Name: a method for high fidelity optogenetic control of individual pyramidal neurons in vivo
Uploaded: 2013-09-02T16:30:00
Duration: 13 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным институтом по злоупотреблению наркотиками (NIDA) грант R01 DA24040 (ДКК), Университет Колорадо инновационного Seed Grant (DCC), и NIDA учебного гранта T32 DA017637 (MVB).

1. Вирус Хранение и подготовка <ol><li> Использование репликации некомпетентны AAV векторов для доставки генов опсина в мозге грызунов, предназначен для биобезопасности Уровень 1 (BSL-1) и требует надлежащей защиты и процедуры обработки, как описано в публикации американского правительства, биобезопасности в микробиологии и биомедицинских лабораториях, имеющихся в Центры по веб-сайте контролю и профилактике заболеваний в ( <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> ). </li><li> Для того, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания, вирус пипетки из флакона производителя в небольших рабочих аликвоты в Кабинете биобезопасности класса II и хранить в -80 ° C морозильник. </li><li> До стереотаксической инъекции, позволяют аликвотную таять на льду, а затем кратко спин вниз с лабораторной центрифуге. </li><li> Медленно засыпки стеклянную шприц и иглу с небольшим количеством силикона или минеральное масло Hamilton.Убедитесь, что нет никаких видимых пузырьков воздуха в цилиндре шприца. Вставьте шприц в microinjector насоса и прикрепить насос непосредственно к вертикальной стереотаксической руку (т.е. стереотаксической манипулятора). </li><li> Опустите стереотаксической руку, пока кончик иглы не коснется дна вирус аликвотной трубки. Используйте контроллер для microinjector насоса вывести нужный объем вируса (1,5 мкл для инъекций 1 мкл). </li><li> Все материалы и поверхности, которые вступают в контакт с вирусом должны быть дезактивированы с дезинфицирующим средством, таким как хлорного отбеливателя (10%). </li></ol> 2. Хирургии и Вирус впрыска <ol><li> Обезболить животное с кетамином (крысы; 125 мг / кг, внутрибрюшинно) - ксилазина (крыса; 10 мг / кг, внутрибрюшинно) коктейль. Чтобы оценить эффективность анестезии, проверьте рефлекторной ответ на носок щепотку и дать дополнительные дозы кетамина в случае необходимости. Используя стандартные асептические хирургические методы, поместите животное в стереотаксической аппарата (Дэвид Kopf Вstruments). </li><li> Сделать срединный разрез через кожу в верхней части черепа животных с небольшими хирургическими ножницами или скальпелем. Аккуратно отделить соединительную ткань и очистить верхней части черепа с небольшим костного скребка. </li><li> Убедитесь, что голова животного является уровень такой, что г-координаты брегмы и лямбда равны. Определить стереотаксические координаты для области мозга мишень с мозга атласа, таких как мозга крыс в стереотаксической Координаты (George Paxinos и Чарльз Уотсон, Academic Press, 2007) или мозга мыши в стереотаксической Координаты (Keith BJ Франклин и Джордж Paxinos, Academic Press , 2007). Отметить предполагаемого места введения с хирургической ручкой. </li><li> Осторожно тонкий череп над целевой области с помощью ручной дрели и остановится, когда сверло достигнет дна черепа. Используя пару дополнительных тонких щипцов, удалить утонченной кости, чтобы разоблачить твердую мозговую оболочку. </li><li> Расположите иглу шприца над целью являютсяи опустить иглу пока он не коснется твердую мозговую оболочку и использовать эту точку для расчета г координат. Очень медленно опустите инъекционной иглы в мозг, пока правильное положение г не будет достигнута. В этом протоколе, прелимбальной область медиальной префронтальной коре (2,7 мм впереди брегмы, ± 0,5 мм бокового к средней линии, и -2,2 мм от твердой мозговой оболочки) или спинной подлежащая ткань (-6.0 мм передней брегмы, ± 3,0 мм сбоку к средней линии, и -2,0 мм от твердой мозговой оболочки) предназначен для взрослого Sprague Dawley мужской крысы (около 275 г). </li><li> Введите вирус со скоростью 0,1 мкл / мин. После инъекции завершен ждать за 10 мин до извлечение