Name: a method for high fidelity optogenetic control of individual pyramidal neurons in vivo
Uploaded: 2013-09-02T16:30:00
Duration: 13 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institute on Drug Abuse (Nida) tilskud R01 DA24040 (DCC), University of Colorado Innovative Seed Grant (DCC), og Nida uddannelse tilskud T32 DA017637 (MVB).

1.. Virus opbevaring og tilberedning <ol><li> Brugen af ​​replikationsinkompetente AAV vektorer til at levere opsin gener til gnaverhjerne er godkendt til biosikkerhed niveau 1 (BSL-1) og kræver en ordentlig beskyttelse og håndtering procedurer som skitseret i den amerikanske regering publikation, biosikkerhed i Mikrobiologi og Biomedical Laboratories, som findes på Centers for Disease Control hjemmeside ( <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> ). </li><li> For at undgå gentagne fryse-tø cykler, pipette virus fra producentens hætteglas i mindre arbejdsgrupper portioner i en klasse II biosikkerhed kabinet og gemmer i en -80 ° C fryser. </li><li> Forud for stereotaktisk injektion, tillade en alikvot at tø på is og derefter kort spin ned med en bænk top centrifuge. </li><li> Langsomt efterfylde en Hamilton-glas sprøjte og kanyle med en lille mængde af silikone eller mineralolie.Sørg for at der ikke er nogen synlige luftbobler i sprøjten tønde. Sæt sprøjten ind i en mikroinjektor pumpe og fastgøre pumpen direkte til lodret stereotaktisk arm (dvs. stereotaktisk manipulator). </li><li> Sænk stereotaktisk arm, indtil spidsen af ​​nålen rører bunden af ​​virus alikvot røret. Bruge controlleren til mikroinjektor pumpe til at trække den ønskede mængde af virus (1,5 pi for en 1 gl injektion). </li><li> Alle materialer og overflader, der kommer i kontakt med virus skal dekontamineres med et desinfektionsmiddel, såsom klor (10%). </li></ol> 2. Kirurgi og virus Injektion <ol><li> Bedøve dyr med en ketamin (rotte, 125 mg / kg, ip) - xylazin (rotte, 10 mg / kg, ip) cocktail. At måle effektiviteten af ​​anæstesi, så tjek for en refleks reaktion på en tå knivspids og give supplerende doser af ketamin, hvis nødvendigt. Anvendelse af standard aseptisk kirurgiske metoder, placere dyr i et stereotaktisk apparat (David Kopf Ininstrumenter). </li><li> Foretag en midtlinjeincision gennem huden på toppen af ​​dyrets kranium med små kirurgiske saks eller skalpel. Forsigtigt adskille bindevæv og rengøre toppen af ​​kraniet med en lille knogle skraber. </li><li> Kontroller, at lederen af ​​dyret sådant niveau, at z koordinater for bregma og lambda er lige. Bestem stereotaxisk koordinater for målet hjerne område fra en hjerne atlas såsom The Rat Brain i stereotaktisk koordinater (George Paxinos og Charles Watson, Academic Press, 2007) eller musehjernen i stereotaktisk koordinater (Keith BJ Franklin og George Paxinos, Academic Press , 2007). Markere påtænkte injektionsstedet med en kirurgisk pen. </li><li> Tynd forsigtigt kraniet over målområdet under anvendelse af en håndholdt boremaskine og stoppe, når borekronen når bunden af ​​kraniet. Ved hjælp af et par ekstra fine pincet, fjern tyndet knoglen for at eksponere dura. </li><li> Placer kanylen over målet era og sænke nålen, indtil den rører dura og bruge dette punkt til at beregne z koordinat. Meget langsomt sænke kanylen ind i hjernen, indtil den korrekte z er nået. I denne protokol, det prelimbic region den mediale præfrontale cortex (2,7 mm forreste til bregma, ± 0,5 mm lateral med midterlinjen og -2.2 mm fra dura) eller dorsale subiculum (-6.0 mm forreste til bregma, ± 3,0 mm lateral med midterlinjen og -2.0 mm fra dura) er målrettet i en voksen Sprague Dawley hanrotte (ca. 275 g). </li><li> Injicer virus ved en hastighed på 0,1 ul / min. Når injektionen er fuldført vente 10 minutter før nålen trækkes ud