Name: an injury paradigm to investigate central nervous system repair in drosophila
Uploaded: 2013-03-28T13:00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila at JoVE.com

Vi takker Mei Ann Lim for kritisk lesning av manuskriptet og andre medlemmer av vår lab for sine diskusjoner i løpet av dette arbeidet. Dette arbeidet ble finansiert av Yamada Science Foundation og Royal Society kort besøk Fellowships og EU Marie Curie International Incoming Fellowship GRR til KK, og BBSRC Project Grant (BB/H002278/1) og Wellcome Trust Equipment Grant (073228/Z/03/Z) til AH

1. Innsamling av Iscenesatt Larvene <ol><li> Sted 15. kvinnelige og 15 mannlige voksne fluer i en sylindrisk pleksiglass bur for å legge egg på en petriskål med agar og druesaft supplert med en liten scoop av gjær lime i 3 timer ved 25 ° C. Endre platen 3-4 ganger om dagen, og kast den første platen (dvs. fra O / N egg-lay). Kast også platene fra den første dagen. Fra den andre dagen på, holde platene med egg ved 25 ° C. Etter 7 dager med innsamling av egg, starte med et nytt oppsett av foreldre fluer. </li><li> Etter ca 24 timer, larvene klekkes fra eggene. Ved å hekte larver med en tynnet pensel eller med en pinsett, overfører 35 larver fra drue agar til et hetteglass inneholdende standard flue mat (10 ml) (figur 1A). </li><li> Opprettholde hetteglass som inneholder larver i 3 dager (96 timer etter egglegging, AEL) ved 25 ° C. </li></ol> 2. Disseksjon av larvenes ventral Nerve Cords for kultur <ol><li> Rengjør væreNCH ​​og hender med 70% etanol. Suge 4 flekker blokker, 2 par tenger og en nål med 70% etanol, og la lufttørke. </li><li> Forbered 4 flekker blokker med følgende media: en med destillert vann (DW) å rengjøre og bassenget rengjøres larver, en ny en med 2 ml Shield og Sang M3 insekt medium med 1% penicillin og streptomycin, Ecdysone-fri (M3 PS middels) å dissekere larvene, en tredje med 2 ml av M3 PS middels til bassenget dissekert ventrale nerve ledninger (VNCs), og en fjerde med 2 ml M3 PS medium å stikke VNCs. Alle reagensene må forvarmes til RT. </li><li> Tilsett vann til hetteglasset med 96 timer AEL larver. Deretter, ved hjelp av en spatel, forsiktig spre mat med larver fra hetteglasset til et vått papirhåndkle. Overfør 10 larver til en farging blokken som inneholder DW å vaske av maten. Erstatt DW 6 ganger. Deretter erstatte med M3 PS medium. </li><li> Overføre en av larvene til farging blokk inneholder 2 ml av M3 PS medium. </li><li> Under et disseksjonsmikroskop, dissect et larve hjerne nøye ved hjelp av standard metoder 12, men for å minimere vevskader, utvise spesiell forsiktighet ved å gå frem på følgende måte. Plasser larve dorsal side opp, og hold dorsal side på en tredjedel fra fremre enden med 2 par tang (en i hver hånd). Mens du holder den fremre delen, dra vekk bakre enden med pinsett, og rive overhuden. Hjernen og VNC skal være synlig fra bakre kant av fremre halvdel. Nøye isolere hjernen og VNC kompleks ved å fjerne fett kroppen, tarmen og epidermis. Når VNCs skades for mye, vil VNCs degenerert helt eller delvis selv uten stikkende skade. Ta hensyn til følgende punkter: </li></ol><ul><li> Ikke trekk eller rive imaginal plater og perifere nerver fra thorax VNC da dette vil skade VNC. Å kutte de perifere nerver, hold de perifere nerver med to par tang plassert nær hverandre, og trekk deretter nervene med forsteinsopp. Imaginal plater og munnpartiet kan stå festet til VNC. </li><li> Forlate ringen kjertel og lymfe kjertel festet til hjernen. </li><li> Kutt tarmen ved punktet nærmest hjernen, hvor ikke mye mat inneholdt. </li></ul><ol start="6"><li> Ved hjelp av en P20 Pipetman med spissen avskåret og utvidet litt, overføre VNC til en farging blokken som inneholder frisk M3 PS medium. Før overføring VNC, første pipette opp og ned bare mediet som brukes for disseksjon for å hindre VNC fra stikker til spissen. </li></ol> 3. Knivstikking Skade på Drosophila larve VNC Denne delen beskriver hvordan du utfører knivstikking skade på VNCs, og forberede knivstukket-VNCs for time-lapse analyse og farging. Post-knivstikking kultur betingelser og varighet er beskrevet i kapittel 5 (for time-lapse-analyse) og § 6 (for farging). <ol><li> Etter pooling nok VNCs (4-5 for time-lapseog over 24 for farging), en overføring VNC til et rent farging blokk inneholdende M3 PS. </li><li> Orientere VNC slik at dorsal neuropile er i sikte under disseksjonsmikroskop (figur 1B). Dette er den mest naturlige retningen for VNCs å ligge i når de er koblet til de optiske fliker. </li><li> Stikke manuelt ved hjelp av en wolfram nål under disseksjon mikroskop, fra ryggsiden talt i rett vinkel, og med sikte på abdominal halvdelen av VNC (figur 1B). </li></ol> Ta særlig hensyn til følgende: <ul><li> Stab bare én gang. </li><li> Stab inntil nålen treffer bunnen av glasset. Men vær forsiktig så du ikke skader nålespissen. </li><li> Stammen av nålholderen må ikke berøre medium under knivstikking. </li><li> Såret er ikke synlig under disseksjon