Name: generation of dispersed presomitic mesoderm cell cultures for imaging of the zebrafish segmentation clock in single cells
Uploaded: 2014-07-24T13:00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en EMBO Langsiktig fellesskap (ABW), en National Science Foundation International Ansvarleg (ABW), Max Planck Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), en graver-BB fellesskap (AO), og European Research Council under European Communities sjuende rammeprogram STG-207634 (DS, ACO). Vi takker Ravi Desai for nyttige kommentarer til manuskriptet. Vi vil også gjerne takke MPI-CBG protein uttrykk anlegg for produksjon av sebrafisk Fibronectin1 fragment, MPI-CBG fisk anlegget ansatte for stell og vedlikehold av våre fiske linjer og MPI-CBG lysmikroskopi anlegg for bildebehandling støtte.

En. Før Dissection <ol><li> På dagen før disseksjon, skaffe embryoer fra en incross av sebrafisk parene heterozygote for den transgene allel. <ol><li> Hev embryoer i E3 medium uten metylenblått ved 28 o C til skjold scenen (6 timers post-fertilisering). </li><li> Overføre embryo i E3 medium uten metylenblått til 20 o CO / N. Ved 20 o C, vil embryoer danne en somitt per time når de nå tailbud scenen. Etter 17-20 timer O / N ved 20 ° C, bør embryoer være på 5 til 8 somitt stadium følgende morgen ved begynnelsen av disseksjon protokollen. </li></ol></li><li> Monter verktøy og reagenser som trengs for disseksjon. <ol><li> Brann-polert glass pipette for overføring av embryoer og vev </li><li> Par fine tang for fjerning av chorions fra embryo </li><li> Sylgard-belagt 35-mm parabolen for disseksjon - Hell Sylgard polymer i et 35 mm fatet og kurere O / N i en 37 ° C. Gjør disseksjon godt meden nålespissen å fjerne et lite volum av herdet polymer. Retten kan rengjøres og senere gjenbrukt. </li><li> Skjerpet, flatet wolfram tråd verktøy for PSM vev manipulasjon </li><li> Micro-skalpell for å skjære ønskede biter av PSM til kultur </li><li> 35-mm plast parabolen for trypsin inkubasjon </li><li> L15 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum </li><li> 0,25% Trypsin / EDTA-oppløsning </li><li> Sigmacoted gel-lasting tips for spredning </li><li> Plast petriskåler som inneholder E3 medium uten metylenblått. </li></ol></li><li> Dekk med glassbunn bildebehandling tallerken med Fibronectin1 substrat (10 mikrogram / ml i PBS). La tallerken på benken for å belegge under disseksjon. </li><li> Bruk stereoskop med passende fluorescencefilter å identifisere og sortere positive transgene embryoer (5 til 8 somitt scenen). <ol><li> Identifiser transgene embryoer ved å undersøke presomitic mesoderm (PSM) for YFP til uttrykk under fluorescens kanal (figur 1A). Fluorescens should være synlig i regionen fra den siste dannet somitt til tailbud. Velg embryoer med este signal; 25% av avkommet skal være homozygot embryoer bærer to kopier av transgenet. Antallet identifiserte embryoer nødvendig varierer avhengig av eksperimentet. En dissekert tailbud brikke vil gi 1000 celler, i gjennomsnitt. Vanligvis er et par ytterligere positive embryoer er nyttige i tilfelle feil er gjort under disseksjonen. </li><li> Bruk overført lys som en posisjonell referanse til skille noe autofluorescence, spesielt i eggeplomme celle, fra signalet. </li><li> Overfør positive embryo til en separat plastpetriskål inneholdende E3 medium uten metylenblått. </li></ol></li></ol> 2. PSM Dissection og spredning <ol><li> Forbered embryoer for disseksjon. <ol><li> Under en disseksjon mikroskop, hjelp fin pinsett, fjerner du forsiktig chorion fra hvert embryo i E3 medium. Pass på så du ikke skader fosteret eller forstyrre plomme celle. </li&gt; <li> Fyll Sylgard-belagt dissekere parabolen med L15 medium med serum. Bruk pinsett eller en annen flat verktøy, fjerne eventuelle luftbobler fra overflaten av Sylgard. </li><li> Overfør dechorionated embryo ved hjelp av brann-polert glass pipette til disseksjon parabolen. </li><li> Ved hjelp av wire verktøy, flytte alle embryoer til den ene siden av dissekere fatet. </li></ol></li><li> Dissekere PSM fra en enkelt embryo. <ol><li> Orient en enkelt embryo på sin laterale side i liten godt laget i Sylgard lag i dissekere fatet (figur 1B). </li><li> Ved hjelp av mikro-skalpell, skjære gjennom embryo og plomme celle bare anterior til hindbrain og gjennom ventral pol av embryoet (Figur 1B, stiplet rød linje). </li><li> Fjern den fremre del av embryo fra brønnen, flytte den til siden av fatet, og deretter bruke wire verktøy for å skrape bort gjenværende eggeplomme celle granulat fra bakre seksjonen inklusive PSM. </li><li>Når