Name: generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)
Uploaded: 2013-04-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq at JoVE.com

Работа выполнена при поддержке Института развития премию из Детской больницы Филадельфии.

1. Перекрестные ссылки хроматина <ol><li> Рост клеток в 100x20mm блюда культуре клеток. Количество клеток может быть в диапазоне от 1 до 10 миллионов клеток на чашку в зависимости от типа клеток. Приблизительно 2 миллиона клеток является достаточным для одного иммунопреципитации. </li><li> Перекрес...

<ol>
	<li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li><li>Reich, N. C., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+STAT+nuclear+traffic.">Tracking STAT nuclear traffic.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612 (2006).</li><li>Lodige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+export+determines+the+cytokine+sensitivity+of+STAT+transcription+factors.">Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).</li><li>Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+between+IFNgamma+and+TLR+signalling+pathways+in+macrophages.">Signal integration between IFNgamma and TLR signalling pathways in macrophages.</a> Immunobiology. 211, 511-524 (2006).</li><li>Vinkemeier, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+message+across,+STAT!+Design+principles+of+a+molecular+signaling+circuit.">Getting the message across, STAT! Design principles of a molecular signaling circuit.</a> The Journal of Cell Biology. 167, 197-201 (2004).</li><li>Brierley, M. M., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stats:+multifaceted+regulators+of+transcription.">Stats: multifaceted regulators of transcription.</a> J. Interferon Cytokine Res. 25, 733-744 (2005).</li><li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+re-sequencing.">Whole-genome re-sequencing.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 16, 545-552 (2006).</li><li>Grant, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+gene+confers+risk+of+type+2+diabetes.">Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 38, 320-323 (2006).</li><li>Sladek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+identifies+novel+risk+loci+for+type+2+diabetes.">A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes.</a> Nature. 445, 881-885 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wellcome+Trust+Case+Control+Consortium.+Genome-wide+association+study+of+14,000+cases+of+seven+common+diseases+and+3,000+shared+controls.">Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li><li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels.">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li><li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes.">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li><li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants.">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li><li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes.">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li><li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations:+The+DiaGen+Consortium.">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li><li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCF7L2:+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA.">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li><li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+TCF7L2.">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li><li>Hattersley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+suspect:+the+TCF7L2+gene+and+type+2+diabetes+risk.">Prime suspect: the TCF7L2 gene and type 2 diabetes risk.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 2077-2079 (2007).</li><li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells.">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li><li>Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+the+TCF-4+gene+(TCF7L2)+to+human+chromosome+band+10q25.3.">Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3.</a> Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).</li><li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer.">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li><li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling.">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li><li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+in+vivo.">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li><li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate.">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li></ol>

Это теперь возможно проводить генома профиля белок-ДНК взаимодействия ассоциации с помощью чип-далее, как было недавно продемонстрировано с другими факторами транскрипции 2,3. Ключ к успешным результатам секвенирования поколения высокого качества шаблона хроматина ДНК иммуноп?...

На протяжении многих лет наблюдается неудовлетворенная потребность определить набор генов связаны и регулируются геном данного белка широко, в частности, в классе фактора транскрипции. Одом и соавт. 1 использован иммунопреципитацию хроматина (чип) в сочетании с промоутером микрочипов в систематическом выявлении генов занимают заранее оговоренное транскрипционных регуляторов в человеческой печени и панкреатических островков. Впоследствии Джонсон и др.. 2 разработана крупномасштабная хроматин иммунопреципитации на основе прямых ультра высокой пропускной секвенирования ДНК (чип-след), чтобы всесторонне карту белок-ДНК взаимодействия по всей геномах млекопитающих. В качестве теста случае, они отображаются в естественных условиях связывания нейронов-ограничительные глушителем фактора (NRSF) до 1946 мест в геноме человека. Отображаемые данные высоким разрешением связывания позиции (+ 50 пар оснований), что способствовало как яsolation мотивов и выявления NRSF-связывающих мотивов. Эти чипсеты-SEQ данных также была высокой чувствительностью и специфичностью и статистической достоверности (p &lt;10 -4), свойств, которые важны для выведения новых взаимодействий кандидата. Робертсон и др.. 3 также используется чип-SEQ с целью картирования STAT1 цели в γ-интерферона (IFN-γ) стимулировали и нестимулированных человека HeLa S3 клетки в живом организме. Чип-SEQ, используя 15,1 и 12,9 млн. однозначно отображается последовательность читает, и, по оценкам, ложных открытие менее 0,001, они определили 41 582 и 11 004 предполагаемых STAT1-связывающие области в стимулированных и стимулированных клеток соответственно. Из 34 локусов как известно, содержат STAT1-интерферона реагировать сайты связывания 4-8, чип-далее найдены 24 (71%). Обломок-SEQ цели были обогащены последовательности похожи на известные STAT1 связывающие мотивы. Сравнения с двумя существующими чип-PCR наборы данных предложеночто чип-сл чувствительность была между 70% и 92%, а специфичность была по крайней мере 95%. Кроме того, было ясно, что чип-SEQ предлагает как низкий аналитической сложности и чувствительности, которая увеличивается с глубиной секвенирования. Таким образом, геном &quot;следующего поколения&quot; секвенирования технологии обеспечивают 1-2 порядков увеличение количества последовательностей, которые могут быть экономически эффективно генерируются на старых технологий 9. Обломок-SEQ методами таким образом, напрямую обеспечит целого генома для эффективного охвата профилирование млекопитающих белок-ДНК взаимодействия 3. В 2006 году в сильной ассоциации из вариантов фактора транскрипции 7-подобный 2 (TCF7L2) гена с диабетом 2 типа был обнаружен 10. Другие исследователи уже самостоятельно реплицировать этот вывод в разных национальностей и, что интересно, с первого генома широкие исследования ассоциации диабета 2 типа опубликованы в Nature 11,12 </sвверх&gt;, науки и в других местах 13-15 16,17, самая сильная связь была действительно с TCF7L2; этого в настоящее время считается наиболее значительные генетические нахождения в сахарный диабет 2 типа на сегодняшний день 18-20. Кроме того, TCF7L2 была связана с риском рака 21,22, более того, эта связь стала более очевидной, когда локус 8q24 выявленные геномом широкого исследования ассоциативного ряда злокачественных опухолей, включая колоректальный рак, было показано, что в связи с крайним вверх TCF7L2-связывающим элементом, вызывающим транскрипции MYC 23,24. Таким образом, существует огромный интерес в определении нижестоящих генов регулируется настоящим ключевым фактором транскрипции. На основе опыта TCF7L2 как пример методологии, в настоящем документе описывается, как генерировать высокое качество чип ДНК. Чип проводили в толстой клеточной линии карциномы, НСТ116, для последующего секвенирования с целью создания высокого резольногоution карту генов связаны TCF7L2 25 в попытке получить дальнейшее понимание в свою ключевую роль в патогенезе сложных признаков.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-ChIP Kit </td>
 <td>Millipore </td>
 <td>17-371 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GoTaq Hot Start Polymerase </td>
 <td>Promega</td>
 <td>M5001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Misonix Sonicator</td>
 <td>Qsonica </td>
 <td>XL-2000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 NanoDrop 1000 Spectrophotometer </td>
 <td>
 Thermo-Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Positive control primer sequences (TCF7L2-1) 
 Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' 
 Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' 
 Negative control primer sequences (CTRL-1) 
 Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3'
 
 Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)

Обломок-последовательности (чип-далее) методы непосредственно предложить целого генома охвата, где объединение иммунопреципитации хроматина (чип) и массивных параллельных последовательностей могут быть использованы для идентификации репертуара млекопитающих ДНК связаны факторов транскрипции в естественных условиях. &quot;Следующего поколения&quot; секвенирование генома технологии обеспечивают 1-2 порядков увеличение количества последовательностей, которые могут быть экономически эффективно генерируются на старые технологии что позволяет чип-далее методы для непосредственного предоставления целого генома покрытия для эффективного профилированию млекопитающего белок-ДНК взаимодействий. Для успешного чип-последующие подходы, необходимо генерировать высокое качество чип ДНК-матрицы для получения наилучших результатов секвенирования. Описание основано вокруг опыт работы с белкового продукта гена наиболее сильно вовлечены в патогенез сахарного диабета 2 типа, а именно транскрипции фактора транскрипции фактора 7-подобный 2 (TCF7L2). Этот фактор также вовлечен в различные виды рака. Изложенные в том, как генерировать высокое качество щепы ДНК-матрице, полученные из клеточной линии колоректального рака, HCT116, в целях создания высокого разрешения карты по виртуализации, чтобы определить гены связаны TCF7L2, давая дальнейшее понимание в свою ключевую роль в патогенезе сложных признаков.

После того, хроматин был ультразвуком и были обработаны РНКазой и протеиназы, образцы подвергали электрофорезу на 2% агарозном геле должна представлять мазка с основной массой ДНК в нужный размер. Если несколько различных циклов тестирования, постепенное снижение размера следует расс...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq at JoVE.com

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Сочетание иммунопреципитации хроматина и сверхвысокой пропускной последовательности (чип-далее) может определять и белок-ДНК взаимодействия в данной линии ткани или клетки. Изложенные в том, как генерировать высокое качество щепы шаблон для последующего секвенирования, используя опыт с TCF7L2 транскрипционный фактор в качестве примера.

Генерация высших шаблона ДНК хроматина Качество Иммунопреципитация для высокопроизводительного секвенирования (чип-след)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Высокоэффективная Лигирование малых РНК молекул для микроРНК количественного путем высокопроизводительного секвенирования

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Целевые метилирования ДНК Анализ Следующее поколение Секвенирование

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Хроматина иммунопреципитации для идентификации Arabidopsis взаимодействий белок-ДНК<em&gt; В Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-след: Генома Отображение белок-ДНК взаимодействий с высокой пропускной секвенирования аденина-метилированных фрагментов ДНК

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplification, следующего поколения Секвенирование и геномную ДНК Mapping ретровирусных интеграции сайты

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Высокая пропускная способность CRISPR Конструирование вектора и характеристика ДНК Модификации генерацией Томатный волосистых корней

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Протокол для функциональной оценки цельного белка Насыщенность мутагенеза библиотек Использование высокого секвенирования

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Параллельная высокая пропускная способность одной молекулы кинетический анализ для сайта-специфического расщепления ДНК

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Модифицированные методы загрузки высокой пропускной способности пластин извлечения ДНК снижают потенциал загрязнения

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...