for at undgå tilbagestrømning af virusset til hjernen overflade. </li><li> Brug en syning sutur med kanyle for at tætne huden og anvende antibiotika til såret. </li><li> Tidsforløbet for ChR2 og NpHR funktionelle udtryk fra AAV vektorer vil variere afhængigt af den eksperimentelle design og viral titer. Til dette forsøg in vivo </em&gt; optagelser blev udført 18-21 dage efter injektion. </li></ol> 3. Lys Levering og In vivo Registrering af ChR2 eller NpHR-udtrykkende neuroner <ol><li> Vedhæft en wolfram elektrode (~ 1-1,5 MOhm, pæle) til et glas kapillarrør (Fisher Scientific) ved hjælp af superlim. </li><li> Brug en fiber afisoleringsværktøj (Thorlabs) for at frilægge den nøgne ende af en multimode optisk fiber (200 um diameter kerne Thorlabs) og rene fiberspidsen med ethanol. Meget let score fiber spids med en kileformet diamant kniv (Thorlabs) og forsigtigt fjerne det overskydende fiber (fx med fine pincet). Fiberen skal kløve nemt ved stillingen. </li><li> Slut FC slutningen af fiber til PC-stikket på output port af en 200 mW enkelt diode laser ( <a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) med den ønskede bølgelængde. Sørg for, at passende beskyttelsesbriller er slidt på alle tidspunkter, når du arbejder med lasere. </li><li> Mål laser intensitet på spidsen af den optiske fiber ved hjælp af en optisk power meter ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Til in vivo-optagelser kan lysintensiteten så lidt som 20-100 mW / mm 2 pålideligt fremkalde ChR2-eller NpHR-medieret aktivering eller inaktivering af henholdsvis neuronal aktivitet. </li><li> Sæt den optiske fiber ind i kapillarrøret. Placer fiberspidsen ca 500 um over spidsen af ​​wolfram elektroden og binde et tyndt suturtråd to gange på nogle punkter nær spidsen, således at elektroden og fiberen er lige. Sørge for, at afstanden mellem spidsen af ​​elektroden og den nærmeste knude er lang nok til indføring til målområdet. </li><li> Forbered dyr som i trin 2.1 og 2.2 ovenfor. Brug det indledende kraniotomi som en guide til at lave en ny ren lille vindue i kraniet for at placere optrode ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Lave et lille snit på dura med en fin nål. </li><li> Sænk forsigtigt optrode gennem kraniet vinduet og ind i hjernen på den transducerede region ved hjælp af en mikromanipulator (Narishige). Derefter rykke optrode langsomt i 10-50 um trin, indtil fremkomsten af ​​en lys-responsiv celle. </li><li> En brugerdefineret software brugergrænseflade (NeuroLux Pro <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) skrevet i LabVIEW (National Instruments) bruges til at styre en enkelt diode laser og at visualisere og registrere igangværende neurale aktivitet. Registrerede signaler er fanget med en brin-20K (kation Scientific) forstærker båndpasfiltrerede (0,3-8 kHz) og en National Instruments analog til digital bord (NI USB-6009). Den NeuroLux Pro brugergrænseflade tillader valget af analoge indgange (vælg to kanaler til den neuronale og TTL signal) og digital udgang. Brugeren kan definere samplingfrekvensen (20 kHz), basisperioden (pre-lys), og post-lysperiode. Brugeren kan definere TTL laser stimulatipå pulsbredde, frekvens og stimulation (hvis frekvens er 20 Hz og stimulation periode er 500 msek er 10 laserpulser med defineret puls bredde leveret). Brugeren kan også vælge konstant lys levering (f.eks, figur 1). For gentagne optagelser, brugeren også kan definere antallet af puls tog og intervallet mellem togene. Data kan erhverves med eller uden optagelse på disken. </li><li> Efter optagelse, er dyrene bedøvet med ketamin / xylazin cocktail og transcardialt perfunderet med fysiologisk saltvand og paraformaldehyd (4%) for at verificere optrode placering og opsin udtryk. </li></ol>