plommen har blitt skrapt bort, flate og orientere PSM med den fremre enden peker bort fra eksperimentator og bakre peker mot eksperimentator (figur 1C). </li><li> Hvis det tynne laget av ektoderm ikke har trukket seg etter dette punktet, bruke wire verktøy for å skrelle den bort fra toppen av PSM vev. </li><li> Ved hjelp av mikro skalpell kutte tailbud, den bakre enden av PSM forbi enden av ryggstreng, bort fra resten av vevet (figur 1C, stiplet rød linje). MERK: Andre stykker av vev fra PSM, f.eks fremre PSM nærmere den sist dannet somitt, kan også tas med i kultur, avhengig av den eksperimentelle spørsmålet. </li><li> Flytt tailbud brikke til det ene hjørnet av parabolen vekk fra dissekere området. Bruk wire verktøy for å fjerne eventuelle rester og uønsket embryo vev fra dissekere feltet. </li><li> Gjenta med den neste embryo. </li></ol></li><li> Pool tailbud stykker fra flere embryos, avhengig av hvor mange celler vil være nødvendig for eksperimentet. Ifølge et enkelt stykke tailbud vev gir 1000 celler. </li><li> Fill tomme 35 mm plast-tallerken med et lite volum av trypsin-EDTA. </li><li> Bruke brann-polert glass pipette, overføre tailbud stykker fra dissekere fatet inn fatet inneholder trypsin / EDTA. Inkuber tailbud stykker i trypsin / EDTA i 20 min ved RT. </li><li> Mens vevet blir inkuberes i trypsin, fjerne Fibronectin1 løsning fra glass-bunn bildebehandling fatet. <ol><li> Vask løsningen fra glass tre ganger med MilliQ vann. Bruk sug for å fjerne hver vask og sikre at parabolen er helt tørt. </li></ol></li><li> Spre tailbud stykker i medium for bildebehandling. <ol><li> Pipetter 100 mL av L15 medium med serum i bildebehandling fatet. </li><li> Ved hjelp av en belagt gel tips, fjerne tailbud stykker fra trypsin / EDTA i et så lite volum som mulig. </li><li> Pipetter tailbud stykker inn i mediet ibildebehandling fatet. Pipetter bitene opp og ned flere ganger for å bryte dem fra hverandre, og å suspendere cellene i mediet. Vær forsiktig med å innføre luftbobler. Sjekk for celle klumper under mikroskop og spre mer etter behov. </li><li> Tillat spredte celler i suspensjonen til å slå seg ned på Fibronectin1 belagt glass i 20 min ved RT. </li></ol></li><li> Til et lite volum av ytterligere L15 medium med serum til cellene før begynnelsen avbildning. Vær forsiktig for ikke å forstyrre oppgjorte celler. </li><li> Gitt den eksperimentelle spørsmål, legge noen supplerende eller medikamentelle behandlinger til kulturen. </li></ol> Tre. Imaging av dispergert PSM celler <ol><li> Sett opp bildebehandling fatet i temperatur kammer på time-lapse bildebehandling mikroskop. Sett Warner kammer til ønsket temperatur for forsøket. Tillat rett til stabilisering i minst 30 minutter før du begynner bildet oppkjøpet. Crosscheck temperatur med ekstern temperaturføler plassert i fatet, hvis nødvendig. MERK: På grunn avforholdet mellom temperatur og somitogenesen sats 21 stabil temperaturkontroll er nødvendig for nøyaktige målinger av perioden i enkelt PSM celler. </li><li> Innhente testbilder i fluorescens-kanalen for å kontrollere at den eksponeringstid og forsterkning gi et stort dynamisk område av intensiteter uten metning for å sikre godt signal til støynivåer. En typisk fluorescens bilde ervervet fra spredte celler generert fra våre linjer ved hjelp av denne protokollen krever 400 msek og 40 msek for en overført lys bilde med en EMCCD kamera opererer på en EM Gain av 85. I tillegg pre-amp gain og avlesning hastighet fra Kameraet er også avgjørende for å maksimere signalet over støy. </li><li> Bruke overført lys kanal, velger felt av celler for time-lapse oppkjøpet. </li><li> Kjør time-lapse oppkjøpet protokoll for ønsket tidsrom. <ol><li> Tilegne seg en overført lys og en fluorescens bilde per felt. MERK: Angi et intervall mellom oppkjøps rounds som vil fange time dynamikk uten foto-bleking over lengre bildebehandling eller indusere toksisitet i cellene. Denne protokollen bruker en 2 min intervaller. </li></ol></li><li> Sjekk time-lapse satt opp av og til under videoopptak for å sikre at cellene forblir i fokus, ingen programvare eller maskinvare feil, etc. </li></ol> 4. Bildebehandling of Ervervet Time-lapse filmer <ol><li> Åpen filmfil for en kjøpt felt i et bildebehandlingsprogram. MERK: Fiji ble brukt for all behandling i denne protokollen. <ol><li> Split overført lys og fluorescens rammer fra ett felt for å lage to stabler av bilder. </li></ol></li><li> Spor en enkelt celle i det overførte lys-kanal. <ol><li> Plasser en sirkulær ROI (region av interesse) rundt den valgte cellen i den første