mikroskop. </li></ul> Merk: Stab-skade relatert degenerasjon Prosedyrenkan resultere i mobilnettet degenerasjon innenfor VNC distinkt fra knivstikking lesjonen. Degenerasjon resultater i hull i neuropile, og noen ganger hull har blitt observert i cortex av ikke-knivstukket prøver. Prøver med degenerasjon påvirker neuropile eller utbredt degenerasjon påvirker også VNC overflaten må kastes. Degenerasjon kan bli identifisert som følger: <ul><li> Ru overflate, spesielt ved den laterale / ventral område av thorax, ved 22 hr av knivstikking. I ekstreme tilfeller ser VNC stakk. </li><li> Hull eller vakuoler i thorax neuropile, som kan være synlig som hull i bakgrunnen signal med fluorescens farging. </li></ul> 4. Vedlikehold av Nål og tang <ul><li> Rutinemessig sjekke om nålespissen er skarp nok. Nålespissen kan være bøyd eller butt etter benytter den for flere eksperimenter. I dette tilfellet, skjerpe spissen ved hjelp av en Arkansas stein eller tilsvarende. </li><li> Tuppen av tang måmøtes perfekt. Tipsene kan bli skadet ved bruk. I dette tilfellet, justerer spissen ved hjelp av en Arkansas steiner eller tilsvarende. </li></ul> 5. Kultur og Time-lapse opptak av knivstukket VNCs Å visualisere aksonal neuropile i stuen VNC, en GFP protein felle linje som betegner alle axons - G9 13 - kan brukes, og for å visualisere alle gliacellene (unntatt midtlinjen gliaceller) den glial driver repoGAL4 kan brukes til å uttrykke UASdsRed S197Y 14 reporter. Av krysset G9 flyr til UASdsRedS197Y,, repoGAL4 fluer, er VNCs fra avkom larver oppnådd med grønne axoner og rød gliaceller som kan tas opp i levende vev. <ol><li> Etter pooling 4-5 VNCs, overføring en VNC til en ren flekker blokken som inneholder 2 ml M3 PS, og stikke abdominal halvparten av VNC som angitt i § 3. </li><li> Overfør stukket VNC til en poly-L-lysin 3,5 mm belagt glass nederst petriskål inneholdende 1 ml M3PS. Plasser VNCs dorsal side ned. Skyv VNC bruker den flate siden av en pinsett for å la VNC å holde seg til parabolen. </li><li> Tilsett 1 ml M3 PS 15% FBS gjengi den endelige konsentrasjonen av FBS til 7,5%. </li><li> Hente bilder ved hjelp av laserskanning konfokalmikroskopi. Skann VNC, samle en Z-delen serie gjennom hele tykkelsen. Vi brukte en Leica SP2 omvendt confocal mikroskop med en temperatur kontrollert miljøkammeret. En tilsvarende confocal mikroskop skal fungere, men det kan kreve optimalisering av innstillingene for skanning. Innstillingene for vår time-lapse konfokalmikroskopi var som følger: Temperatur på miljøkammeret: 25 ° C; 20X objektiv med 4 x zoom, skannemodus xyzt, med 512x512 pikslers oppløsning, z = 1 mikrometer trinn og 1-times eller 2 - timers mellomrom. </li></ol><ul><li> Leica SP2 confocal mikroskop har en begrensning i filstørrelse for skanning. Med disse innstillingene, kan 8-9 tidspunkter bli skannet. Medandre confocal mikroskoper, bør det være mulig å skaffe bilde stabler for lengre tidspunkt, dvs. over span av opptil 24 timer. </li></ul> 6. Kultur og farging av knivstukket og Fast VNCs <ol><li> Forbered et 24-brønners vevskultur plate inneholdende 500 ul M3 PS 7.5% FBS per brønn. </li><li> Gjenta disseksjon av mer enn 24 VNCs for en 24-brønn vevskultur parabolen. </li><li> Ved å bruke P20 Pipetman med spissen cut-off, overføre 12 ikke-knivstukket VNCs fra bassenget til kultur parabolen, med en VNC per brønn. </li><li> Stab resten av VNCs i bassenget som beskrevet i pkt. 3. Overføre hver knivstukket VNC til et godt hver. </li><li> Plasser 24-brønners tallerken i 25 ° C inkubator i en ønsket varighet avhengig av eksperimentet. Celleintegritet er uendret i minst 24 timer. </li><li> Etter kultur, overføre 12 VNCs i 250 ul av 4% formaldehyd PEM i et 1,5 ml rør ved hjelp P20 Pipetman med spissen kuttes. Da, fixative er nøye pipetteres ut, tar seg ikke å skade VNCs. En liten mengde fiksativ tilstrekkelig til å dekke prøvene bør forbli i hvert rør. Deretter legge til frisk fiksativ, og forsiktig agitere for 50 min ved RT. </li><li> Skyll 2 ganger med 0,3% Triton X PBS, og deretter vaske to ganger i 10 min med 0,3% Triton X PBS ved RT. </li><li> Blokkere VNCs ved inkubering med 10% normal geit serum i 0,3% Triton X PBS i 1 time ved RT. Prøvene kan bli lagret ved 4 ° C i minst én måned. </li><li> Inkuber VNCs med primære antistoffer i mer enn 20 timer ved 4 ° C. </li><li> Skyll 2 ganger med 0,3% Triton X PBS, deretter vaske 3 ganger i 10 min med 0,3% Triton X PBS ved RT. </li><li> Inkuber VNCs med sekundære antistoffer for mer enn 16 timer ved 4 ° C. </li><li> Skyll 2 ganger med 0,3% Triton X PBS, deretter vaske 3 ganger i 10 min med 0,3% Triton X PBS ved rommet RT (i mørket hvis bruker fluorescerende sekundære antistoffer). </li><li> Erstatt PBS med 50% glycerol 50% PBS i minst entime. </li><li> Deretter erstatte med 80% glycerol 20% PBS i minst en time. </li><li> Monter en VNC i et vindu gjort på 2 lag cello-tape (omtrent 0,06 mm) på en mikroskopi glass lysbilde. Juster retningen, og plasser et dekkglass (18x18 mm) over vinduet. To VNCs kan monteres på et lysbilde ved hjelp av denne metoden. </li></ol> Hjelp av en rekke av primære antistoffer, til skade forskjellige cellulære responser kan analyseres (for eksempel endringer i celle nummer og celle form). 