<ol>
	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2 (3), e299 (2007).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics in the nonhuman primate.</a> Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).</li><li>Zhao, S., Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+in+the+localization+of+glutamic+acid+decarboxylase+and+Ca2+/calmodulin+protein+kinase+gene+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system.</a> Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).</li><li>McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+the+CNS.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS.</a> Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).</li><li>Cardin, J. A., Carlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+local+circuits+in+vivo:+Integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity.">Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).</li><li>Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+optogenetic+silencing+of+orexin/hypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice.">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

En bred vifte af teknikker er til rådighed for genetisk målretning mikrobielle opsin gener til diskrete områder af hjernen hos gnavere. Viral genlevering tilvejebringer en relativt billig og hurtig metode til at mediere ChR2 og NpHR udtryk med celletype-specificitet. AAV vektor systemer er et fælles valg til brug i optogenetic eksperimenter på grund af høje produktionsomkostninger titre, der forbliver stabil under opbevaring, dens mangel på patogenicitet og dens evne til at producere langsigtede genekspression 10. Mange af opsin konstruktioner med celletype-specifikke promotorer, er kommercielt tilgængelige i en række forskellige AAV-serotyper fra vektor kerne, såsom University of Pennsylvania ( <a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a> ) eller University of North Carolina i Chapel Hill ( <a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a> ). En ulempe AAV teknologi erbegrænset emballage kapacitet (~ 4,7 kb), som lægger en begrænsning af transgen kassette størrelse, der kan bruges til at målrette celle-specifikke. Som et alternativ, lentivirale vektorer, som har en større emballage kapacitet, er i stand til at rumme opsin målrettet under kontrol af større promotorsekvenser. Brugen af ​​en optrode tillader pålidelig detektion af elektrofysiologiske signaler i kombination med timeligt-præcise lys levering. Som beskrevet ovenfor, er imidlertid behov for tilstrækkelig omhu i sin opbygning. Da det kløvede optiske fiber er skrøbelige, kan binde suturtråd for stramt forårsage fiberen til at knække. Selvom optrode kan anvendes til flere optagelser, skal elektroden og optiske fibre skal renses (eller manuelt spaltes i tilfælde af den optiske fiber nøgne ende) før indsættelse, fordi impedansen af ​​elektroden og kvalitet af den leverede lys vil forringe med gentagen brug. Under electrophysiological optagelser er det vigtigt, at optrode fremføres langsomt. Den optrode anvendes her har cirka 350 um tykkelse (wolframelektroden: 125 m; kerne optisk fiber: 200 um) og sænke det hurtigt kan føre til flytning af hjernevæv. Light-inducerede artefakter også kunne betragtes med særlig indspilning og lys levering set-ups 11-12. Selvom vi fandt ingen lysinduceret artefakt i vores eksperimentelle tilstand, kan optagelser uden den transducerede hjerneområde potentielt anvendes som en kontrol for lette artefakter. En anden overvejelse under optagelsen er for at observere ændringer i ChR2-eller NpHR-udtrykkende neuroner, især for lange varighed optagelser den krævede lysintensitet. Stærk laser intensitet og lang laserbelysning kan resultere i skader væv og / eller et nedsat respons på efterfølgende leveret lys 12-13. For adfærdsmæssige eksperimenter der kræves anvendelse af en kontrol viral vektor for LØSNINGg nogen effekt på grund af varme, der leveres fra fiberen. For mange af de kommercielt tilgængelige optogenetic konstruktioner der er komplementære kontrol konstruktioner, hvor opsin gensekvens er blevet fjernet. Det skal bemærkes, at manipuleret ChR2 varianter med forbedrede egenskaber og kinetik er blevet udviklet sammen med andre lyddæmpningssystemer opsiner, der kan være bedre egnet til visse forsoeg spørgsmål 14-15. For eksempel kan en ny ChR2 variant er etableret via målrettet mutagenese, betegnes &quot;Cheta&quot; kan drive high-fidelity neuronal spiking ved frekvenser (op til mindst 200 Hz) over det oprindelige ChR2 14. Kombinationen af in vivo lys levering og samtidig optagelse af neuronale reaktioner er et afgørende skridt i etableringen af årsagssammenhænge mellem mønstrede aktivitet i genetisk målrettede cellepopulationer og tilsvarende tid-låst adfærdsmæssige begivenheder. Procedurerne og hardware skitseret her giver en enkel tilgang til gennemførelsen optogenetics for in vivo head-faste optagelser i gnavere.