rammen i overført lys kanal. MERK:.. Kun celler som en er frisk på slutten av opptaket, gjør to ikke flytte utenfor feltet, og tre ikke kommer i kontakt med andre ce.lls spores. </li><li> Lagre en ROI med få rammer til ROI manager. Spor celle til siste ramme. </li></ol></li><li> Mål intensitet ved hjelp av lagrede ROIs på fluorescens-kanalen. <ol><li> Velg fluorescens stabel og med den lagrede ROIs, bruker tilpassede kretsen interpolator plug-in-og makro for å måle intensiteten av det beltedrevne celle over tid. </li><li> Sjekk utgangs spor fra makro. Hvis sporingen kvalitativt fanger funksjoner av fluorescens time-lapse, eksportere verdiene til et Excel-regneark. </li><li> Lagre ROI liste for cellen. </li></ol></li><li> Gjenta sporing i overført kanal og måling i fluorescens kanal for andre celler i felten. </li><li> Gjenta alle trinnene for ytterligere felt fra eksperimentet. </li></ol>

<ol>
	<li>Cooke, J., Zeeman, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clock+and+wavefront+model+for+control+of+the+number+of+repeated+structures+during+animal+morphogenesis.">A clock and wavefront model for control of the number of repeated structures during animal morphogenesis.</a> J Theor Biol. 58, 455-476 (1976).</li><li>Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+embryos+with+oscillations:+structure,+function+and+dynamics+of+the+vertebrate+segmentation+clock.">Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock.</a> Development. 139, 625-639 (2012).</li><li>Dequeant, M. L., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+patterning+of+the+vertebrate+embryonic+axis.">Segmental patterning of the vertebrate embryonic axis.</a> Nat Rev Genet. 9, 370-382 (2008).</li><li>Oates, A. C., Gorfinkiel, N., Gonzalez-Gaitan, M., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+in+developmental+biology.">Quantitative approaches in developmental biology.</a> Nat Rev Genet. 10, 517-530 (2009).</li><li>Oates, A. C., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy/E(spl)-related+(Her)+genes+are+central+components+of+the+segmentation+oscillator+and+display+redundancy+with+the+Delta/Notch+signaling+pathway+in+the+formation+of+anterior+segmental+boundaries+in+the+zebrafish.">Hairy/E(spl)-related (Her) genes are central components of the segmentation oscillator and display redundancy with the Delta/Notch signaling pathway in the formation of anterior segmental boundaries in the zebrafish.</a> Development. 129, 2929-2946 (2002).</li><li>Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+with+transcriptional+delay:+a+simple+mechanism+for+the+zebrafish+somitogenesis+oscillator.">Autoinhibition with transcriptional delay: a simple mechanism for the zebrafish somitogenesis oscillator.</a> Curr Biol. 13, 1398-1408 (2003).</li><li>Schroter, C., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment+Number+and+Axial+Identity+in+a+Segmentation+Clock+Period+Mutant.">Segment Number and Axial Identity in a Segmentation Clock Period Mutant.</a> Curr Biol. 20, 1254-1258 (2010).</li><li>Riedel-Kruse, I. H., Muller, C., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrony+dynamics+during+initiation,+failure,+and+rescue+of+the+segmentation+clock.">Synchrony dynamics during initiation, failure, and rescue of the segmentation clock.</a> Science. 317, 1911-1915 (2007).</li><li>Ozbudak, E. M., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+synchronizes+the+zebrafish+segmentation+clock+but+is+not+needed+to+create+somite+boundaries.">Notch signalling synchronizes the zebrafish segmentation clock but is not needed to create somite boundaries.</a> PLoS Genet. 4, e15 (2008).</li><li>Herrgen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+Coupling+Regulates+the+Period+of+the+Segmentation+Clock.">Intercellular Coupling Regulates the Period of the Segmentation Clock.</a> Curr Biol. 20, 1244-1253 (2010).</li><li>Sawada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf/MAPK+signalling+is+a+crucial+positional+cue+in+somite+boundary+formation.">Fgf/MAPK signalling is a crucial positional cue in somite boundary formation.</a> Development. 128, 4873-4880 (2001).</li><li>Giudicelli, F., Ozbudak, E. M., Wright, G. J., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+the+tempo+in+development:+an+investigation+of+the+zebrafish+somite+clock+mechanism.">Setting the tempo in development: an investigation of the zebrafish somite clock mechanism.</a> PLoS Biol. 5, e150 (2007).</li><li>Herrgen, L., Schroter, C., Bajard, L., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+embryo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+development.">Multiple embryo time-lapse imaging of zebrafish development.