Name: tractable mammalian cell infections with protozoan-primed bacteria
Uploaded: 2013-04-02T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria at JoVE.com

Wij danken dr. Craig Roy en Dr Dario Zamboni voor het verstrekken van een sjabloon voor protozoaire cel infecties. Wij danken dr. Jagdeep Obhrai, Dr Georgiana Purdy, Dr Fred Heffron en Todd Wisner voor apparatuur en reagentia; Dr Lulu Cambronne voor kritische beoordeling van het manuscript. Flow cytometrie werd uitgevoerd bij de OHSU Flowcytometrie Shared Resource faciliteit. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een subsidie ​​van de Medical Research Foundation van Oregon en een NIH subsidie ​​R21 AI088275 (EDC).

1. Voorbereiding van Legionella pneumophila Cultures for Priming Stage Infecties <ol><li> Transformeer alle L. pneumophila stammen die in de bepaling met het plasmide pAM239, codeert voor een isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induceerbare green fluorescent protein (GFP) 28. Streak de bacteriestammen op ijzer en cysteine ​​aangevuld N-(2-acetamido)-2-aminoethaansulfonzuur (ACES) gebufferde kool gistextractagar (CYEA) met 6,25 pg / ml chlooramfenicol (CM) (vo...

<ol>
	<li>Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+bacterial+virulence+genes+that+are+specifically+induced+in+host+tissues.">Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues.</a> Science. 259, 686-688 (1993).</li><li>Mahan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-based+selection+for+bacterial+genes+that+are+specifically+induced+during+infection+of+a+host.">Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).</li><li>Rankin, S., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Legionella+pneumophila+promoters+regulated+by+the+macrophage+intracellular+environment.">Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment.</a> Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).</li><li>Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-induced+genes+of+Legionella+pneumophila:+protection+from+reactive+intermediates+and+solute+imbalance+during+intracellular+growth.">Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth.</a> Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).</li><li>Fields, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+ecology+of+legionellae.">The molecular ecology of legionellae.</a> Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).</li><li>Cirillo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+growth+in+Acanthamoeba+castellanii+affects+monocyte+entry+mechanisms+and+enhances+virulence+of+Legionella+pneumophila.">Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila.</a> Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).</li><li>Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Legionella+pneumophila+in+Acanthamoeba+castellanii+enhances+invasion.">Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion.</a> Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).</li><li>Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+Transcriptome+during+Intracellular+Multiplication+in+Human+Macrophages.">Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages.</a> Front Microbiol. 2, 60 (2011).</li><li>Kilvington, S., Price, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Legionella+pneumophila+within+cysts+of+Acanthamoeba+polyphaga+following+chlorine+exposure.">Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure.</a> J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).</li><li>King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+coliforms+and+bacterial+pathogens+within+protozoa+during+chlorination.">Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).</li><li>Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+novel+phagosome+by+the+Legionnaires'+disease+bacterium+(Legionella+pneumophila)+in+human+monocytes.">Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes.</a> J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).</li><li>Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+the+Legionnaires'+disease+bacterium+(Legionella+pneumophila)+occurs+by+a+novel+mechanism:+engulfment+within+a+pseudopod+coil.">Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil.</a> Cell. 36, 27-33 (1984).</li><li>Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionnaires'+disease+bacterium+(Legionella+pneumophila)+multiples+intracellularly+in+human+monocytes.">Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes.</a> J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).</li><li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach.">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot/Icm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila.">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS One. 6, e17638 .</li><li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria.">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Front Microbiol. 2, 136 (2011).</li><li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors.">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li><li>Shin, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+processes+that+influence+the+intracellular+survival+of+Legionella+pneumophila.">Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila.</a> Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).</li><li>Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+defects+in+intracellular+growth+complemented+by+a+single+genetic+locus+in+Legionella+pneumophila.">Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila.</a> Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).</li><li>Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Legionella+pneumophila+locus+required+for+intracellular+multiplication+in+human+macrophages.">Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).</li><li>Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+killing+and+bacterial+conjugation+require+overlapping+sets+of+genes+within+a+22-kb+region+of+the+Legionella+pneumophila+genome.">Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).</li><li>Segal, G., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+new+region+required+for+macrophage+killing+by+Legionella+pneumophila.">Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila.</a> Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li><li>Haghjoo, E., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+transcriptional+regulator+that+controls+intracellular+gene+expression+in+Salmonella+Typhi.">Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi.</a> Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).</li><li>Molofsky, A. B., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiate+to+thrive:+lessons+from+the+Legionella+pneumophila+life+cycle.">Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle.</a> Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).</li><li>Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+regulator+induces+the+transmission+phenotype+of+stationary-phase+Legionella+pneumophila.">A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila.</a> Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).</li><li>Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Legionella+IcmS-IcmW+protein+complex+is+important+for+Dot/Icm-mediated+protein+translocation.">The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation.</a> Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).</li><li>Neild, A. L., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+reveal+dendritic+cell+functions+that+facilitate+selection+of+antigens+for+MHC+class+II+presentation.">Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation.</a> Immunity. 18, 813-823 (2003).</li><li>Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebae+as+training+grounds+for+intracellular+bacterial+pathogens.">Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).</li><li>Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebae+promote+persistence+of+epidemic+strains+of+MRSA.">Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA.</a> Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).</li></ol>