иглы, чтобы избежать обратного потока вируса к поверхности мозга. </li><li> Используйте швейную нить с прикрепленными иглы для герметизации кожу и применять антибиотики к ране. </li><li> Временной ход ChR2 и NpHR функциональной экспрессии от AAV векторов будет варьироваться в зависимости от опытно-конструкторских и титра вируса. Для данного эксперимента в естественных условиях </eм&gt; записи были выполнены 18-21 дней после инъекции. </li></ol> 3. Свет Доставка и В ись от ChR2 или NpHR экспрессирующих нейронов <ol><li> Прикрепите вольфрамовым электродом (~ 1-1,5 МОм, микрозондов) в стеклянной капиллярной трубки (Fisher Scientific) с помощью супер клей. </li><li> Используйте волокна инструмент для снятия изоляции (Thorlabs), чтобы разоблачить оголенный конец многомодового оптического волокна (диаметр сердцевины мкм 200, Thorlabs) и чаевых чистым волокна с этанолом. Очень легко забить наконечник волокна с клиновидной алмазного ножа (Thorlabs) и тщательно удалить избыток клетчатки (например, с тонким пинцетом). Волокно должно легко расщеплять при счете. </li><li> Подключите конец ФК волокна к разъему ПК на выходной порт 200 мВт лазер одной диодной ( <a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) с требуемой длиной волны. Убедитесь в том, что соответствующие защитные очки носят во все времена при работе с лазерами. </li><li> Измерьте лAser интенсивность в оконечности оптического волокна с помощью оптического измеритель мощности ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Для естественных условиях записей в, интенсивность света всего лишь 20-100 мВт / мм 2 может надежно вызвать ChR2-или NpHR-опосредованную активацию или молчание, соответственно, активности нейронов. </li><li> Вставьте оптическое волокно в капиллярной трубке. Разместите наконечник волокна около 500 мкм над кончиком вольфрамового электрода и галстук тонкий шов нить дважды в нескольких точках вблизи вершины так, что электрод и слой прямые. Убедитесь, что расстояние между концом электрода и ближайшего узла достаточно долго для вставки в целевую область. </li><li> Подготовьте животное, как на этапах 2.1 и 2.2 выше. Использовать исходный трепанации черепа в качестве ориентира, чтобы сделать новую чистую небольшое окно в черепе для позиционирования optrode ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Сделайте небольшой надрез на дура с помощью тонкой иглы. </li><li> Осторожно опустите optrode через окно черепа и в мозг, чтобы трансдуцированной регионе с помощью микроманипулятора (Narishige). Тогда продвижения optrode медленно в 10-50 мкм шагов до появления легкой проблематику клетки. </li><li> Заказного программного обеспечения пользовательского интерфейса (NeuroLux Pro <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) написано в LabVIEW (National Instruments) используется для управления лазером один диод и визуализировать и записывать текущую нейронную активность. Записанные сигналы захватили с ExAmp-20K (Катион Научно) усилителя полосового фильтрованной (0.3-8 кГц), и National Instruments аналогового на цифровое борту (NI USB-6009). NeuroLux Pro пользовательский интерфейс позволяет выбор аналоговых входов (выбрать два канала для нейронов и TTL сигнала) и цифровой выход. Пользователь может определить примерную оценку (20 кГц), базовый период (до света), и после светового периода. Пользователь может определить TTL лазерный stimulatiот ширины импульса, частоты и периода стимуляции (если частота 20 Гц и стимулирование период составляет 500 мс, 10 лазерных импульсов с определенной ширины импульса поставляются). Пользователь также может выбрать непрерывную доставку света (например, Рисунок 1). Для повторных записей, пользователь также может определить количество импульсов и интервал между поездами. Данные могут быть получены с использованием или без записи на диск. </li><li> После записи, животных анестезируют с кетамин / ксилазина коктейль и транскардиально перфузировали физиологическим раствором и параформальдегида (4%), чтобы проверить размещение optrode и экспрессию опсина. </li></ol>

