Name: tractable mammalian cell infections with protozoan-primed bacteria
Uploaded: 2013-04-02T12:00:00
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Ringraziamo il Dott. Craig Roy e il Dr. Dario Zamboni per fornire un modello per le infezioni delle cellule protozoi. Ringraziamo il Dott. Jagdeep Obhrai, Dr. Georgiana Purdy, il Dr. Fred Heffron e Todd Wisner per le attrezzature e reagenti, il dottor Lulu Cambronne per la revisione critica del manoscritto. La citometria a flusso è stata eseguita presso l&#39;impianto di flusso di risorse OHSU Citometria condivisa. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione della Fondazione per la Ricerca Medica dell&#39;Oregon e una sovvenzione del NIH R21 AI088275 (EDC).

1. Preparazione di Legionella pneumophila Culture per le infezioni della fase di priming <ol><li> Trasforma tutti L. ceppi pneumophila usare nel saggio con le plasmide pAM239, codificante un isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) inducibile proteina fluorescente verde (GFP) 28. Streak i ceppi batterici sul ferro e cisteina integrato N-(2-acetammido)-2-acido aminoethanesulfonic (ACES) tamponata agar carbone estratto di lievito (CYEA) contenente 6,25 mg / ml d...

<ol>
	<li>Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+bacterial+virulence+genes+that+are+specifically+induced+in+host+tissues.">Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues.</a> Science. 259, 686-688 (1993).</li><li>Mahan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-based+selection+for+bacterial+genes+that+are+specifically+induced+during+infection+of+a+host.">Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).</li><li>Rankin, S., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Legionella+pneumophila+promoters+regulated+by+the+macrophage+intracellular+environment.">Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment.</a> Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).</li><li>Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-induced+genes+of+Legionella+pneumophila:+protection+from+reactive+intermediates+and+solute+imbalance+during+intracellular+growth.">Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth.</a> Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).</li><li>Fields, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+ecology+of+legionellae.">The molecular ecology of legionellae.</a> Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).</li><li>Cirillo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+growth+in+Acanthamoeba+castellanii+affects+monocyte+entry+mechanisms+and+enhances+virulence+of+Legionella+pneumophila.">Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila.</a> Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).</li><li>Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Legionella+pneumophila+in+Acanthamoeba+castellanii+enhances+invasion.">Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion.</a> Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).</li><li>Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+Transcriptome+during+Intracellular+Multiplication+in+Human+Macrophages.">Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages.</a> Front Microbiol. 2, 60 (2011).</li><li>Kilvington, S., Price, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Legionella+pneumophila+within+cysts+of+Acanthamoeba+polyphaga+following+chlorine+exposure.">Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure.</a> J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).</li><li>King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+coliforms+and+bacterial+pathogens+within+protozoa+during+chlorination.">Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).</li><li>Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+novel+phagosome+by+the+Legionnaires'+disease+bacterium+(Legionella+pneumophila)+in+human+monocytes.">Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes.</a> J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).</li><li>Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+the+Legionnaires'+disease+bacterium+(Legionella+pneumophila)+occurs+by+a+novel+mechanism:+engulfment+within+a+pseudopod+coil.">Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil.</a> Cell. 36, 27-33 (1984).</li><li>Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionnaires'+disease+bacterium+(Legionella+pneumophila)+multiples+intracellularly+in+human+monocytes.">Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes.</a> J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).</li><li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach.">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot/Icm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila.">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS One. 6, e17638 .</li><li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria.">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Front Microbiol. 2, 136 (2011).</li><li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors.">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li><li>Shin, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+processes+that+influence+the+intracellular+survival+of+Legionella+pneumophila.">Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila.</a> Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).</li><li>Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+defects+in+intracellular+growth+complemented+by+a+single+genetic+locus+in+Legionella+pneumophila.">Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila.</a> Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).</li><li>Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Legionella+pneumophila+locus+required+for+intracellular+multiplication+in+human+macrophages.">Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).</li><li>Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+killing+and+bacterial+conjugation+require+overlapping+sets+of+genes+within+a+22-kb+region+of+the+Legionella+pneumophila+genome.">Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).</li><li>Segal, G., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+new+region+required+for+macrophage+killing+by+Legionella+pneumophila.">Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila.</a> Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li><li>Haghjoo, E., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+transcriptional+regulator+that+controls+intracellular+gene+expression+in+Salmonella+Typhi.">Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi.</a> Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).</li><li>Molofsky, A. B., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiate+to+thrive:+lessons+from+the+Legionella+pneumophila+life+cycle.">Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle.</a> Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).</li><li>Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+regulator+induces+the+transmission+phenotype+of+stationary-phase+Legionella+pneumophila.">A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila.</a> Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).</li><li>Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Legionella+IcmS-IcmW+protein+complex+is+important+for+Dot/Icm-mediated+protein+translocation.">The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation.</a> Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).</li><li>Neild, A. L., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+reveal+dendritic+cell+functions+that+facilitate+selection+of+antigens+for+MHC+class+II+presentation.">Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation.</a> Immunity. 18, 813-823 (2003).</li><li>Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebae+as+training+grounds+for+intracellular+bacterial+pathogens.">Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).</li><li>Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebae+promote+persistence+of+epidemic+strains+of+MRSA.">Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA.</a> Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).</li></ol>