Evnen til at aktivere eller tavshed en specifik celletype i et neuralt kredsløb i et tidsmæssigt præcis måde er afgørende for at forstå, hvordan neurale kredsløb behandle forskellige typer af information underliggende følelser og kognition. Eksperimentel kontrol over intakt neurale aktivitet har ansat loss-/gain-of-function værktøjer (f.eks elektrisk stimulering, farmakologisk modulation, læsion), som ikke giver den nødvendige selektivt til styring specifikke populationer af neuroner, enten på en tidsmæssig eller rumlig skala. Direkte tage disse teknologiske udfordringer, har udviklingen og anvendelsen af ​​genetisk kodetegn lysfølsomme værktøjer aktiverede neuroforskere til at kontrollere den elektriske aktivitet i udvalgte celletyper under veldefinerede adfærdsmæssige begivenheder. Mange af disse lysfølsomme proteiner er af mikrobiel oprindelse med lys-gatede kation kanal, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, og lys-drevne chlorid pumpe, halorhodopsin (NpHR) 2,3, i udbredt brug. En stor fordel ved optogenetics er evnen til genetisk at målrette specifikke cellepopulationer i heterogene områder af hjernen, og teknikken er blevet anvendt med succes til en række model-organismer (hvirvelløse dyr til humane primater) 4-6. Mange optogenetic transgene dyr er blevet genereret og er kommercielt tilgængelige 7,8 dog oprettelse transgene linier kan være arbejdskrævende og uoverkommelig. Her beskriver vi en protokol for viralt medieret levering af ChR2 og NpHR gener under CaMKIIα promotor i rotte prelimbic cortex og dorsal subiculum hjælp af en rekombinant adeno-associeret virus (AAV) vektor. Inden forebrain, CaMKIIα udtryk er eksklusivt til glutamaterge pyramideneuroner 9. AAV er almindeligt anvendt til grundforskning på grund af sin relativt let produktion og manglende patogenicitet, samt den stærke og Persistent transgen udtryk, der er opnået med disse vektorer 10. Derudover har vi skitsere de skridt og hardware til simultan lys levering og optagelse i bedøvede head-faste rotter.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe </td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Removable Needle</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-03</td>
 <td>31 gauge, beveled tip</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microinjector Pump</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>UMP3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pump Controller</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-MICRO4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone Oil</td>
 <td>Alfa Aesar</td>
 <td>A12728</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laser Protective Eyeware</td>
 <td>Kentek </td>
 <td>KMT-4501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Optical Fiber</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>BFL37-200</td>
 <td>200 &mu;m diameter core, 0.37 NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber Stripping Tool</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>T12S21</td>
 <td>for 200 &mu;m diameter core multimode fiber</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Power Meter</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Photodetector</td>
 <td>Newport</td>
 <td>818-SL/DB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Green Laser (532 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tungsten/Fiber Optrode</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>Lumitrode</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Capillary Tube</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>22-362-566</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydraulic Micromanipulator</td>
 <td>Narishige</td>
 <td>MO-22</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Kation Scientific</td>
 <td>ExAmp-20K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquistion Device</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>NI USB-6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rodent Head Restraint for Recording</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic Unit</td>
 <td>David Kopf Instruments</td>
 <td>Model 963</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a method for high fidelity optogenetic control of individual pyramidal neurons in vivo

Optogenetic metoder er opstået som et effektivt værktøj til at belyse neurale kredsløb aktivitet bag et bredt sæt af adfærd på tværs af en bred vifte af arter. Optogenetic værktøjer mikrobiel oprindelse består af lysfølsomme membranproteiner, der er i stand til at aktivere (f.eks channelrhodopsin-2, ChR2) eller stilhed (f.eks halorhodopsin, NpHR) neurale aktivitet ingenetically definerede celletyper end adfærdsrelevante tidsskalaer. Vi først vise en enkel fremgangsmåde for adeno-associeret virus-medieret levering af ChR2 og NpHR transgener til den dorsale subiculum og prelimbic region af den præfrontale cortex hos rotter. Fordi ChR2 og NpHR genetisk målrettes, vi beskriver anvendelsen af denne teknologi til at styre den elektriske aktivitet af specifikke populationer af neuroner (dvs. pyramideformede neuroner) indlejret i heterogen væv med høj tidsmæssig præcision. Vi beskriver heri hardware, brugerdefinerede softwarebrugergrænsefladen, og procedurer, der giver mulighed for simultan lys levering og elektrisk optagelse fra transducerede pyramideneuroner i en bedøvet in vivo forberedelse. Disse lys-reagerende værktøjer giver mulighed for at identificere de kausale bidrag fra forskellige celletyper til informationsbehandling og adfærd.