<ol>
	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2 (3), e299 (2007).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics in the nonhuman primate.</a> Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).</li><li>Zhao, S., Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+in+the+localization+of+glutamic+acid+decarboxylase+and+Ca2+/calmodulin+protein+kinase+gene+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system.</a> Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).</li><li>McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+the+CNS.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS.</a> Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).</li><li>Cardin, J. A., Carlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+local+circuits+in+vivo:+Integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity.">Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).</li><li>Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+optogenetic+silencing+of+orexin/hypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice.">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li></ol>

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Широкий спектр методов доступны для генетически таргетирования микробных генов опсина для дискретных областях мозга у грызунов. Вирусный доставки генов обеспечивает относительно недорогой и быстрый подход к посредничество ChR2 и NpHR выражение с камерного типа специфичности. Векторные системы AAV являются общим выбором для использования в optogenetic экспериментов из-за высоких производственных титров, сохраняющих стабильность при хранении, ее отсутствия патогенности и его способности производить долгосрочное экспрессию генов 10. Многие из опсина конструкций с конкретными промоутеров камерного типа имеются в продаже в различных AAV серотипов из векторных основных объектов, таких как в Университете Пенсильвании ( <a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a> ) или университета Северной Каролины в Чапел-Хилл ( <a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a> ). Одним из недостатков AAV технологии являетсяограниченные возможности упаковки (~ 4,7 кб), который накладывает ограничение на размер кассеты трансгена, который может использоваться для соты таргетинга. В качестве альтернативы, лентивирусов, которые имеют большую емкость упаковки, способны воспринимать опсина ориентированные под контролем крупных промоторных последовательностей. Использование в optrode позволяет для надежного обнаружения электрофизиологических сигналов в сочетании с временно-точной подачи света. Как описано выше, однако, достаточно внимание необходимо в его строительстве. Так как оптическое волокно расщепляется хрупка, связывая шовного нить слишком сильно может привести волокно разорвать. Несмотря на то, optrode может быть использован для многократной перезаписи, электрод и оптическое волокно должны быть очищены (или вручную расщепляется в случае оптического волокна свободным концом) перед введением потому что импеданс электрода и качество поставленного света будет деградировать при повторном использовании. Во элементctrophysiological записи важно, чтобы optrode быть выдвинуты медленно. Optrode используется здесь имеет приблизительно 350 мкм (толщина вольфрамового электрода: 125 мкм; ядро ​​оптического волокна: 200 мкм) и снижение его быстро может привести к движению ткани головного мозга. Светоиндуцированный артефакты также могут быть рассмотрены с особым записи и свет доставки наборах 11-12. Хотя мы не обнаружили светоиндуцированного артефакт в нашей экспериментальной условии, записи вне трансдуцированных области мозга потенциально могут быть использованы в качестве контроля для легких артефактов. Еще одно соображение в процессе записи и есть искомая интенсивность света для наблюдения изменений в ChR2-или NpHR экспрессирующих нейронов, особенно для продолжительности длительной записи. Сильный интенсивность лазерного и долго лазерного освещения может привести к повреждению тканей и / или снижению ответ на последующей поставляемого света 12-13. Для поведенческого эксперимента использование контрольного вирусного вектора требуется для eliminatinг любой эффект за счет тепла, поступающей из волокна. Для многих из коммерчески доступных optogenetic конструкций есть дополнительные управляющие конструкции, в которых последовательность гена опсин было удалено. Следует отметить, что разработаны варианты ChR2 с улучшенными свойствами и кинетики были разработаны вместе с другими глушителей опсинов, которые могут быть лучше подходят для некоторых экспериментальных вопросов 14-15. Например, новый вариант ChR2 осуществляется через направленного мутагенеза, называется &quot;Cheta&quot;, может управлять с высокой точностью воспроизведения нейронов пики на частотах (по крайней мере до 200 Гц) выше, чем у оригинального ChR2 14. Сочетание в естественных условиях доставки света и одновременной записи нейронных ответов является важным шагом в установлении причинно-следственные связи между рисунком деятельности в генетически-целевых популяций клеток и соответствующих временных автоподстройки поведенческих событий. Процедуры и ха-rdware изложил здесь обеспечивают простой подход для реализации Optogenetics для в естественных условиях головы фиксированной записи у грызунов.