Bacteriële genexpressie wordt streng gecontroleerd door een combinatie van levenscyclus en de reactie op signalen in de omgeving micromilieu. Vacuolaire ziekteverwekkers zoals L. pneumophila reageren op een groot aantal gastheercel afgeleide signalen bij compartimenten in een fagosoom. Als collectief gevolg van uitputting nutriënten in de gastheercel, de bacterie compenseert expressie factoren vereist voor succesvolle verspreiding naar een volgende gastheercel 25. L. pneumophila aangepast ...

Tal van bacteriële pathogenen hebben zich aangepast algemene strategieën om gastheercellen voor overleving en replicatie in een intracellulair compartiment te exploiteren. In veel gevallen pathogene mechanismen vergelijkbaar protozoaire en metazoïsche cellen. Deze twee micromilieus zeer verschillend en kunnen resulteren in differentiële expressie van virulentiefactoren 1-4. De veteranenziekte bacterie Legionella pneumophila is alomtegenwoordig geassocieerd met zoetwater omgevingen over de hele wereld 5. Belangrijker L. pneumophila gekweekt in protozoa cellen voor infectie van humane monocyten krijgen een pathogene voordeel suggereert dat globale genexpressie profielen van de bacterie verlaat een protozoa cel zijn anders dan die van de in vitro gekweekte organisme 6-8. In de natuur, zoetwater amoeben geven voedselrijk grenzen voor snelle amplificatie van een binnenvallende bacterie. Human overname van L. pneumophila wordt meestal toegeschreven aan inademing van besmet water druppels die de bacterie bevatten. Het is waarschijnlijk dat deze druppeltjes haven protozoa cel-geassocieerde bacteriën, protozoa, waar cellen meer resistent zijn voor conventionele waterbehandeling praktijken 9,10. Infectie van long alveolaire macrofagen verloopt op een wijze die nagenoeg identiek aan de intracellulaire levenscyclus van de bacterie in protozoa gastheercellen 11-13. Om te overleven en repliceren in eukaryotische cellen, L. pneumophila gebruikt een speciaal type IVb secretiesysteem genoemd Dot / Icm tot bijna 300 &#39;effector&#39; eiwitten te leveren in het cytosol van de gastheercel 14-16. Deze effector eiwitten collectief functioneren om cellulaire processen ondermijnen om een replicatie permissieve compartiment voor de bacterie 17,18 genereren. Deleties in elk van de 26 genen die de Dot / Icm transporter resultaat stammen gebrekkig intracellulaire mult omvatteniplication 19-23. Historisch deletie van afzonderlijke effector coderende genen zelden geleid stammen verzwakt voor intracellulaire groei. Dit fenomeen wordt toegeschreven aan verschillende hypothesen waaronder redundante functie en paraloge kopieën van effectoren. Sommige virulentiefactoren alleen uitgedrukt in de context van gastheercel-geassocieerde intracellulaire groei 24. We gerationaliseerd dat indien een bepaalde effector werd enkel in de context van protozoaire infectie dan de bijdrage van de effector kan worden vergeleken met een wild-type stam wanneer beide werden gekweekt in vitro. L. pneumophila overgangen van een replicatieve een doorlatende fase komt deze stationaire fase in cultuur 25. De fase-draaing fenotype vertegenwoordigt de tekort aan nutriënten die tijdens intracellulaire groei en wordt geïllustreerd door middel van montage van flagella voor motiliteit 26. Omdat L. pneumophila is meer invasiesieve en virulente wanneer geoogst van protozoaire cellen, zochten we naar een test waarmee meer getrouw de pathogene toestand van de bacterie vertegenwoordigde toen het geconfronteerd gastheer macrofagen ontwikkelen. Hiervoor hebben we een veelzijdige protozoa priming assay dat geschikte gastheer voor zowel de eerste (priming cel) en tweede (doelcel) fase infecties geschikt. De infectie proces tractable door gebruik van bacteriën die stabiel green fluorescent protein (GFP). De infectie model voor de protozoaire Acanthamoebacastellanii volgt een methode op grote schaal gebruikt op het gebied 27. De aanzuiging stap L. pneumophila stammen worden gekweekt in vitro naar stationaire fase in vloeibare media als &#39;doorlatende&#39; bacteriën (Figuur 1A) produceren. Bacteriën worden vervolgens gebruikt om monolagen van A. infecteren castellanii gedurende 18 uur op een laat stadium van de intracellulaire levenscyclus te bereiken. Grote vacuolen bevattenbacteriën te kunnen gevisualiseerd op dit tijdstip met fluorescentiemicroscopie (Figuur 