Figur 1 viser et skærmbillede af den tilpassede software (NeuroLux Pro) udviklet i LabVIEW miljø (National Instruments), der anvendes til samtidig optagelse af neuronal aktivitet og regulering af lys pulsparametre (dvs. pulsfrekvens pulsbredde, stimulation periode). Softwareprogrammet sender et styresignal til en digital erhvervelse enhed, der genererer TTL pulser til kontrol over det indre diodelaser. Derudover Softwareprogrammet viser og gemmer den registrerede neuronal aktivitet og leveret TTL signaler. Disse signaler digitaliseres gennem købet enhed på et defineret sample rate (fx 20 kHz). Registrerede signaler gemmes som en todimensional dobbelt præcision array i en binær fil. Figur 2 viser den brugerdefinerede optrode bestående af en wolfram-elektrode fastgjort til en optisk fiber. En optisk fiber er fastgjort til elektroden ved hjælp af tynde suturtråd på trepunkter. Hvis det er nødvendigt, kan bruges superlim til at overholde dem. Men undgå permanent fastsættelse den optiske fiber til elektroden, fordi selv om elektroden kan genbruges flere gange, lystransmission gennem fiberen vil nedbrydes ved gentagen brug og skal spaltes og renses eller udskiftes med hver indsættelse i hjernen. Venstre paneler af Figur 3 viser fluorescerende billeder af forstærket gult fluorescerende protein, der indikerer en faktisk ChR2 og NpHR udtryk. Disse fotografier viser repræsentative NpHR udtryk i rotte dorsale subiculum (figur 3A) og ChR2 udtryk i prelimbic cortex (figur 3B). Viral udtryk var for det meste begrænset til det dorsale subiculum og prelimbic cortex (fx nogle fluorescens blev observeret i dentatgyrus (figur 3A, til venstre)). Sporene af elektroden (tynde spor, pil hoved) og optisk fiber (tyk spor, pil) blev også observeret. figur 4 viser, at ChR2 induceret tidsmæssigt præcise spiking rotte prelimbic cortex. 4A er et eksempel spor af ChR2-udløste virkningspotentialer som respons på 20 Hz levering af 10 msek blå lysimpulser til rotte prelimbic cortex. Raster plot (figur 4B) viser ChR2-induceret aktivering i seks repræsentative neuroner. Alle optagne neuroner viste lys-fremkaldte spiking med perfekt troskab. I modsætning til ChR2, NpHR hurtigt og reversibelt tavshed spontan aktivitet in vivo i rotte prelimbic cortex (højre panel i figur 4). Figur 4C er et eksempel spor viser, at kontinuerlig 532 nm belysning (10 s) i prelimbic cortex udtrykker NpHR under CaMKllα promotor eliminerer spontan enkelt enhed aktivitet in vivo. Bemærk, at den fuldstændige undertrykkelse af prelimbic pyramideformet celle aktivitet er tid-låst til 10 sek konstant lys levering. Lavis raster plot (figur 4D) viser NpHR-induceret nedregulering i seks repræsentative neuroner. Både in vivo-optagelser er typiske for dem, der opnås fra voksne Sprague-Dawley rotter, hvor AAV-medieret administration af mikrobielle opsin gener opstod 18-21 dage før. Figur 5 viser resultatet af gentagen ChR2 stimulering af en rotte prelimbic pyramideformet neuron. Blåt lys puls (10 ms) blev leveret ved 20 Hz for 5 sek (100 pulser i alt). Spænding spor af lys-fremkaldte spiking blev gentagne gange købt hver 2 min i løbet af en 2 timers optagelse (61 gentagelser i alt). Selv når du bruger denne gentagne stimulation protokol, ChR2 induceret stabil og robust spiking som reaktion på lys levering. Figur 6 og 7 viser resultaterne af NpHR-induceret photoinhibition og ChR2 drevet fotoaktivering af rotte-subicular neuron aktivitet. Som det er tilfældet i prelimbic cortex, NpHR og ChR2 var i stand til atmediere lysinduceret tid låst hæmning og aktivering af opsin transducerede subicular neuroner med høj reproducerbarhed. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" /> Figur 1. Screenshot af NeuroLux Pro software interface til samtidig lys levering og elektrofysiologiske optagelse. Afbilledet spor viser NpHR induceret undertrykkelse af spontan aktivitet af rotte prelimbic pyramideformet celle som reaktion på 10 sek kontinuerlig 532 nm lys levering. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" /> Figur 2. Høj effekt billede af brugerdefinerede optrode. En optisk fiber er indsat i glaskapillarrør fastgjort til en wolframelektroden og fastgøres til elektroden ved hjælp af suturtråd. Center-til-center afstand meleen elektrode spids og fiberspidsen er ca 500 um. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" /> Figur 3. Viral udtryk og optrode placering. (venstre) fotografier viser repræsentative NpHR udtryk i dorsal subiculum (A) og ChR2 udtryk i prelimbic cortex (B). (Højre) Skematisk der repræsenterer det sted, hvor hvert billede blev taget. Pilespidsen og pil i hvert billede angiver placeringen af ​​wolfram elektrode og optisk fiber, hhv. SUB: subiculum, GD: dentatgyrus, PL:. Prelimbic cortex <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" /> Figur 4.. In vivo elektrofysiologiske optagelser fra ChR2 eller NpHR-transducerede rotte prelimbic cortex. (A) Eksempel spor af ChR2-udløste handling potentialer i respons på 20 Hz levering af blå (473 nm) lysimpulser (10 msek, blå bar). (B) Raster plot viser ChR2-induceret spiking i seks repræsentative neuroner. Hver enhed aktivitet afbildes som en prik. (C) Eksempel spor af NpHR-induceret undertrykkelse af spontan aktivitet under kontinuerlig grøn (532 nm) lys belysning (10 sek, grøn bar). (D) Raster plot viser NpHR-induceret nedregulering i seks repræsentative neuroner. Hver enhed aktivitet er plottet som en prik. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" /> Figur 5. Gentagne 20 Hz ChR2 drevet spiking af en rotte prelimbic pyramideformet neuron in vivo. (A) Spænding spor af lys-fremkaldte spikingerhvervet på tidspunkterne 0, 30, 60, 90, 120 min efter starten af ​​optagelserne. (B) Raster plot, der viser alle 61 gentagelser (2 min inter-retssagen interval, 120 min alt) af lys-induceret aktivering. Hver enhed aktivitet er plottet som en prik. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" /> Figur 6.. In vivo elektrofysiologiske optagelser fra NpHR-transduced rotte dorsale subiculum. (A) Eksempel spor viser, at 10 sek kontinuerlig 532 nm lys (grøn bar) dorsale subiculum udtrykker NpHR eliminerer spontane aktivitet. (B) Gennemsnitlige bølgeformer af de to optagede enheder fra ovenstående spor. Amplituden tærskelværdi blev anvendt til at identificere to forskellige neuroner. (C) Raster plot viser fem gentagelses af NpHR-induceret undertrykkelse af disse enheder. Hver enhed aktivitet afbildes som en prik. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" /> Figur 7. Gentagne 20 Hz CR2 drevet spiking af en rotte dorsal subicular neuron in vivo. (A) Spænding spor af lys-evoked spiking erhvervet på det tidspunkt points 0, 30, 60, 90, 120 min efter starten på optagelserne. Indsat: typisk brister aktivitet i denne celle. (B) Raster plot, der viser alle 61 gentagelser (2 min inter-retssagen interval, 120 min alt) af lys-induceret aktivering. Hver enhed aktivitet er plottet som en prik. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> .

Watch this Scientific Journal Video about A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo at JoVE.com

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Den seneste udvikling i neurovidenskab værktøjer, som kombinerer genetik og optik, betegnes &quot;optogenetics&quot;, muliggør kontrol over neurale kredsløb aktivitet med et hidtil uset niveau af rumlige og tidsmæssige opløsning. Her giver vi en protokol for integration in vivo-optagelse med optogenetic manipulation af genetisk definerede delmængder af præfrontale cortex og subicular pyramideneuroner.

Metode til High Fidelity optogenetic Kontrol af Individuelle pyramideneuroner<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina Video (Video) | JoVE

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation Video (Video) | JoVE

Selektiv Viral transduktion af Voksen-fødte olfaktoriske neuroner for Kronisk In vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograd fluorescensmærkning Tillader Målrettet Extracellular Single-unit Optagelse fra Identificerede Neuroner<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI Video (Video) | JoVE

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering af Rodent centralnervesystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic Dissektion af Frygt Kredsløb i Brain Skiver

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

En forenklet metode til Ultra Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Kultur

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Optisk kontrol af en neuronal protein under anvendelse af en genetisk indkodede naturlig aminosyre i neuroner

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium billeddannelse af enkelte neuroner i opfører sig Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...