Возможность включения или отключения определенного типа клеток в нервной цепи в временно точного моды имеет решающее значение для понимания того, как нейронные цепи обрабатывают различные типы информации, лежащие в основе эмоций и познания. Экспериментальная контроль над неповрежденной нервной деятельности использовала loss-/gain-of-function инструменты (например, электрическую стимуляцию, фармакологической модуляции, поражение), которые не обеспечивают требуемое выборочно для управления конкретных популяций нейронов, либо на временной или пространственном масштабе. Непосредственно решении этих технологических проблем, разработка и применение генетически кодируемый инструментов светочувствительных позволило неврологи контролировать электрическую активность некоторых типов клеток во время четко определенных поведенческих событий. Многие из этих светочувствительных белков микробного происхождения, с легкой закрытого катионного канала, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, и свет приводом насоса хлорид, halorhodopгрех (NpHR) 2,3, в широко распространенном использовании. Основным преимуществом Optogenetics является способность генетически целевых конкретных клеточных популяций в гетерогенных областях мозга и техника успешно применяется в ряде модельных организмов (беспозвоночных в приматов) 4-6. Многие optogenetic трансгенные животные были получены и являются коммерчески доступными 7,8, однако, устанавливающие трансгенных линий может быть трудоемким и стоимость слишком высока. Здесь мы опишем протокол для вирусно-опосредованного поставки ChR2 и NpHR генов под CaMKIIα промоутер в крыс прелимбальной коры и спинного подлежащая ткань с помощью рекомбинантной аденоассоциированный вирус (AAV) вектора. В переднем мозге, выражение CaMKIIα является эксклюзивным для глутаматергических пирамидальных нейронов 9. ААВ обычно используется для проведения фундаментальных исследований в связи с его относительной простоты производства и отсутствия патогенности, а также сильные и ПерсиСтент трансген выражение, которое было достигнуто с этими векторами 10. Кроме того мы наметим шаги и оборудование для одновременной доставки света и записи в анестезированных крыс головы фиксированной.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe </td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Removable Needle</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-03</td>
 <td>31 gauge, beveled tip</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microinjector Pump</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>UMP3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pump Controller</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-MICRO4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone Oil</td>
 <td>Alfa Aesar</td>
 <td>A12728</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laser Protective Eyeware</td>
 <td>Kentek </td>
 <td>KMT-4501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Optical Fiber</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>BFL37-200</td>
 <td>200 &mu;m diameter core, 0.37 NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber Stripping Tool</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>T12S21</td>
 <td>for 200 &mu;m diameter core multimode fiber</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Power Meter</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Photodetector</td>
 <td>Newport</td>
 <td>818-SL/DB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Green Laser (532 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tungsten/Fiber Optrode</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>Lumitrode</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Capillary Tube</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>22-362-566</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydraulic Micromanipulator</td>
 <td>Narishige</td>
 <td>MO-22</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Kation Scientific</td>
 <td>ExAmp-20K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquistion Device</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>NI USB-6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rodent Head Restraint for Recording</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic Unit</td>
 <td>David Kopf Instruments</td>
 <td>Model 963</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a method for high fidelity optogenetic control of individual pyramidal neurons in vivo

Optogenetic методы появились в качестве мощного инструмента для выяснения нервную деятельность замыкания, лежащую в основе разнообразный набор поведения в широком спектре видов. Optogenetic инструменты микробного происхождения состоят из светочувствительных мембранных белков, которые способны активировать (например, channelrhodopsin-2, ChR2) или тишина (например, halorhodopsin, NpHR) нейронной активности ingenetically определенные типы клеток более поведенчески-соответствующих сроков. Мы сначала продемонстрировать простой подход к аденоассоциированного вирус-опосредованной доставки ChR2 и NpHR трансгенов в спинной подлежащая ткань и прелимбальной области префронтальной коры у крыс. Потому ChR2 и NpHR генетически наведения, мы описываем использование этой технологии для управления электрической активности конкретных популяций нейронов (т.е. пирамидальных нейронов), встроенных в гетерогенной ткани с высоким временным точностью. Мы описываем здесь аппаратную, заказного программного обеспеченияпользовательский интерфейс, и процедуры, которые позволяют одновременной доставки света и электрической записи с трансдуцированные пирамидальных нейронов в наркозом в подготовке естественных условиях. Эти легкие проблематику инструменты предоставляют возможность для выявления причинно-следственные вклады различных типов клеток в обработке информации и поведения.