</a> Methods Mol Biol. 546, 243-254 (2009).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+expression+of+the+bHLH+factor+Hes1+regulated+by+a+negative+feedback+loop.">Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop.</a> Science. 298, 840-843 (2002).</li><li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact.">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int J Dev Biol. 49, 309-315 (2005).</li><li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+circadian+timing+in+mammals.">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li><li>Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+reporting+of+circadian-regulated+gene+expression+by+luciferase+imaging+in+plants+and+mammalian+cells.">Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells.</a> Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).</li><li>Soroldoni, D., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+transgenic+reporters+of+the+vertebrate+embryo's+Segmentation+Clock.">Live transgenic reporters of the vertebrate embryo's Segmentation Clock.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 600-605 (2011).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock:+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cells.">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1313-1318 (2006).</li><li>Soroldoni, D., Hogan, B. M., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+transgenesis+with+meganuclease+constructs+in+zebrafish.">Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in zebrafish.</a> Methods in molecular biology. 546, 117-130 (2009).</li><li>Schroter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237, 545-553 (2008).</li><li>Picker, A., Roellig, D., Pourquie, O., Oates, A. C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+micromanipulation+in+zebrafish+embryos.">Tissue micromanipulation in zebrafish embryos.</a> Methods in molecular biology. 546, 153-172 (2009).</li><li>Mould, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+integrin+beta1+homologs+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Identification of multiple integrin beta1 homologs in zebrafish (Danio rerio).</a> BMC Cell Biol. 7, 24 (2006).</li><li>Mould, A. P., Koper, E. J., Byron, A., Zahn, G., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+ligand-binding+pocket+of+integrin+alpha5beta1+using+a+gain-of-function+approach.">Mapping the ligand-binding pocket of integrin alpha5beta1 using a gain-of-function approach.</a> Biochem J. 424, 179-189 (2009).</li><li>Zhao, Q., Liu, X., Collodi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+fibronectin+in+zebrafish.">Identification and characterization of a novel fibronectin in zebrafish.</a> Exp Cell Res. 268, 211-219 (2001).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+The+zebrafish+book+:+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Brachydanio+rerio).">In The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio).</a> , (1993).</li><li>Vallone, D., Santoriello, C., Gondi, S. B., Foulkes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+protocols+for+zebrafish+cell+lines:+maintenance+and+transfection.">Basic protocols for zebrafish cell lines: maintenance and transfection.</a> Methods Mol Biol. 362, 429-441 (2007).</li><li>Carr, A. J., Whitmore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+single+light-responsive+clock+cells+reveals+fluctuating+free-running+periods.">Imaging of single light-responsive clock cells reveals fluctuating free-running periods.</a> Nat Cell Biol. 7, 319-321 (2005).</li><li>Whitmore, D., Foulkes, N. S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acts+directly+on+organs+and+cells+in+culture+to+set+the+vertebrate+circadian+clock.">Light acts directly on organs and cells in culture to set the vertebrate circadian clock.</a> Nature. 404, 87-91 (2000).</li><li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation.">A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, 222-225 (1126).</li></ol>

Forfatter bidrag: ABW utviklet og raffinert sprednings, kultur, bildebehandling, og celle sporing protokoller. DS generert de transgene linjer og ledet utformingen av time-lapse fluorescens mikroskop som brukes i denne protokollen. AO pioner første proof-of-prinsippet eksperimenter for å distansere og bilde PSM celler i kultur. JS skrev sirkelen interpolator plugin verktøy i Fiji brukes til å måle fluorescens intensitet fra time-lapse filmer. ABW og ACO skrev manuskriptet.