1A). Protozoa cellen worden daarna gelyseerd en bacteriën gewonnen uit het lysaat worden gemeten emissie bij 512 nm met een fluorescentie-plaatlezer. Fluorescentie wordt gecorreleerd met optische dichtheid veelvoud-van-infectie (MOI) te berekenen voor de infectie van doelcellen (figuur 1 * Correlatie Curve). Na invasie (T 0) en 18 uur post-invasie (T 18), zijn doelcellen gekwantificeerd voor fluorescentie, wat neerkomt op intracellulaire bacteriën. Fluorescentie kan worden gevolgd door microscopie en flowcytometrie, en levensvatbare tellingen kan worden gemeten door kolonie plating. De priming test wordt altijd begeleid door infecties met wild-type L. pneumophila en een stam defect in de Dot / Icm type IV secretiesysteem (Δ DOTA) (Figuur 1A). Dit biedt vooral interne controles voor directe vergelijkingen tussen wild-type eennd elke mutant isogene stammen die in het infectieproces. De opname van de avirulente stam Δ DOTA tijdens het vullen decors een drempelwaarde voor waarneming van verzwakte groei fenotypen geassocieerd met isogene mutanten die worden gekweekt in vitro.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>chloramphenicol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP904-100</td>
 <td>antibiotic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1755-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ACES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9758-1KG</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATCC medium: 712 PYG</td>
 <td>ATCC</td>
 <td></td>
 <td>growth media for protozoans</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X PBS</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>SH30256FS</td>
 <td>phosphate buffered saline</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>activated charcoal</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>C272-212</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>yeast extract</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1422-500</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>peptone</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>211677</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>agar</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1423-2</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-cysteine, 99%+</td>
 <td>Acros organics</td>
 <td>173601000</td>
 <td>media supplement</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ferric nitrate nonahydrate</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>I110-100</td>
 <td>media supplement</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EVOS fl</td>
 <td>AMG</td>
 <td>EVOS fl</td>
 <td>fluorescence microscope</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Smart Spec Plus</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-2525</td>
 <td>spectrophotometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5810 R centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22627023</td>
 <td>bench top centrifuge</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repeater plus</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22230201</td>
 <td>repeating pipette</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SpectraMax Gemini EM</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td></td>
 <td>microplate reader</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Softmax Pro 5.3</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>0200-310</td>
 <td>microplate reader software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5424 microfuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22620401</td>
 <td>table top microcentrifuge</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fast-release pipette pump II</td>
 <td>Scienceware</td>
 <td>379111010</td>
 <td>pipette aid</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FACS Calibur</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td></td>
 <td>flow cytometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FlowJo 7.6.1</td>
 <td>FlowJo</td>
 <td>license</td>
 <td>flow cytometery software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352096</td>
 <td>polypropylene conical tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.6 ml microfuge tube</td>
 <td>Neptune</td>
 <td>3745.X</td>
 <td>microcentrifuge tubes</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