Espressione genica batterico è strettamente controllata mediante una combinazione di progressione del ciclo di vita e di risposta ai segnali nel microambiente circostante. Vacuolare patogeni come L. pneumophila rispondere a una moltitudine di cellula ospite derivati ​​spunti quando compartimenti stagni in un phagosome. Come risultato collettivo di esaurimento nutrienti nella cellula ospite, il batterio compensa esprimendo fattori richiesti per diffusione successo ad una cellula ospite successivo 25.</...

Numerosi batteri patogeni si sono adattati strategie generalizzate per sfruttare cellule ospiti per la sopravvivenza e la replicazione in un compartimento intracellulare. In molti casi, i meccanismi patogenetici sono simili tra protozoi e metazoi le cellule. Tuttavia, questi due microambienti sono molto diversi e possono provocare un&#39;espressione differenziale di fattori di virulenza 1-4. Il batterio della malattia del legionario &#39;Legionella pneumophila è ubiquitariamente associati agli ambienti d&#39;acqua dolce in tutto il mondo 5. È importante sottolineare che, L. pneumophila coltivato in cellule protozoarie prima infezione dei monociti umani acquisire un vantaggio patogeno, suggerendo che globali profili di espressione genica del batterio uscita una cella protozoo sono diverse da quella del coltivati ​​in vitro dell&#39;organismo 6-8. In natura, amebe acqua dolce forniscono nutrienti confini ricchi per l&#39;amplificazione rapida di un batterio invasore. Acquisizione umana della L. pneumophila è spesso attribuita a inalazione di goccioline di acqua contaminata che contengono il batterio. È probabile che queste goccioline porto protozoi cellula batteri associati; dove cellule protozoarie sono più resistenti alle pratiche convenzionali di trattamento delle acque 9,10. Infezione di macrofagi alveolari polmonari procede in modo quasi identico al ciclo di vita del batterio intracellulare in cellule ospiti protozoi 11-13. Per sopravvivere e replicarsi in cellule eucariotiche, L. pneumophila utilizza uno speciale sistema di secrezione di tipo IV ter chiamato Dot / Icm per fornire circa 300 &quot;effettrici&quot; proteine ​​nel citosol della cellula ospite 14-16. Queste proteine ​​effettrici collettivamente funzionamento per sovvertire processi cellulari per generare un vano permissive per la replicazione del batterio 17,18. Delezioni in qualsiasi dei 26 geni che costituiscono il Dot / Icm risultato trasportatore in ceppi difettosi per mult intracellulareiplication 19-23. Storicamente, cancellazione di singoli geni codificanti effettori raramente portato in ceppi attenuati di crescita intracellulare. Questo fenomeno è stato attribuito a diverse ipotesi tra cui la funzione ridondante e copie paralogous di effettori. Alcuni fattori di virulenza sono espressi solo nel contesto della cellula ospite associata crescita intracellulare 24. Abbiamo razionalizzato che se un effettore particolare è stato espresso soltanto nel contesto di infezione protozoo, quindi il contributo del effector non può essere confrontato con un ceppo selvatico quando entrambi sono stati coltivati ​​in vitro. L. pneumophila transizioni da un replicativa a una fase trasmissivo, che entra nella fase stazionaria cultura 25. Il fenotipo di commutazione fase rappresenta l&#39;esaurimento degli elementi nutritivi incontrato durante la crescita intracellulare ed è esemplificata attraverso il montaggio di flagelli per la motilità 26. Perché L. pneumophila è più invaSIVE e virulenta quando raccolto da cellule protozoi, abbiamo cercato di sviluppare un metodo che più fedelmente rappresentato lo stato patogeno del batterio quando ha incontrato macrofagi host. A tal fine, abbiamo sviluppato un saggio di adescamento protozoo versatile in grado di ospitare qualsiasi host adatto sia per i primi (cella priming) e la seconda (cella di destinazione) infezioni stadio. Il processo di infezione è trattabile mediante uso di batteri che esprimono stabilmente la proteina fluorescente verde (GFP). Il modello di infezione per il protozoo Acanthamoeba castellanii segue una metodologia ampiamente usato nel campo 27. Per la fase di caricamento, L. ceppi pneumophila sono coltivati ​​in vitro alla fase stazionaria in mezzi liquidi per produrre etichettati &#39;trasmissive&#39; batteri (Figura 1A). I batteri vengono quindi utilizzati per infettare monostrati di A. castellanii per 18 ore per ottenere una fase avanzata del ciclo di vita intracellulare. Vacuoli di grandi dimensioni contengonobatteri zione può essere