Å studere en cellulær prosess som foregår i løpet av embryoutvikling, biologer vanligvis benytter en tilnærming i sammenheng med hele embryo. Imidlertid, for å forstå hvordan en enkelt celle opptrer innenfor en utviklingsmessig tidsrom, er en metode for å undersøke og forstyrre individuelle celler isolert også svært fordelaktig. Ved å generere spredt PSM cellekulturer ved hjelp av transgene sebrafisk embryo vi nå har et verktøy til direkte studere cellen autonome natur genetiske svingninger i segmentering klokke på en kvantitativ måte. Det er mulig å måle dynamikken i svingninger i vårt fluorescerende reporter i hundrevis av celler under en rekke ulike forhold. Den observerte for enkeltceller i kultur er lengre enn somitogenesen periode i intakt embryo. Vi observerer at en intakt PSM reoperasjonen kultur viser også langsommere svingninger enn intakt embryo (data ikke vist), noe som tyder på that lengre periode observert i isolerte celler er ikke bare på grunn av skade fra spredning. En variabel periode og amplitude er observert i de fleste av våre encellede tidsserier. Kilden til denne variasjonen er ukjent, men skal avsløre viktige detaljer om segmentering klokke tempo for å lage kretser. Med denne metoden kan vi studere den genetiske komponenter av segmentering på cellenivå, og adresse spørsmål som er utfordrende å undersøke i hele embryo. For eksempel, ved kontrollert tilsetning av kjente signalmolekyler som finnes i utvikling av embryo i våre kulturer, kan vi undersøke deres effekter på enkel PSM cellulære oscillator i en robust og reproduserbar assay. Vår PSM kultur systemet åpner døren til en grundig vurdering av hvilke faktorer, alene, eller i kombinasjon fremme svingninger i disse cellene, hvilke faktorer som hemmer disse svingninger, og for å teste samspillet mellom slike molekyler. Med disse verktøyene i hånden, har vi som mål åevaluere eksisterende modeller av somitogenesen som er basert på publiserte vev-nivå data, samt bruk resultater i enkeltceller til å generere prediksjoner som kan testes i hele embryo. Så vidt vi vet, er dette den første sebrafisk primære cellekultur protokoll for akutt time-lapse opptak av fluorescens i enkeltceller; videreutvikling og foredling av denne protokollen er ingen tvil om det er mulig. Andre protokoller ofte bruker sebrafisk embryo til å generere stabile cellelinjer som kan transfektert med journalister og brukes for langsiktig bildebehandling 27-29. Mens stabile linjer er nyttig for avbilding av en prosess som ikke er knyttet til utvikling timing, slik som den biologiske klokke, spørsmålet om embryonale segmentering nødvendiggjør øyeblikkelig avbildning, mens cellene fremdeles er i sin oscillasjon, progenitor tilstand. Når cellene stopper oscillerende, antar de en differensiert celle skjebne, og da i vevet, vil bli innarbeidet i en somitt. Det er possible at med riktig faktor eller faktorer til stede in vitro kan vi generere PSM-som sebrafisk cellekultur linjer som ville forbli oscillasjon, slik at vesentlig mer langsiktige observasjoner, flere sekvensielle forstyrrelser, eller high-throughput screening. Vi forventer at denne metoden for å forberede primærkulturer av dispergert celler for time-lapse imaging er godt egnet for studiet av enhver cellulær prosess som skjer i løpet av en utviklings tidsramme som ikke er imøtekommende ved hjelp av stabile sebrafisk cellelinjer. Isolasjon av forskjellige celletyper på forskjellige utviklingsstadier fra de aktuelle transgene reporter linjer, enten via disseksjon eller via FACS etter embryonale dissosiasjon, kunne gi start celler. Noen optimalisering av oppdrettsbetingelser, guidet av embryonale opprinnelse av cellene, kan være nødvendig. Ved å kombinere denne fleksible og sensitive protokoll med den raskt voksende samling av transgen sebrafisklinjer, håper vi å legge til rette for en in vitro utviklingsbiologi tilnærming som er komplementær til klassiske genetiske og embryologiske metoder.

