遺伝子の発見は18-20をこれまでに考えられている。また、TCF7L2は癌リスク21,22にリンクされている;大腸癌を含む癌の数、のゲノムワイド関連研究によって明らかになった8q24の軌跡は、極端なアップストリームに起因することが示されたときに確かに、この接続がより明らかになりましたTCF7L2結合要素はMYC 23,24の転写を駆動する。このように、この重要な転写因子によって調節下流の遺伝子を決定することに大きな関心がある。 方法論の例としてTCF7L2と経験をもとに、本論文では、高品質のチップのDNAテンプレートを生成する方法を概説します。チップは高レゾールを構築するために、後続の配列決定のために、HCT116、結腸直腸癌細胞株において行った複雑な形質の病因におけるその重要な役割にさらなる洞察を得るための努力でTCF7L2 25により拘束遺伝子のutionマップ。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-ChIP Kit </td>
 <td>Millipore </td>
 <td>17-371 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GoTaq Hot Start Polymerase </td>
 <td>Promega</td>
 <td>M5001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Misonix Sonicator</td>
 <td>Qsonica </td>
 <td>XL-2000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 NanoDrop 1000 Spectrophotometer </td>
 <td>
 Thermo-Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Positive control primer sequences (TCF7L2-1) 
 Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' 
 Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' 
 Negative control primer sequences (CTRL-1) 
 Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3'
 
 Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)

クロマチン免疫沈降（ChIPの）を組み合わせて、超並列配列決定は、in vivoでの転写因子によって結合哺乳類のDNA配列のレパートリーを識別するために利用できる場所のChIP-シーケンシング（のChIP-seqの）メソッドを直接、全ゲノムカバレッジを提供する。 &quot;次世代&quot;ゲノムシーケンシング技術は、費用対効果的にこうして直接哺乳類の効果的なプロファイリングに全ゲノムカバレッジを提供するためのChIP-seqの方法を可能に古い技術の上に生成することができます順序の量で大きさの増加1-2受注を提供タンパク質-DNA相互作用。 成功したChIP-seqのアプローチの場合、人は最高のシークエンシング結果を得るために、高品質のチップDNAテンプレートを生成する必要があります。説明はすなわち最も強く、2型糖尿病の病因に関与する遺伝子のタンパク質産物の経験、転写因子の転写因子7のような2（TCF7L2に基づいています）。この因子はまた、種々の癌に関与している。 概説病因におけるその重要な役割にさらなる洞察を与えて、TCF7L2によって結合する遺伝子を決定するために配列決定を介して高解像度のマップを構築するために、HCT116、結腸直腸癌細胞株に由来する高品質のChIP DNAテンプレートを生成する方法である複雑な形質の。

クロマチンは、超音波処理されており、RNアーゼおよびプロテイナーゼで処理された後、2％アガロースゲル上で実行するサンプルは、所望の大きさのDNAの大部分でスメアを提示しなければならない。いくつかの異なるサイクルが試験される場合、サイズが徐々に減少がサイクル数が増加する（ 図2）として見られるべきである。 プロトコルの免疫沈降部が完?...

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Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

クロマチン免疫沈降法と超高スループットシーケンシング（チップ-SEQ）の組み合わせは、所定の組織または細胞株におけるタンパク質-DNA相互作用を特定し、マッピングすることができます。概説としては、例えば、転写因子TCF7L2の経験を使用して、その後の配列決定のための高品質のChIPテンプレートを生成する方法である。

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-配列：アデニンメチル化DNA断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

ハイスループットシーケンシングを利用し全体プロテイン飽和突然変異誘発ライブラリの機能評価のためのプロトコル

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

部位特異的DNA切断のための並列高スループット単一分子運動アッセイ

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

高スループットDNA抽出プレートの装填のための改変方法により、汚染の可能性を低減

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...