visualizzata a questo punto di tempo utilizzando microscopia a fluorescenza (Figura 1A). Protozoi cellule vengono lisate e batteri recuperati dal lisato sono misurati per l&#39;emissione a 512 nm usando un lettore di fluorescenza piastra. Fluorescenza è correlata con la densità ottica per calcolare molteplicità d&#39;infezione (MOI) per l&#39;infezione di cellule bersaglio (Figura 1, Correlazione * Curve). Dopo ore invasione (T 0) e 18 post-invasione (T 18), le cellule bersaglio sono quantificati per la fluorescenza, che rappresenta i batteri intracellulari. Fluorescenza può essere monitorato mediante microscopia e citometria a flusso, e la conta può essere misurata mediante placcatura colonia. Il test di adescamento è sempre accompagnato da infezioni da wild-type L. pneumophila e un ceppo difettosa in Dot / Icm sistema secrezione di tipo IV (Δ DOTA) (Figura 1A). Ciò fornisce soprattutto controlli interni per i confronti diretti tra wild-type di unnd eventuali ceppi mutanti isogenici utilizzati nel processo di infezione. L&#39;inclusione del ceppo virulento Δ DOTA durante la fase di adescamento imposta una soglia per l&#39;osservazione della crescita attenuati fenotipi associati isogeniche ceppi mutanti che sono coltivate in vitro.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>chloramphenicol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP904-100</td>
 <td>antibiotic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1755-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ACES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9758-1KG</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATCC medium: 712 PYG</td>
 <td>ATCC</td>
 <td></td>
 <td>growth media for protozoans</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X PBS</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>SH30256FS</td>
 <td>phosphate buffered saline</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>activated charcoal</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>C272-212</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>yeast extract</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1422-500</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>peptone</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>211677</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>agar</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1423-2</td>
 <td>media component</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-cysteine, 99%+</td>
 <td>Acros organics</td>
 <td>173601000</td>
 <td>media supplement</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ferric nitrate nonahydrate</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>I110-100</td>
 <td>media supplement</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EVOS fl</td>
 <td>AMG</td>
 <td>EVOS fl</td>
 <td>fluorescence microscope</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Smart Spec Plus</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-2525</td>
 <td>spectrophotometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5810 R centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22627023</td>
 <td>bench top centrifuge</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repeater plus</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22230201</td>
 <td>repeating pipette</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SpectraMax Gemini EM</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td></td>
 <td>microplate reader</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Softmax Pro 5.3</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>0200-310</td>
 <td>microplate reader software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5424 microfuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>22620401</td>
 <td>table top microcentrifuge</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fast-release pipette pump II</td>
 <td>Scienceware</td>
 <td>379111010</td>
 <td>pipette aid</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FACS Calibur</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td></td>
 <td>flow cytometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FlowJo 7.6.1</td>
 <td>FlowJo</td>
 <td>license</td>
 <td>flow cytometery software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352096</td>
 <td>polypropylene conical tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.6 ml microfuge tube</td>
 <td>Neptune</td>
 <td>3745.X</td>
 <td>microcentrifuge tubes</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