Den periodiske dannelsen av segmenter langs virveldyr kroppen aksen, eller somitogenesen, er bevis for en romlig og tidsmessig oscillator i utvikling av embryo. Den foretrukne mekanisme for å kontrollere somitogenesen er konseptuelt beskrevet av en &quot;klokke og bølgefront&quot;-modellen 1, karakterisert ved at den &quot;klokken&quot; som består av cellulære oscillatorer, som nå er antatt å være intracellulært drevet av den rytmiske ekspresjon av et sett av cykliske gener 2, flått av dannelsen av somites fra presomitic mesoderm (PSM). Som fosteret utvikler seg, flytter en modning &quot;bølgefront&quot; i PSM på konsert med tilbakegang vev mot bakre, bremse og arrestere cellulære oscillatorer når den passerer tre. Sammen er dette spatiotemporally dynamisk system kalt segmentering klokke. Dagens tilnærminger til å studere segmentering klokke span tre økende nivåer av organisasjonen fra den genetiske oscillator i enkeltceller til lokale koblings thved oppstår mellom celler og til slutt til global regulering av posisjonsinformasjon i den kollektive PSM vev fire. Tidligere studier antyder den cellestyrte oscillator segmentering i sebrafisk består av gener og proteiner produkt fra hennes / hes transkripsjon factorfamily, som er tenkt å danne en negativ feedback-sløyfe transcriptional undertrykkelse 5-7. The Delta / Notch signalveien synkroniserer svingninger mellom naboceller og regulerer den kollektive periode av befolkningen 8-10. FGF signalmolekyler som produseres i tailbud ser ut til å bygge en gradient over sebrafisk PSM, og er dermed antatt å bidra til å bremse og arrestere oscillerende celler i fremre 11. Til nå har de funksjonelle rollene til hver av disse molekylene i somitogenesen blitt undersøkt av genetisk mutasjon, morfolinogruppe injeksjon, varme-sjokk over-uttrykk, og antagonist narkotika treatment av klokke komponenter og signalering mellom celler 5,7,10,12. Ved hjelp av disse forstyrrelsene, har segmentering klokkefunksjonen blitt utledes fra vev-nivå beskrivelser av somitt feil og tap av ensartede svingninger i uttrykket av sykliske gener som HER1, her7, og delta C. Men nesten alle av disse dataene er fra faste embryoer og ikke klarer å nøyaktig fange opp endringer som er iboende til dynamisk funksjon av segmentering klokke. Flere nylig, har flere embryo time-lapse bildebehandling avslørte første mutanter med endret oscillator periode, men disse observasjonene ble også gjort på vevet nivå 7,13. Dermed har oppførselen til hypotesen celle-autonom oscillator under somitogenesen ikke blitt observert. Statiske øyeblikksbilder av somitogenesen gi et ufullstendig bilde, fordi, i seg selv, er prosessen drives av en oscillerende system. Tidligere arbeid i mus og chick celler viste at nivåene av transkripsjonog protein vekst og fall, men prøvetaking en ca 2 timers pendling hver 30 eller 45 min nødvendigvis begrenser de innsamlede dataene og dermed de konklusjoner som kan trekkes 14,15. Studier av andre biologiske oscillatorer, spesielt, biologiske klokka, har beveget seg bort fra iscenesatte målinger av gen-og proteinuttrykk til sanntid overvåking ved hjelp av fluoriserende og selvlysende journalister 16,17. Disse verktøyene er avgjørende for å demonstrere klokke egenskaper av enkeltceller 18. En bioluminescent reporter på Hes1 syklisk genet har blitt utviklet og kort karakteriseres i enkle muse PSM celler 19. Den gjennomsnittlige for-og varians ble beregnet for et lite antall celler, hvilket viser at svingninger vedvare i flere sykluser in vitro. Men disse studiene ikke kvantitativt adressere stabilitet og robusthet av oscillator frekvens og amplitude, om cellene kan spontant gå inn eller ut svingninger,og hvordan cellene opprettholde sine faseforhold. I tillegg er effekten av signalmolekyler som finnes i embryo på den cellestyrte klokke er ikke blitt testet direkte. Følgelig er disse fundamentale egenskaper ved enkeltcelle oscillator forblir fullstendig ukjent. Vi har nylig utviklet transgene fisk linjer ved hjelp av BAC recombineering 20 å kjøre Venus (YFP) fluorescens reportere av HER1 uttrykk 30. Slike linjer utnytte de regulatoriske signaler i intakt kromosom locus der de er innebygd og rekapitulere de timelige dynamikk og romlig mønster av HER1. Dette gjennombruddet åpner for sanntidsovervåking av genuttrykk i utviklingssebrafisk embryo in vivo. Å studere de grunnleggende egenskapene til celle-autonome svingninger og hvordan slike uttrykk er regulert over tid, vi nylig utviklet en pålitelig metode for å isolere og ta opp fra PSM celler in vitro. Dette protocol beskriver hvordan vi har benyttet våre transgene reporter linjer for å generere spredte cellekulturer, som vi kan karakterisere svingninger av sebrafisk segmentering klokken i enkeltceller. Vi kan dermed takle utestående spørsmål i feltet som ikke var tilgjengelig med statisk eller vev-nivå analyse, samt direkte manipulere segmentering klokke på celle-nivå med signalmolekyler og hemmere.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX16</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>X-cite Illumination</td>
 <td>Series: 120Q</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps no. 55</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11295-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass transfer pipettes</td>
 <td>Assistent</td>
 <td>567/2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>627102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>628102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard polymer</td>