7. Analysere data ved hjelp ImageJ og en rekke Plugins Hvis VNC ikke har knivstikking urelaterte degenerasjon, må prøven telles i for analyse uansett lesjon størrelse. Som knivstikking gjøres manuelt, skiller lesjon størrelse hver gang. Derfor er det viktig å analysere statistisk effekten av stikkende, når dette er mulig. <ol><li> Sårstørrelsen måling. Størrelsen av såret, er en indikator for reparasjon 15.Den knivstikking lesjon er synlig som blottet for GFP uttrykk. Lesjon området kan måles lapse data ved hjelp av fritt tilgjengelig ImageJ programvare, som følger: <ol><li> Bruke ImageJ, åpne en bunke med confocal bilder fra &quot;Fil&quot;-menyen, velg &quot;Import&quot; og herfra velger &quot;Image sekvens&quot;. Dette vil slå samling av individuelle bilder i en stabel. </li><li> Neste endre &quot;stack&quot; til en &quot;Hyperstack&quot; ved å gå til &quot;Image&quot; menyen, velg &quot;Hyperstack&quot;, velg deretter &quot;Stable til Hyperstack&quot;. </li><li> Still voxel størrelse ved å bruke &quot;Egenskaper&quot; fra &quot;Image&quot; menyen. I data innhentet ved hjelp av Leica SP2 confocal mikroskop, kan voxel størrelse fås fra skanning-programvaren, og fra metadata tekstfil lagret sammen med bildene. Med vår innstilling som beskrevet i § 3, bildepunktdimensjoner er xy = 0,366211 mikrometer og z = 0,99709 um. </li><li> Ved å undersøke alle skivene i en tid punkt, tegner den maksimale omrisset av lesjonen med polygonet-selection tool i verktøylinjen. Dette er denRegion Of Interest (ROI). </li><li> Legg ROI til ROI leder ved å gå til &quot;Analyser&quot;-menyen blar du ned og velg &quot;Verktøy&quot; og deretter &quot;ROI manager&quot;, deretter &quot;Legg til&quot;. </li><li> Gjenta dette for alle tidspunkter. </li><li> Klikk på &quot;Measure&quot;-knappen i ROI leder for å få området størrelsen på hver ROI. </li></ol></li><li> Korreksjon av VNC bevegelse under time-lapse-opptak. &quot;Stackreg&quot; og &quot;Turboreg&quot; plugins 16 (fra ImageJ nettstedet <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ): disse plugins tillater å korrigere lite utvalg bevegelser under time-lapse. Bygg en stabel med tilsvarende representant optisk snitt gjennom alle time-poeng og bruke plugins. Det hjelper å visualisere hvordan lesjon endringer over tid. Detaljene på disse metodene og bruksanvisningen er tilgjengelig fra forskergruppen som utviklet disse plugins. ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/" target="_blank">http://bigwww.epfl.c</a>h / thevenaz / stackreg /). </li><li> Automatisk telling av gliaceller. &quot;DeadEasy gliaceller&quot; plugin ( <a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html</a> ): Dette ble utviklet for å telle antall REPO-positive gliacellene i Drosophila larve VNC og å undersøke endringen i glial nummer forårsaket av knivstikking skade 17. Den plug-in fungerer nøyaktig, med en usikkerhet på 0,1% falske positive og 4,3% falske negative 17. For å bruke denne plug-in, første etiketten alle gliaceller (unntatt midtlinjen) i prøven med immunfluorescens med anti-REPO antistoffer. Deretter installerer plug-in i ImageJ, åpne en bunke med confocal bilder og kjøre plug-in. Det teller gliacellene automatisk i ca 30 sekunder. </li><li> Automatisk telling av apoptotiske celler. &quot;DeadEasy Caspase larver&quot; plug-in ( <a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.bioscienc</a>es-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Dette ble utviklet for å telle antall celler merket med anti-spaltet-Caspase3, og en ny versjon ble tilpasset for larve VNCs. Stikkende skade fører til en økning i programmert celledød 11. For å bruke denne plug-in, første etiketten apoptotiske celler i prøven med immunfluorescens med anti-spaltet-Caspase-3 antistoffer. Deretter installerer plug-in i ImageJ, åpne en bunke med confocal bilder og kjøre plug-in. Det teller apoptotiske celler automatisk i ca 30 sekunder. </li></ol> 8. Reagenser <ol><li> Kulturmedium: Shield og Sang M3 insekt medium, 7,5% føtalt bovint serum, 1% penicillin og 1% streptomycin. </li><li> 0,01% Poly-L-lysin i sterilt DW. </li><li> Fiksativ: 4% formaldehyd, ultrarent i PEM (0,1 M Pipes, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO 4) løsning. </li><li> Blokkering løsning for farging: 10% normal geit serum i 0,3% Triton X PBS. </li><li> Anti-Glutamine Synthetase2 antistoffer: 1:250 i blokkering løsning. </li><li> Anti-GFP antistoffer: 1:1.000 i blokkering løsning. </li><li> Anti-REPO antistoffer: 1:250 i blokkering løsning. </li><li> Anti-ELAV antistoffer: 1:250 i blokkering løsning. </li><li> Anti-spaltede caspase 3 antistoffer: 1:1.000 i blokkering løsning. </li><li> Sekundære antistoffer: 1:250 i blokkering løsning. </li></ol>