На рисунке 1 представлена ​​скриншот специализированное программное обеспечение (NeuroLux Pro), разработанные в LabVIEW среды (National Instruments), используемого для одновременной регистрации активности нейронов и контроля параметров светового импульса (т.е. частота импульсов, длительность импульса, период стимуляции). Компьютерная программа посылает командный сигнал в цифровой устройства захвата, который генерирует импульсы TTL для контроля над лазера одного диода. Дополнительно программа отображает программного обеспечения и хранятся записанные нейронной активности и доставлены TTL сигналы. Эти сигналы в цифровую форму с помощью устройства захвата при определенной частоте дискретизации (например, 20 кГц). Записанные сигналы сохраняются в виде двумерного массива с двойной точностью в двоичный файл. Рисунок 2 показывает пользовательский optrode, состоящий из вольфрамового электрода, присоединенного к оптическому волокну. Оптическое волокно прикреплено к электроду с помощью тонкого шовного нить в трипунктов. Если необходимо, супер клей может быть использован придерживаться их. Однако, во избежание постоянно фиксации оптического волокна к электроду потому что, хотя электрод может быть повторно несколько раз, светопропускание через волокно будет деградировать с многократного использования и должен быть расщеплен и очистить или заменить с каждой вставки в головном мозге. Левые панели рис. 3 шоу флуоресцентных изображений повышенной желтого флуоресцентного белка, что указывает на фактическое ChR2 и выражение NpHR. Эти фотографии показывают представительство выражение NpHR в крыс спинной подлежащая ткань (рис. 3А) и ChR2 выражение в прелимбальной коры (рис. 3б). Вирусный выражение было ограничено в основном к спинной подлежащая ткань и прелимбальной коры (например, некоторые флуоресценции наблюдалась в зубчатой ​​извилине (рис. 3А, слева)). Наблюдались также Следы электрода (тонкий трека, стрелка головы) и оптического волокна (толщиной трек, стрелка). Рисунок 4 показывает, что ChR2 индуцированной временно точное пики в крыс прелимбальной коры. 4А является примером след ChR2-вызванных потенциалов действия в ответ на 20 Гц поставку 10 мс синий световых импульсов крысы прелимбальной кора. Растр участок (рис. 4В) показывает ChR2-индуцированный активации в шести представительных нейронов. Все записанные нейроны показали света-вызвали пики с совершенным верности. В отличие от ChR2, NpHR быстро и обратимо замолчать спонтанную активность в естественных условиях в крыс прелимбальной коры (правая панель из рис. 4). Рисунок 4C является примером след, показывающий, что непрерывное 532 нм освещение (10 видов) прелимбальной коры, выражающей NpHR под CaMKllα промоутер исключает самопроизвольное одной единицы активности в естественных условиях. Обратите внимание, что в комплекте молчание прелимбальной деятельности пирамидальной клетки время автоподстройки на 10 сек непрерывного света поставки. Низкийэ растровых участок (рис. 4D) показывает NpHR-индуцированный молчание в шести представительных нейронов. Оба естественных условиях записи в типичны для продукта, полученного от взрослых Спрэг Dawley крыс, у которых ААВ-опосредованной поставки микробных генов опсина произошло 18-21 дней до. 5 показан результат повторного ChR2 стимуляции крыса прелимбальной пирамидальных нейронов. Синий световой импульс (10 мсек) был доставлен в 20 Гц в течение 5 сек (всего 100 импульсов). Следы напряжения светового вызываемой пики неоднократно приобрела каждые 2 мин в течение сессии записи 2 часа (всего 61 повторений). Даже при использовании этого протокола повторяющиеся стимуляции, ChR2 индуцированный стабильную и надежную пики в ответ на световой доставки. 6 и 7 показаны результаты NpHR-индуцированной фотоингибирования и ChR2-приводом фотоактивации крысы subicular нейронной активности. Как и в случае в прелимбальной коры, NpHR и ChR2 смоглипосредником времени заблокирован ингибирование светоиндуцированного и активацию опсина-трансдуцировали subicular нейронов с высокой повторяемостью. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" /> Рисунок 1. Скриншот из Pro программного интерфейса NeuroLux для одновременной доставки света и электрофизиологические записи. На фото след показывает NpHR индуцированное молчание спонтанной активности крыс прелимбальной пирамидальной клетке в ответ на 10 сек непрерывного 532 нм света поставки. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" /> Рисунок 2. Высокая мощность образ пользовательского optrode. Оптическое волокно вставляется в стеклянной капиллярной трубки, прикрепленной к вольфрамовым электродом и прикрепленного к электроду с использованием шовного нить. Расстояние от центра до центра межосевомееп конец электрода и наконечника волокна составляет примерно 500 мкм. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" /> Рисунок 3. Вирусный выражение и размещение optrode. (слева) На фотографиях изображены представительство выражение NpHR в спинной подлежащая ткань (А) и ChR2 выражение в прелимбальной коры (B). (Правой) Схема, которая представляет место, где была сделана каждая фотография. Наконечник и стрелка на каждой фотографии указать местоположение вольфрамового электрода и оптическое волокно, соответственно. SUB: подлежащая ткань, Д. Г.: зубчатой ​​извилине, PL:. Прелимбальной кора <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" /> Рисунок 4. В естественных условиях электрофизиологические записи с ChR2 или NpHR-трансдуцированной крысы prelimbМикросхема коры. (А) Пример след ChR2-вызванных потенциалов действия в ответ на 20 Гц поставку голубого (473 нм) световых импульсов (10 мс, синий бар). (В) растровых график, показывающий ChR2-индуцированный пики в шести представительных нейронов. Каждый блок активность нанесены в виде точки. (С) Пример след NpHR-индуцированного подавления спонтанной активности при непрерывной зеленый (532 нм) света освещения (10 сек, зеленый бар). (D) растровых график, показывающий NpHR-индуцированный молчание в шести представительных нейронов. Каждый блок деятельность строится по точкам. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" /> Рисунок 5. Повторяющиеся 20 Гц ChR2 приводом пики крысы прелимбальной пирамидальных нейронов в естественных условиях. (А) Напряжение следы светло-вызвало пикиприобрела в моменты времени 0, 30, 60, 90, 120 мин после начала записи. (В) растровых график, показывающий все 61 повторений (2 мин между пробная интервал, 120 мин всего) из светоиндуцированного активации. Каждый блок деятельность строится по точкам. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . <img alt="Рисунок 6" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" /> Рисунок 6. IN VIVO электрофизиологические записи с NpHR-трансдуцированной крысы спинной подлежащая ткань. (А) Пример след, показывающий, что 10 сек непрерывное 532 нм освещение (зеленая полоса) спинного подлежащая ткань, выражающей NpHR исключает спонтанную активность. (B) Средние сигналов двух записанных единиц из выше следа. Порог амплитуда была использована для определения двух отдельных нейронов. (С) растровых график, показывающий пять повторенияс из NpHR-индуцированного глушителей этих единиц. Каждый блок активность нанесены в виде точки. <img alt="Рисунок 7" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" /> Рисунок 7. Повторяющиеся 20 Гц CR2-приводом пики из крысиной спинной subicular нейрона в естественных условиях. (А) Напряжение следы светло-вызвало пики приобретенные на временных точках 0, 30, 60, 90, 120 мин после начала записи. Врезка: типичный лопнул деятельность этой ячейки. (В) растровых график, показывающий все 61 повторений (2 мин между пробная интервал, 120 мин всего) из светоиндуцированного активации. Каждый блок деятельность строится по точкам. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> .