 <td>SASCO</td>
 <td>266727</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manipulation tools</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>For description of manipulation tools Ref. 22</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsurgical knife</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>500249</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L15 medium</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>57322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/streptomyocin</td>
 <td>PAA</td>
 <td>P11-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>257322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.05% trypsin / 0.02% EDTA</td>
 <td>PAA </td>
 <td>L11-004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gel loading tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>253188</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>254589</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette set</td>
 <td>Gilson International</td>
 <td>F167300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment</td>
 <td>MPI-CBG protein facility</td>
 <td></td>
 <td>Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Mattek (single well)</td>
 <td>P35G-1.5-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Greiner (CellView -multi-well)</td>
 <td>262502</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E3 medium without methylene blue</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic transfer pipettes</td>
 <td>Ratiolab</td>
 <td>260011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warner heating/cooling chamber</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>TC-324B/344B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor</td>
 <td>Model: iXOn 888</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Model: Axiovert 200M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td>NeoFluor 40x, NA 0.75</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Lumencor Light Engine</td>
 <td>Model: Spectra X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>BrightLine HC 575/15</td>
 <td>F39-575</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of dispersed presomitic mesoderm cell cultures for imaging of the zebrafish segmentation clock in single cells

Segmentering er en periodisk og sekvensiell morfogenetiske prosess i virveldyr. Dette rytmisk dannelsen av blokker av vev kalt somites langs kroppen aksen er bevis for en genetisk oscillator mønster utvikling av embryo. I sebrafisk, er den intracellulære klokke kjører segmentering består av medlemmer av hennes / Hes transkripsjonsfaktor familie organisert i negativ feedback loops. Vi har nylig generert transgene fluorescerende reporter linjer for den sykliske genet HER1 som rekapitulere den spatio-temporalt mønster av svingninger i presomitic mesoderm (PSM). Ved hjelp av disse linjene, har vi utviklet en in vitro kultur system som tillater sanntids analyse av segmentering klokke svingninger innenfor enkelt, isolerte PSM celler. Ved å fjerne PSM vev fra transgene embryoer og deretter spre celler fra oscillerende regioner på glassbunn retter, genererte vi kulturer som passer for time-lapse avbildning av fluorescens signal fraindividuelle klokke celler. Denne tilnærmingen gir en eksperimentell og konseptuelt rammeverk for direkte manipulasjon av segmentering klokke med enestående encellede oppløsning, slik at dets celle-autonom og vev-nivå egenskapene som skal skilles og dissekert.

Denne protokollen produserer kulturer av levedyktige, spredt, single PSM celler for time-lapse avbildning av fluorescens signal (figur 2). Vår transgenet genererer en reporter som syklus for produksjon og nedbrytning inntreffer med tilsvarende dynamikk til det endogene genet og proteinet i embryo, av størrelsesorden en halv time. På grunn av sin raske omsetningen, bør YFP signal i enkeltceller kan oppdages raskt for å minimere bleking og med en høy tidsoppløsning for å fange opp de funksjonene i hvert oscillasjon syklus. Også, gitt den relative dimness av signalet, kultur-og oppkjøps forholdene har blitt nøye avstemt for å sikre sensitive og robuste resultater. Vi har funnet følgende faktorer å være viktig i å generere optimal PSM cellekulturer for bildebehandling:. En An ECM substrat brukes til å belegge med glassbunn kultur retter. 2. Tilsetting av serum til disseksjon og bildebehandling medium. Tre. Disseksjon av PSM fra identifiserte embryoer tatt etter parring HETErozygous parene, hvis avkom potensielt bære to kopier av transgenet. 4. Bilde oppkjøp innenfor en optimal forstørrelsesområde, ved hjelp av en høyere NA mål å sørge for effektiv fangst av fluorescens signalet. 5. Belysning med en solid-state lyskilde for å minimalisere intensitetsvariasjoner som kan bidra til bakgrunnsstøy. 