<ol>
	<li>Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Drosophila+model+of+nerve+injury+reveals+an+essential+role+of+Nmnat+in+maintaining+axonal+integrity.">A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity.</a> Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J. Cell Biol. 191, 211-223 (2010).</li><li>Leyssen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+promotes+post-developmental+neurite+arborization+in+the+Drosophila+brain.">Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain.</a> EMBO J. 24, 2944-2955 (2005).</li><li>Kato, K., Awasaki, T., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+programmed+cell+death+induces+glial+cell+division+in+the+adult+Drosophila+brain.">Neuronal programmed cell death induces glial cell division in the adult Drosophila brain.</a> Development. 136, 51-59 (2009).</li><li>Ayaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila.">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 6010-6021 (2008).</li><li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+bases+of+behavioral+plasticity:+establishing+and+modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+genetic+system.">Cellular bases of behavioral plasticity: establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila genetic system.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li><li>Gomez-Marin, A., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+sensation+during+orientation+behavior+in+the+Drosophila+larva:+more+sense+than+luck.">Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than luck.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 208-215 (2012).</li><li>Schleyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavior-based+circuit+model+of+how+outcome+expectations+organize+learned+behavior+in+larval+Drosophila.">A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila.</a> Learn Mem. 18, 639-653 (2011).</li><li>Brown, H. L., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-285 (2006).</li><li>Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+regenerative+response+to+central+nervous+system+injury+is+enabled+by+pros-notch+and+pros-NFkappaB+feedback.">The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback.</a> PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila protocols. , (2000).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15050-15055 (2001).</li><li>Verkhusha, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+mutant+of+red+fluorescent+protein+DsRed+for+double+labeling+and+developmental+timer+of+neural+fiber+bundle+formation.">An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation.</a> J. Biol. Chem. 276, 29621-29624 (2001).</li><li>Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+regenerative+response+to+central+nervous+system+injury+is+enabled+by+Pros-Notch+and+Pros-NFkB+feedback.">The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by Pros-Notch and Pros-NFkB feedback.</a> PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7, 27-41 (1998).</li><li>Forero, M. G., Kato, K., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+cell+counting+in+vivo+in+the+larval+nervous+system+of+Drosophila.">Automatic cell counting in vivo in the larval nervous system of Drosophila.</a> J. Microsc. 46, 202-212 (2012).</li><li>Forero, M. G., Pennack, J. A., Learte, A. R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeadEasy+caspase:+automatic+counting+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">DeadEasy caspase: automatic counting of apoptotic cells in Drosophila.</a> PLoS One. 4, e5441 (2009).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141, 536-548 (2010).</li><li>Nicolai, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+dendritic+marker+sheds+light+on+neuronal+connectivity+in+Drosophila.">Genetically encoded dendritic marker sheds light on neuronal connectivity in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20553-20558 (2010).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li></ol>