tractable mammalian cell infections with protozoan-primed bacteria

Molti batteri patogeni intracellulari utilizzare protozoi d&#39;acqua dolce come un serbatoio naturale per la proliferazione nell&#39;ambiente. Legionella pneumophila, l&#39;agente eziologico della legionario &#39;polmonite, guadagna un vantaggio su di batteri patogeni in vitro in coltura al momento della prima raccolti da cellule protozoi prima infezione di macrofagi mammiferi. Questo suggerisce che i fattori di virulenza importanti non possono essere adeguatamente espresse in vitro. Abbiamo sviluppato un sistema per l&#39;adescamento trattabile L. pneumophila attraverso il suo naturale ospite protozoo Acanthamoeba castellanii prima dell&#39;infezione cellula di mammifero. Il contributo di ogni fattore di virulenza può essere esaminata confrontando la crescita intracellulare di un ceppo mutante di wild-type batteri dopo aver riempito protozoo. GFP che esprimono L. wild-type e mutante ceppi pneumophila sono utilizzati per infettare monostrati protozoi in fase di caricamento, e ha permesso di raggiungere ultime fasi della crescita intracellulare. Batteri fluorescenti vengono quindi raccolte da queste cellule infette e normalizzati per spettrofotometria per generare numeri comparabili di batteri per una successiva infezione in macrofagi mammiferi. Per la quantificazione, batteri vivi sono monitorati dopo l&#39;infezione usando la microscopia a fluorescenza, citometria a flusso, e mediante placcatura colonia. Questa tecnica mette in evidenza e si avvale del contributo della cellula ospite-dipendente l&#39;espressione del gene imitando l&#39;ambiente che si può incontrare in un percorso di acquisizione naturale. Questo approccio può essere modificato per ospitare qualsiasi batterio che utilizza un host intermediario come un mezzo per ottenere un vantaggio patogeno.

Un risultato tipico per l&#39;intero processo di infezione è descritto nella Figura 1. Vivo delle cellule al microscopio a fluorescenza che raffigurano monostrati di A.castellanii infettati con wild-type L. pneumophila durante la fase di adescamento è mostrato nella Figura 1A. Una misura di successo della fase di caricamento porterebbe ad una popolazione di circa il 90% delle cellule ospiti contenenti grandi vacuoli popolate con batteri GFP etichettati in questo MOI....

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Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Questa tecnica fornisce un metodo per raccogliere, normalizzare e quantificare la crescita intracellulare di batteri patogeni che sono pre-coltivate in cellule naturali ospiti protozoi prima di infezioni di cellule di mammifero. Questo metodo può essere modificato per accogliere una grande varietà di cellule ospiti per la fase di adescamento e tipi di cellule bersaglio.

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Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D imaging multimodale di<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infezioni in topi

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Microscopia a fluorescenza metodi per determinare la vitalità di batteri in associazione con cellule di mammifero

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la Valutazione Interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Utilizzando modelli di Zebrafish di umana virus infezioni allo schermo farmaci antivirali e caratterizzare host immune cellulo Risposte

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Il WinCF Modello - Un Microcosmo Economico e Tractable di un muco bronchiale Plugged per studiare la Microbiologia del polmone Infezioni

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Formazione immagine confocal di RNA Double-Stranded e Pattern Recognition Receptors in infezione Virus RNA negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...