6. Signal deteksjon med en svært følsom EM-CCD-kamera for å maksimere signal avlesning. Sub-optimale kulturer vil inneholde celler som ikke forblir avrundet og sunt gjennom hele opptaket. Vi antok at våre ECM underlaget, et fragment av sebrafisk fibronectin1 holder cellene i en udifferensiert PSM-lignende tilstand, i forhold til andre brukte underlag som poly-lysin eller laminin. Andre substrater vi testet forårsaket celler til å flate på glasset og tap av oscillerende fluorescerende signal i løpet av opptaket. Vi har også funnet at tilsetning av serum til mediet ved disseksjon, spredning,og opptaket var ikke bare viktig å slukke trypsin brukes for dissosiasjon, men også økt fluorescens intensitet over bakgrunnen, sannsynligvis på grunn av forbedret cellelevedyktighet. For å sikre optimal signal fangst fra enkeltceller vi brukte et 40x objektiv spesielt utviklet for fluorescens imaging (Zeiss Plan NeoFluor serien) med en høy NA. Vi fant også at en solid-state lyskilde gitt mer stabil belysning enn tradisjonelle kvikksølv lamper, som er avgjørende for å minimere bakgrunns svingninger som bidrar til støyende bilder. Disse modifikasjonene er viktig for å sikre gode resultater. Ved hjelp av denne protokollen vi forventer kulturer der de fleste av cellene i et gitt felt er fluoriserende på et tidspunkt i løpet av innspillingen. Vi finner at fluorescerende celler vanligvis forbli avrundet og er noen ganger ganske bevegelige under opptak. Noen få celler, inkludert fluorescerende celler, kan bli apoptotisk under opptaket. Disse celler er ekskludert fra en hvilken som helst ennalysis. Vi utelukker celler som kommer i kontakt med andre celler, eller bevege seg utenfor synsfeltet. I gjennomsnitt, ser vi en 12% reduksjon av celleantallet i hvert felt på slutten av den 10 timers opptaket målt ved å telle antallet av sunne celler i det overførte lys-kanal. Dette tapet omfatter både celledød og celler som har beveget seg ut av feltet. Gitt disse begrensningene vi kan, i gjennomsnitt, spor 5 fluorescerende celler per felt som forblir levedyktig og synlig, og typisk spille seks felt per tilstand. For eksempel vil et eksperiment med fire forholdene har 24 totalt felt kjøpt og vanligvis omtrent 30 belte celler per tilstand. Under standard bildeforhold med L15 medium som inneholder 10% føtalt bovint serum, finner vi at PSM celler (n = 101 celler fra fire eksperimentelle gjentak) kan produsere mellom 2 og 7 topper, med gjennomsnitt og standardavvik på 3 ± 1 toppene (2 -3 sykluser). Median peak nummer, så vel som den 25% persentil, er to topper og en 75% persentil is tre topper. Ved å bruke vår semi-automatisk sporing og analyser kan en raskt generere fluorescens intensitet over tid spor for de enkelte PSM-celler, med en representativ celle spor vist i figur 2C. Disse rå-spor kan deretter brukes til å gjøre kvantitative målinger av egenskaper for de oscillerende PSM-celler, slik som frekvens, amplitude, antall sykluser, og tidspunktet for toppene. <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1.jpg" /> Figur 1. Identifikasjon av transgene embryoer og skjematisk av deres disseksjon. (A) Lateral syn på en transgen sebrafisk embryo uttrykker YFP fluorescens ved ~ 5-somitt scenen. Bildet er en overlapping av overført lys og fluorescens kanal. Pilene angir områder for signal starter på tuppen av tailbud, hele PSM, mot l<html> ast dannet somitt. Inset viser en skjematisk av reporter transgenet (for mer informasjon om sin utvikling og in vivo atferd refererer til Soroldoni et al. 30. (B) Skjematisk av lateral utsikt embryo før første kuttet under disseksjon. Prikket røde linjen viser den første kuttet gjøres på tvers av hindbrain, men plommen celle like bak tailbud. (C) Skjematisk oversikt over flat PSM etter fjerning av plomme granulat og epidermal lag, orientert langs anterior-posterior aksen. Prikket røde linjen viser andre kutt for å fjerne spissen av tailbud for spredning og kultur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 07fig2.jpg &quot;/&gt; Figur 2. Representative bilder og spor fra en enkelt celle i et spredt PSM kultur. (A) Montasje overført lyse bilder av en enkelt PSM celle i en 6-timers med intervallopptak. Legg merke til at cellen forblir avrundet og friske gjennom hele løpet av opptaket. (B) Tilsvarende montasje av fluorescens bilder fra en enkelt celle PSM. Toppene i intensiteten av cellen er nummerert i løpet av opptaket. (C) Gjennomsnittlig intensitet over tid måles fra en ROI plassert på denne cellen. Verdiene er hentet fra hver ramme fra en film med en bildefrekvens på én per 2 min hjelp sirkelen interpolator plug-in og tilpasset makro skrevet i Fiji. Toppene i intensitet er igjen nummerert gjennom hele sporet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig2highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells at JoVE.com

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Somitogenesen er en rytmisk utviklingsprosess som romlig mønstre kroppen aksen av virveldyr embryoer. Tidligere har vi utviklet transgene sebrafisk linjer som bruker fluorescerende reportere å observere de sykliske gener som driver denne prosessen. Her, vi kultur spredt celler fra disse linjene og bilde sine Svingninger over tid i vitro.

Generering av dispergert Presomitic mesoderm cellekulturer for Imaging av sebrafisk Segmentering Klokke i enkeltceller

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo electroporation av Morpholinos til Adult sebrafisk Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo electroporation av Morpholinos i Regenerating Adult sebrafisk Halefinner

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon Mus Utledet fra Utførte pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Overvåking Cell-autonome biologiske klokke Rhythms of Gene Expression Bruke luciferase Bioluminescens Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Leve Imaging av apoptotiske Cell Lagersalg under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelig indusert pluripotent stamceller fra menneskelige somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nyreskade Mikroinjeksjon i Sebrafisk til Model Akutt nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...