Ingen interessekonflikt erklært.

Vi har etablert en protokoll for knivstikking skade på Drosophila larve CNS å undersøke cellulære responser til skade, reparasjon og regenerering. Larve VNCs er dissekert og knivstukket, etter som de er filmet med time-lapse mikroskopi eller fast for fluorescens farging å visualisere gliaceller og nevroner, apoptose eller celledeling. Progresjonen av lesjonen over tid kan måles. Denne metoden er ledsaget av hensikt utviklet programvare for kvantitativ og statistisk analyse av celle nummer endres ved skader og under reparasjon. Vi stakk 96-timers AEL larver (og disse ble enten fast eller lov til å utvikle seg videre), en utviklingsstadiet før overgangen til puppe og deretter voksen flue. Ved 96 timers, VNCs er store nok for knivstikking, de er i midten av tredje instar stadiet, og dermed er ikke gjennomgår forpupping enda; og nervesystemet er allerede fullt funksjonell lik som annonsenult. Det kan være mulig å stikke litt senere i larver og presis timing må velges for å passe på problemstillingen. Imidlertid, avhengig av behandlet spørsmål, vil det generelt være nødvendig å kultur skiller VNCs i noen tid å observere cellulære responser til skade. En tid etter 120 timers AEL forpupping starter, en periode da CNS er remodeled og er dermed best unngås. Således tidsvinduet for knivstikking pluss kultur i larven er ganske begrenset. Bruke larver har fortsatt en stor teknisk fremfor å bruke voksne: mens, på samme måte som den voksne, er nervesystemet allerede fullt funksjonell, analyserer svaret til skade betydelig enklere og raskere i larver. Når man sammenligner størrelsen og morfologien til hjerner og VNCs dissekert og dyrket i en rett til VNCs som dissekeres ved en tilsvarende senere tidspunkt uten dyrking i et fat, synes det som utvikling er tregere i kultur enn in vivo. I andre henseender,utvikling utøver normalt i kultur, er vevet integritet bevares og celler er i live viser flere svar. Wound ekspansjon, neuropile reparasjon og glial spredning skje innen 22 timer etter knivstikking. Dette viser at cellulære responser til skade skje i kultur, og det er mest sannsynlig ikke nødvendig å opprettholde eksplanter lenger enn en dag. Hvis lengre sikt kultur ble ønsket kan protokollen kreve ytterligere optimalisering som bruker en dyrkingsplate innsats 5. Det er viktig å identifisere gode eksempler fra degenereres seg. Optimalisere denne protokollen tar litt dyktighet og uunngåelig degenerasjon vil skje i noen eksemplarer. VNC kan kjøpe en &quot;blomkål&quot; utseende som reflekterer et sammenbrudd av vev integritet (figur 5B). Degenerasjon er også anerkjent av vacuolization av VNC uavhengig av stikkende, som kan være til stede i intakte, ikke-knivstukket prøver (figur 5C </strong&gt;). Disse prøvene må kasseres. Degenerasjon er mest sannsynlig forårsaket av grov disseksjon, som kan rive nerver og den beskyttende lag av overflaten gliaceller. Dermed stor forsiktighet må tas for å dissekere forsiktig. Andre påvirkende faktorer er kultur medium, som må holdes rent og med antibiotika, følger strengt til vasker og timing som angitt i protokollen. Endelig, lengden av nålen og nålholderen, størrelse og skarphet av nålen er meget viktig. Nålholderen kan forurense dyrkningsmediet og en stump nål kan føre til en stor skade som ikke kan reparere seg selv og vil føre til degenerasjon. Det er viktig å opprettholde rutinemessig nålen skarp. I denne protokollen, tok vi fordel av et protein felle linje av fluer å visualisere neuropile parallelt med visualisering av glial prosesser ved hjelp av den tradisjonelle GAL4-UAS systemet. Disse verktøyene kan også kombineres med andre binære ekspresjonssystemer som LexA 19 og Q-system 20, som er uavhengige av GAL4. Dette ville muliggjøre analysen av interaksjoner for eksempel mellom axoner og glial prosesser, i respons på skade. Ved ytterligere kombinere det med andre genetiske verktøy som reportere for dendritter 21 eller kalsium tilstrømningen 22, gir denne metoden en flott mulighet til å analysere cellebiologi bak skaden respons gliacellene, nevrale aksoner og dendritter i CNS. Endelig, kan denne metoden kombineres med standard genetikk, mutasjoner og over-ekspresjon av gener, for å teste genfunksjon i responser på skade og regenerering. Denne protokollen har stor suksess ledet til oppdagelsen av et gen nettverk underliggende regenerativ glial respons på CNS skade 11. Gitt den evolusjonære bevaring av gen-funksjon, unraveling disse cellulære hendelser og genfunksjoner i frukt-fluer er sannsynlig å gi betydelige innsikt i forståelsen av mammalian CNS respons på skade og regenerering.