tractable mammalian cell infections with protozoan-primed bacteria

Vele intracellulaire bacteriële pathogenen gebruiken zoetwater protozoa als natuurlijke reservoir tot proliferatie in het milieu. Legionella pneumophila, de veroorzaker van de veteranenziekte longontsteking, krijgt een pathogeen ten opzichte van in vitro gekweekte bacteriën bij eerste geoogst protozoa cellen voor infectie van zoogdierlijke macrofagen. Dit suggereert dat belangrijke virulentiefactoren niet goed worden uitgedrukt in vitro. We hebben een handelbaar systeem voor priming L. pneumophila door haar natuurlijke protozoaire gastheer Acanthamoebacastellanii voorafgaand aan zoogdiercellen infectie. De bijdrage van elke virulentiefactor kan worden onderzocht door het vergelijken van intracellulaire groei van een mutant stam met wildtype bacteriën na priming protozoa. GFP-expressie wild-type en mutant L. pneumophila stammen worden gebruikt om protozoa monolagen infecteren in een priming stap en men late stadia van intracellulaire groei bereiken. Fluorescerende bacteriën worden geoogst van deze geïnfecteerde cellen en genormaliseerd door spectrofotometrie vergelijkbare aantallen bacteriën voor een volgende infectie in zoogdierlijke macrofagen genereren. Voor de kwantificering worden levende bacteriën gecontroleerd na infectie met fluorescentie microscopie, flowcytometrie en door kolonie plating. Deze techniek belicht en vertrouwt op de bijdrage van gastheercel-afhankelijke genexpressie door het nabootsen van de omgeving die zou worden aangetroffen in een natuurlijke acquisitie route. Deze benadering kan worden gewijzigd om een ​​bacterie die een intermediaire gastheer gebruikt als een middel voor het verkrijgen van een pathogene voordeel bieden.

Een typisch resultaat voor het gehele infectie wordt beschreven in figuur 1. Live cell fluorescentie microfoto beeltenis van monolagen van A.castellanii geïnfecteerd met wild-type L. pneumophila tijdens het vullen fase is weergegeven in figuur 1A. Een succesvolle maatregel van de priming stap leidt tot een populatie van ongeveer 90% van de gastheercellen die grote vacuolen gevuld met GFP gemerkte bacteriën bij deze MOI. Op 18 uur na infectie meeste A. castellanii...

Watch this Scientific Journal Video about Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria at JoVE.com

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Deze techniek verschaft een werkwijze te oogsten, normaliseren en kwantificeren intracellulaire groei van bacteriële pathogenen die vooraf gekweekt in natuurlijke protozoa gastheercellen voor infecties van zoogdiercellen. Deze methode kan worden aangepast aan een grote verscheidenheid van gastheercellen voor de priming podium en doelcel types tegemoet.

Handelbaar Mammalian Cell Infecties met Protozoan-geprimed Bacteriën

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D multimodale beeldvorming van<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecties in Muizen

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescentiemicroscopiemethodes voor het bepalen van de levensvatbaarheid van bacteriën in Associatie met zoogdiercellen

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis als modelorganisme voor het beoordelen van Interactie van anaërobe bacteriën met gastheercellen

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van het menselijk bloed-hersenbarrière

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

De WinCF Model - Een goedkope en handelbaar microkosmos van een Slijm Plugged bronchiolus de Microbiologie van longinfecties Studie

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Confocale beeldvorming van Double-Stranded RNA en patroon erkenning receptoren in negatief-Sense RNA-virusinfectie

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...