Name: generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)
Uploaded: 2013-04-19T13:00:00
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작품은 필라델피아의 아동 병원에서 연구원 개발 포상에 의해 지원됩니다.

1. 상호 링크 염색질 <ol><li> 100x20mm 세포 배양 접시에 세포를 성장. 세포의 양이 1 세포의 종류에 따라 접시 당 1,000 만 셀에 이르기까지 다양하실 수 있습니다. 약 2 백만 세포는 하나의 면역 침전 충분합니다. </li><li> 가끔 흔들 실온에서 10 분 동안 1 %의 포름 알데히드의 가교 세포. </li><li> 상온에서 5 분 동안 125 mM의 글리신과 부화의 최종 농도를 추가하여 상호 연결을 끄다. </li><li> 1X 인산염과 세?...

<ol>
	<li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li><li>Reich, N. C., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+STAT+nuclear+traffic.">Tracking STAT nuclear traffic.</a> Nat. Rev. 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Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li><li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels.">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li><li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes.">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li><li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants.">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li><li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes.">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li><li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations:+The+DiaGen+Consortium.">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li><li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCF7L2:+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA.">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li><li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+TCF7L2.">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li><li>Hattersley, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer.">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li><li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling.">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li><li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+in+vivo.">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li><li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate.">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li></ol>

아주 최근에 다른 전사 인자 2,3로 입증되었습니다로서, 지금은 칩 SEQ를 사용하여 단백질 DNA 상호 작용 협회의 게놈 전체 프로필을 수행 할 가능합니다. 성공적으로 시퀀싱 결과의 핵심은 높은 품질의 염색질의 immunoprecipitation의 DNA 템플릿의 세대입니다. DNA 템플릿을 생성하고 적절하게 풍성하게 할 ascertained되면, 하나는 후속 시퀀싱 라이브러리 준비에 걸릴 수 있습?...

몇 년 동안, 특히 특정 단백질 게놈 넓은 전사 인자 클래스의 사람들에 의해 바인딩 조절 유전자의 집합을 식별하는 unmet 필요가있다. 오돔 등. 1 체계적으로 인간의 간 및 췌장에서 미리 지정된 전사 규제에 의해 점령 유전자를 식별하는 발기인 마이크로 어레이와 함께 염색질의 immunoprecipitation을 (칩)를 사용. 그 후, 존슨 등 2. 종합적으로 전체 포유류의 게놈에 걸쳐 단백질 DNA 상호 작용을 매핑하기 위해 직접 매우 높은 처리량 DNA 시퀀싱 (칩 SEQ)를 기반으로 대규모 염색질 immunoprecipitation의 분석을 개발했습니다. 테스트 케이스로, 그들은 생체 내에서 인간 게놈 1946 년 위치에 신경 제한적인 소음 계수 (NRSF)의 바인딩을 매핑됩니다. 데이터는 내가 모두를 촉진 바인딩 위치 선명한 해상도 (+ 50 염기쌍)를 표시주제 및 NRSF 결합 모티프의 식별 solation. 이 칩 SEQ 데이터는 높은 민감도와 특이도 및 통계적 신뢰도 (P &lt;10 -4), 새로운 후보 상호 작용을 추론에 중요한 특성을 가지고 있었다. 로버트슨 등. 3도 STAT1 대상에 매핑하기 위해 칩 SEQ를 사용하여 인터페론-γ (IFN-γ) 자극 및 생체 내에서 인간의 헬라 S3 세포를 자극받지. 칩 서열, 15.1 및 12,900,000 고유 매핑 순서 읽고, 0.001의 추정 거짓 발견 속도를 사용하여, 그들은 각각 자극과 자극받지 않은 세포에서 41,582 및 11,004 추정 STAT1 결합 영역을 확인했다. STAT1 인터페론 반응 결합 부위 4-8를 포함하는 것으로 알려진 34 유전자 좌의, 칩 SEQ 24 (71 %)를 발견했다. 칩 SEQ 대상은 알려진 STAT1 바인딩 모티프와 유사한 서열에 충실 하였다. 기존의 두 칩 PCR 데이터와 비교 제안 설정이 칩 SEQ 민감도는 70 %와 92 %, 특이도했다 적어도 95 % 사이였다. 또한, 그것은 칩 SEQ 깊이를 연속으로 증가 낮은 분석의 복잡성과 민감성을 모두 제공한다는 것은 분명했습니다. 등 &quot;차세대&quot;게놈 시퀀싱 기술은 9 이전 기술을 통해 생성 된 비용 효율적으로 할 수 순서의 양에 크기가 증가 1-2 주문을 제공하기 때문에. 칩 SEQ 방법은 따라서 직접 포유류 단백질 DNA 상호 작용 3 효과적인 프로파일에 대한 전체 게놈의 범위를 제공합니다. 2006 년 전사 인자 2 7처럼 (TCF7L2) 제 2 형 당뇨병 유전자 변형의 강한 협회는 10 발견되었다. 다른 연구자들은 이미 독립적으로 자연 11,12에 발표 된 제 2 형 당뇨병의 첫 번째 게놈 넓은 협회 연구에서, 흥미롭게도 다른 인종이 발견을 복제하고있다 </s다른&gt; 과학 13 ~ 15 및 16, 17 위로, 강한 협회는 TCF7L2와 참이었다;이 지금은 18 ~ 20 연대를 제 2 형 당뇨병에서 가장 중요한 유전 발견으로 간주됩니다. 또한, TCF7L2은 암 위험 21,22에 연결되었습니다, 대장 암 등 암의 수의 게놈 넓은 협회 연구에 의해 밝혀 8q24 현장은 극도의 상류에 의한 것으로 표시되었을 때 실제로,이 연결은 더 분명되었다 TCF7L2 바인딩 요소는 MYC 23,24의 전사를 운전. 등이 주요 전사 인자에 의해 조절 하류 유전자를 결정에 큰 관심이있다. 방법의 예로 TCF7L2 경험을 바탕으로, 본 논문은 높은 품질의 칩 DNA 템플릿을 생성하는 방법을 설명합니다. 칩은 높은 레솔을 빌드 순서에서 다음 순서를 위해, 대장 암 세포주 HCT116에서 실시되었다복잡한 특성의 병인에있는 그것의 중요한 역할에 추가 통찰력을 얻을 수있는 노력에 TCF7L2 (25)에 의해 구속 유전자의 ution지도.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-ChIP Kit </td>
 <td>Millipore </td>
 <td>17-371 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GoTaq Hot Start Polymerase </td>
 <td>Promega</td>
 <td>M5001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Misonix Sonicator</td>
 <td>Qsonica </td>
 <td>XL-2000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 NanoDrop 1000 Spectrophotometer </td>
 <td>
 Thermo-Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Positive control primer sequences (TCF7L2-1) 
 Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' 
 Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' 
 Negative control primer sequences (CTRL-1) 
 Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3'
 
 Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)

염색질의 immunoprecipitation (칩)을 결합하고 대규모 병렬 염기 서열은 생체 내 전사 인자에 의해 구속 포유류 DNA 서열의 레퍼토리를 식별하기 위해 활용 될 수있는 칩 시퀀싱 (칩 SEQ) 방법은 직접 전체 게놈 범위를 제공합니다. &quot;다음 세대&quot;게놈 시퀀싱 기술은 할 수 순서의 양에 크기가 증가 1-2 순서를 제공하는 비용 효율적 따라서 직접적으로 포유류의 효과적인 프로파일에 대한 전체 게놈의 범위를 제공하는 칩 SEQ 방법을 허용하는 오래된 기술을 통해 생성 단백질 DNA 상호 작용. 성공적인 칩 서열 방식의 경우, 하나는 고품질의 칩 DNA 템플릿 최적의 시퀀싱 결과를 얻기 위해 생성해야합니다. 설명이 가장 강하게 제 2 형 당뇨병, 즉 전사 인자의 전사 인자 2 7처럼 (TCF7L2의 병인에 관여하는 유전자의 단백질 제품과 경험을 기반으로합니다). 이 요소는 각종 암에 연루되어있다. 설명은 병인의 핵심 역할에서 더 통찰력을 제공, TCF7L2 구속 유전자를 확인하는 순서를 통해 고해상도지도를 구축하기 위해 대장 암 세포주 HCT116에서 파생 된 고품질의 칩 DNA 템플릿을 생성하는 방법입니다 복잡한 특성의.

염색질은 초음파되어 RNase의와 단백질 분해 효소로 처리되고 나면, 2 % 아가로 오스 겔에서 실행되는 샘플은 원하는 크기의 DNA 대량으로 얼룩을 제시해야한다. 여러 가지 사이클을 테스트하는 경우 크기가 점차 감소 사이클 수가 증가 (그림 2)로 볼 수 있어야합니다. 프로토콜의 면역 침전 부분을 완료 한 후 농축은 어느 PCR 또는 실시간 PCR 확인할 수 있습니다. 아?...

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Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

연구

생물학

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

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고처리량 DNA 추출 플레이트의 로딩을 위한 수정된 방법은 오염 가능성을 감소시니다.

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