Regenerering i dyr viser at cellene følelse når organismevekst er bestilt og komplett, og hvor strukturell integritet av en organisme er oppnådd og opprettholdt. Forstå disse mystiske evner celler er av stor interesse for biologi. Fremme gjenfødelse er en av de viktigste målene for medisinsk nevrovitenskap. Hos mennesker, ikke skadede sentralnervesystemet (CNS) ikke forsterkes. Gnagermodeller av ryggmargsskader brukes til å forstå hvordan cellene reagerer til skade. Men etiske hensyn, høye kostnader og det langsomme livet syklus av dyrene begrense fremgang. Frukten-fly Drosophila er en mye brukt modell organisme i utviklingsbiologi og nevrovitenskap. Takket være den kraftige genetiske verktøy og kort livssyklus, har Drosophila recurrently førte til oppdagelsen av genet funksjoner og genet nettverk med relevans for forståelsen av mennesker og sykdom. Det er rikelig dokumentasjon av evolusjonære conbevaring av gen-funksjon mot fluer til mennesker. De siste årene har flere paradigmer for nervesystemet skade etablert i Drosophila. Noen består av skade perifere nerver som går langs vingen eller axotomy av perifere nerver, inkludert sensoriske 1 og motor aksoner 2. Imidlertid, det perifere og sentrale nervesystem skiller seg på mange måter, og det er godt kjent at i mange dyr det perifere nervesystemet kan regenerere mens CNS kan ikke. Derfor, for å forstå CNS regenerering, direkte skade til CNS er mer hensiktsmessig. Stikkende skade med en nål har blitt brukt til Drosophila voksen hjerne å undersøke responsen til skade 3,4. Bruk en annen tilnærming, analysert Ayaz et al. Avkuttede CNS axoner i dyrkede voksne hjerner med en Piezo makt microdissector, og deres regenerering for 4 dager 5. Fordelen med disse senere eksperimentelle oppsettet ups er at de fokuserer på hjernen, som er utvilsomt av stor interesse. Ulempen er at hjernen er mye mer kompleks enn den VNC, som omhandler kun med motor og sensoriske kontroll. Arbeid på den voksne hjernen er også mer tidkrevende. Larven er klar for eksperimenter i 4 dager, mens det tar ca 10 dager for voksen eclosion, og deretter ytterligere 5 dager for modning deres. Den voksne hjernen er også mer vanskelig å håndtere, fordi det er innkapslet i tykk skjellaget, som er vanskelig å fjerne. VNC har ytterligere tiltrekningen av å være funksjonelt likeverdig med det virveldyr ryggmargen. Drosophila larve er mye brukt som modell organisme for nevrovitenskap 6-9. Selv strengt tatt larven er i en utviklingsfase, kan det også bli betraktet som en fullt funksjonell dyr. Larven har locomotion, flere sanser inkludert luktesans, smak og nociception, og læring og hukommelse. Dermed larve VNC wsom valgt som den ideelle modellen for CNS skade. Larver og pupal VNCs kan dissekert og dyrket i parabolen, fremdeles beholder mobilnettet integritet for opp til 24 hr 10. Dette antydet at skaden kan brukes til VNC, som deretter kunne registreres i time-lapse for over denne perioden, eller kultivert og fast på en hvilken som helst ønsket tidspunkt i denne perioden. Her presenterer vi en eksperimentell paradigme for CNS skade ved hjelp av Drosophila larve VNC. VNC er først dissekert fra larve, og knivstikking skade påføres manuelt med en tungsten nål. VNC er deretter plassert på et glass-bunn dekkglass, og filmet med time-lapse laserskanning konfokalmikroskopi. Alternativt kan VNCs dyrkes for en ønsket tidsperiode, og de cellulære effekter av skader kan bli analysert i faste prøver hjelp farging og konfokalmikroskopi. Sårområdet kan måles, og kvantitativ analyse av celle Number (celleproliferasjon og celledød) kan utføres med hensikt utviklet programvare. Store utvalgsstørrelser lett kan håndteres, som resulterer i statistisk validerte resultater. Disse metodene har blitt kombinert med den kraftige genetikk Drosophila å oppdage et gen nettverk underliggende glial regenerativ respons til CNS skade 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Utstyr </td></tr><tr><td> Farging blokk </td><td> Brunel Microscope </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tang nr. 5 </td><td> f.eks Fin Science Verktøy </td><td> f.eks 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Tungsten nål: stang diameter, 0,5 mm, dysestørrelse, 1 mikrometer, lengde, 2 tommers </td><td> Roboz kirurgisk instrument </td><td> RS-6065 </td><td></td></tr><tr><td> Nålholderen </td><td> Roboz kirurgisk instrument </td><td> RS-6060 </td><td></td></tr><tr><td> Arkansans steiner: Repair Kit for Dumont tang </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 29000-00 </td><td></td></tr><tr><td> 35 mm petriskål med 27 mm glass base </td><td> Iwaki </td><td> 3930-035 </td><td></td></tr><tr><td> Leica SP2-AOBS confocal invertert mikroskop med miljø kammer </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Shield og Sang M3 insekt medium (ekdyson gratis) </td><td> Sigma </td><td> S3652-500 ml </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin og streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfat-bufret saltvann (PBS) </td><td> Se 12 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Sigma </td><td> F7524 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-lysin </td><td> Sigma </td><td> P1399-25mg </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehyd, 10%, metanol gratis, Ultra Pure </td><td> Polysciences </td><td> 04018-1 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Mus anti-glutamin syntetase antistoffer </td><td> Millipore </td><td> MAB302 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-GFP antistoffer </td><td> Life-teknologi </td><td> A11122 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse anti-REPO antistoffer </td><td> Utviklingsstudier hybridom bank </td><td> 8D12 </td><td></td></tr><tr><td> Rat anti-ELAV antistoffer </td><td> Utviklingsstudier hybridom bank </td><td> 7E8A10 </td><td></td></tr><tr><td> Kanin anti-aktiv caspase 3 antistoffer </td><td> Abcam </td><td> ab13847 </td><td></td></tr><tr><td> Normal geit serum </td><td> Vector Laboratories </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-kanin Alexa Fluor 488 </td><td> Life-teknologi </td><td> A11034 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mus Alexa Fluor 647 </td><td&gt; Life-teknologi </td><td> A21236 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rotte Alexa Fluor 647 </td><td> Life-teknologi </td><td> A21247 </td><td></td></tr></tbody></table>

an injury paradigm to investigate central nervous system repair in drosophila

En eksperimentell metode er utviklet for å undersøke cellulære responser til sentralnervesystemet (CNS) skade ved hjelp av frukt-fly Drosophila. Forstå reparasjon og regenerering i dyr er et viktig spørsmål i biologi. Den skadede mennesker CNS ikke regenerere ikke, og forstå hvordan man skal fremme regenerering er en av de viktigste målene for medisinsk nevrovitenskap. Den kraftige genetiske verktøykasse av Drosophila kan brukes til å takle problemet med CNS regenerasjon. En lesjon til CNS ventral nerve ledningen (VNC, tilsvarende virveldyr ryggmargen) brukes manuelt med en tungsten nål. VNC kan senere bli filmet i time-lapse ved hjelp av laserskanning konfokalmikroskopi for opp til 24 timers å følge utviklingen av lesjon over tid. Alternativt kan det dyrkes, deretter fast og farget med immunfluorescens å visualisere nevroner og gliaceller med konfokal mikroskopi. Ved hjelp av egnede markører, changes i celle morfologi og celle staten som følge av skade kan visualiseres. Med ImageJ og hensikt utviklet plug-ins, kan kvantitative og statistiske analyser utføres for å måle endringer i såret størrelse over tid og effekten av skader i celleproliferasjon og celledød. Disse metodene tillater analyse av store utvalgsstørrelser. De kan kombineres med de kraftige genetikk Drosophila å undersøke de molekylære mekanismene bak CNS regenerering og reparasjon.