Watch this Scientific Journal Video about A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo at JoVE.com

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Недавнее развитие нейронауки, которые объединяли бы генетику и оптики, называется &quot;Optogenetics&quot;, позволяет контролировать нейронной активности замыкания с беспрецедентным уровнем пространственным и временным разрешением. Здесь мы предлагаем протокол для интеграции в записи естественных условиях с optogenetic манипуляции генетически определенных подмножеств префронтальной коры и subicular пирамидальных нейронов.

Метод высокой верности Optogenetic управление отдельными пирамидальных нейронов<em&gt; В естественных условиях</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Механические Манипуляция Нейроны для управления аксонального развития

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

В естественных условиях Электропорация развивающихся Мышь Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Селективный Вирусный трансдукция взрослых происхождения обонятельных нейронов при хроническом В естественных условиях Optogenetic Стимуляция

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Ретроградная Флуоресцентная маркировка Позволяет Целевые Внеклеточные единичные Запись с Выявленные Нейроны<em&gt; В естественных условиях</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

В естественных условиях Optogenetic возбуждение нервной системы грызунов Центральной

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo оптогенетика Вскрытие страха схем в головном мозге Ломтики

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Упрощенный метод для сверхнизкой плотности, Долгосрочное Первичный гиппокампа Нейрон культуры

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Оптический контроль нейронального белка с использованием генетически кодируемой искусственную аминокислоту в нейронах

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric кальция изображений отдельных нейронов в себя Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...