Her viser vi hvordan du utfører knivstikking skade på Drosophila larve VNC og analysere cellulære responser til skade ved hjelp av time-lapse og farging confocal fluorescens mikroskopi. For time-lapse data, er lesjonen visualisert som en GFP-negativ område innenfor neuropile av prøver som bærer G9 aksonal markør (figur 2). Kort tid etter knivstikking, liten GFP-negative områder, som ser ut som hull eller vakuoler, begynner å vises (figur 2A). Slike GFP-negative områder generelt forstørre opp til rundt 6-8 hr etter knivstikking (figur 2A). Deretter de GFP-negative områder krympe og kan til og med forsvinne (figur 2B). Av 22 hr etter knivstikking, er det areal som opptas av såret generelt mindre enn det maksimale området var på 6-8 timer etter knivstikking (figur 2A, B). Tilsvarende den DsRed-negative området i glial prosesser øker i utgangspunktet også, men Shrinks med 22 timer etter knivstikking. Interessant, ofte DsRed-positive glial prosesser fylle GFP-negative hull i neuropile før deres forsvinning (figur 2C). Bruke farging i faste prøver, fine glial prosesser og deres respons på skade kan visualiseres med bedre oppløsning enn med time-lapse bilder. Dette kan gjøres for eksempel ved hjelp av repoGAL4 glial driver å indusere uttrykk for en membran tethered reporter (f.eks UAS-mCD8GFP) i flyr å visualisere alle gliacellene (unntatt midtlinjen gliaceller). Dette kan også kombineres med andre glial markører, slik som anti-GS2, hvilke etiketter neuropile-assosierte gliacellene (Figurene 3A, B). Her viser vi at selv om ventrale nerve ledningen er stukket fra dorsal side, knivstikking skade resulterer i en bulk ventrally (figur 3A, pilspisser). Knivstikking ser ut til å påvirke mer alvorlig den neuropile og neuropile-assosiert gliacellene then overflate og cortex gliacellene (Figur 3B). Glial prosesser vises uorganisert i neuropile, mens de fortsatt opprettholde sin mesh som organisasjon i hjernebarken. Skade resulterer i GS2-positive mobilnettet rusk, som er forskjellig fra normale celler som rusk fragmenter er mye mindre og ikke koblet til en celle kropp. Dette avslører skader neuropile-assosierte gliacellene (figur 3B). Degenereres neuropile-tilknyttede gliacellene ble også observert ved elektronmikroskopi 15. Anti-spaltet-Caspase 3 + apoptose farging observert i neuropile-tilknyttede gliacellene 15, viser de gjennomgår apoptose ved knivstikking skade. Neuropile tilknyttede gliacellene ble også vist til phagocytose neuronal rusk 15, og GS2 + signal kan også avsløre engulfment av apoptotiske nevroner ved glial prosesser. Spaltet-Caspase + apoptotiske celler er også observert i cortex, i det minste noen av hvilke tilsvarer Elav + neuroner ( <strong&gt; Figur 3C). Med faste prøver og farging gjør også kvantitative analyser av cellulære responser til skade, for eksempel effekter i spredning og apoptose. For dette, vi purposely utviklet to ImageJ plug-ins, DeadEasy Caspase Larva og DeadEasy gliaceller, å telle automatisk antall gliacellene og apoptotiske celler, henholdsvis. De har blitt validert for å arbeide på larve VNCs og er svært nøyaktig. Bruker disse, er det mulig å observere en økning i antall REPO-positive glial celler forårsaket av stikkende skade, etter 22 timer (Figur 4A) 15. Det er også en økning i antall av anti-spaltet-Caspase-3 apoptotiske celler ved 6 hr etter knivstikking (figur 4B) 15. Slik økning i glial proliferasjon og apoptose i respons til skade i de Drosophila CNS minner skaden respons i virveldyr CNS. Et viktig aspekt ved denne proprotokollen er kvaliteten på VNC disseksjoner. Det er vanskelig å si samtidig med disseksjon om VNCs er skadet eller ikke i prosessen. Det er viktig å ta spesielt vare for å utføre milde disseksjoner. Imidlertid vil dårlige kvalitet prøver uunngåelig bli produsert, og det er viktig at disse er identifisert på senere stadier og kastes. I våre hender, synes VNC degenerasjon å være relatert til skade, men i stedet skyldes grov disseksjon. Vi har ikke observert en kritisk størrelse i skade såret, og vi analysere alle skadde prøver som ikke er degradert. Når VNCs opprettholde sin integritet, tenderer VNC overflaten for å se glatt og skinnende, og ingen hull i neuropile er observert (Figur 5A). Nedbrytning av VNCs kan bli gjenkjent av 24-timers post-disseksjon fra den grove overflaten av VNC ventrale og laterale områder (figur 5B). Nedbrytning av neuropile urelatert til knivstikking skade kan også forekomme, og det er anerkjent som neuropile holes i bakgrunnen signal immunostained prøver. Prøver med disse tegn på degenerasjon skal kastes (figur 5C). I våre hender, suksessraten for disseksjon og skader i intakt og knivstukket kontroll (yw) fluer er begge rundt 70%. Denne prisen vil variere med dyktighet av personen som utfører forsøkene, og med genotype. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig1.jpg" /> Figur 1. Skjematisk tegning av larvenes iscenesettelse og knivstikking skade. (A) ved dag 0, er fluer lov til å legge egg i en drue juice petriskål i 3 timer. Ved dag 1, den skraverte første instar larver (L1) er samlet og plassert i ampuller inneholdende standard gjær mat, der de holdes i ytterligere 3 dager. Ved dag 4, er larver innsamlet fra mat hetteglass, og brukes for de stikkende eksperimenter. (B) sideriss av larve sentralnervesystemet.Mageregionen av ventrale nerve ledningen er stukket med en nål fra ryggsiden. Anterior er til venstre, og posterior til høyre. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig2.jpg" /> Figur 2. Time-lapse progresjon av VNC lesjon. Konfokalmikroskopi på live VNCs med GFP-merket axoner og DsRed-merket gliaceller. Genotype:. UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / + (A) lesjon er anerkjent av mangel på fluorescens på aksonal neuropile. Etter å ha knivstukket, GFP-negative hull vises, deretter øker i størrelse og antall. Anslag av 5 optiske deler fra hvert tidspunkt etter knivstikking skade. (B) De aksonal neuropile lesjon krymper fra 9 hr etter knivstikking. Disse bildene er enkle optiske deler fra forskjellige tidspunkter etter knivstikking skade. Å identifisere tilsvarende stillinger i hver prøve, det samme stykke nummer fra each tidspunkt i bunken med time-lapse data ble valgt. Ved å sammenligne de mønstrene visualisert med G9 og repoGAL4&gt; UASmCD8GFP i området ikke påvirkes av stikkende, ble skivene verifisert som fra tilsvarende stillinger i Z-aksen. Stiplede linjer i (A, B) viser kanten av såret. (C) Ved høy forstørrelse av sår på neuropile. GFP-negative hull var fylt med DsRed-positive glial prosesser, og deretter forsvant (pilspisser). Horisontal visning. Fremre opp. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig3.jpg" /> Figur 3. Cellular karakterisering av VNC lesjon. VNCs bærer en membran tethered GFP reporter for alle gliacellene (unntatt midtlinjen gliaceller) farget med anti-GFP og anti-GS2, en neuropile-assosiert glial celle markør. Genotype:. + / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / + (A) VNCs ble knivstukket fra dorsal side, men dette fører til en bulk ventrally (pilspisser). Sagittal visning av enkle optiske deler, rygg opp og fremre venstre. (A, B) Knivstikking skade påvirker mer alvorlig neuropile-assosiert gliacellene enn cortex og overflate gliacellene. Skade resulterer i GS2-positive mobilnettet rusk (pilspisser i B). (B) Horisontal visning av enkle optiske deler, anterior opp. Pilspisser peker på GS2 + celleavfall. (C) Colocalisation av apoptotiske markør anti-spaltet-Caspase-3 og neuronal markør anti-Elav viser at ved skade noen av de døende celler i hjernebarken er nerveceller. np, neuropile, cx, cortex. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig4.jpg" /> Figur 4. Automatisk telling av gliacellene og apoptotiske celler ved hjelp DeadEasy. (A) Eksempel på bruk av «DeadEasy larve gliaceller&quot; for å telle REPO positivegliacellene. Venstre: VNC ventrale halvdeler farget med anti-REPO antistoffer, midten: utgang fra DeadEasy larve gliaceller viser celler identifisert av plug-in, høyre: flette. Tallene til høyre er antall REPO-positive celler telles automatisk i en hel stabel av optiske confocal seksjoner i ca 30 sekunder. Antallet gliaceller øker i knivstukket VNCs. (B) Eksempel på bruk av «DeadEasy Caspase larve &#39;. Venstre: projeksjoner av 5 optiske confocal seksjoner farget med anti-spaltet-caspase 3 antistoffer, midten: utgang viser celler identifisert av plug-in, høyre: flette. Tallene til høyre er antall caspase-positive celler telles automatisk i en hel stabel av optiske confocal seksjoner i ca 30 sekunder. Antallet apoptotiske celler øker i stukket VNC. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig5.jpg" /> Figur 5. Eksempler på degeneration. (A) En frisk VNC. Det er ingen tegn til degenerasjon. (B) side av thorax er degenereres (pilspisser) i en knivstukket prøven. Stjernen angir lesjon. (C) Hull i thorax neuropile (hvit pilspiss) og cortex (oransje pilspiss) i en ikke-stukket VNC. Prøver med skadet neuropile og omfattende vacuolization må kasseres. Her VNCs ble farget med neuropile tilhørende glial markør anti-Ebony. Horisontal visning, anterior opp.

Watch this Scientific Journal Video about An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila at JoVE.com

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

En skade paradigmet med Drosophila larve ventrale nerve ledningen for å undersøke sentrale nervesystemet regenerering og reparasjon er beskrevet. Knivstikking etterfulgt av laserskanning konfokalmikroskopi i time-lapse og faste prøver, kombinert med kvantitativ analyse med målrettet utviklet programvare og genetikk, brukes til å undersøke de molekylære mekanismene for CNS regenerering og reparasjon.

En skade Paradigm for å etterforske Central Nervous System Repair i<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal Imaging of Stem Cell implantasjon i sentralnervesystemet av Mus

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produksjon av Lentiviral vektorer for Transducing Celler fra Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Merking av enkeltceller i Central Nervous System av<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkte Intraventrikulær Levering av legemidler til gnager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Avhør av Central Nervous System Translatome av Polyribosome Fraksjone

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering av gnagere sentralnervesystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optisk Clearing av musen sentralnervesystemet Bruke Passiv CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Anatomisk inspirerte tredimensjonale mikrovev-konstruerte nevrale nettverk for nervesystemet Rekonstruksjon, modulering og modellering

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...