Name: laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury
Uploaded: 2013-04-10T12:00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury at JoVE.com

Dette arbejde er finansieret af R01 NS052532 (til HLH), den Moody Foundation, og Institut for Anesthesiology. Vi takker Laurie Bolding, Christine Courteau Butler og Christy Perry for deres redaktionelle assistance, og Christy Perry til layout og fremragende produktion af alle figurer, tabeller og illustrationer.

1. Kirurgiske procedurer og Fluid percussion TBI <ol><li> Alle dyreforsøg først godkendes af Institutional Animal Care og brug Udvalg University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas og National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr (8. udgave, National Research Council). </li><li> Rotter (voksne Sprague-Dawley-hanrotter, 400-500 g opnået fra leverandøren Charles Rivers, Portland, Maine) har huset to pr bur og forsynedes med foder og vand ad libitum i et vivarium med disse konstante betingelser: lys cyklus (600 timer til 1.800 time), temperatur (21 ° C til 23 ° C) og fugtighed (40% til 50%) en uge forud for anvendelse. </li><li> Bedøve rotter med 4% isofluran, intubere og mekanisk ventilere (Nemi Scientific; New England Medical Instruments, Medway, MA) rotterne med 1,5-2,0% isofluran i oxygen: luft (70:30) og forberede dem til parasagittal fluidperkussion skade, som tidligere beskrevet. 8, 10 </li><li> Sacrifice rotter på et passende tidspunkt efter skade afhængigt af den eksperimentelle design. Hurtigt fjerne hjerner, fryse straks på tøris, og opbevar ved -80 ° C i et 50 ml rør eller gå straks at integrere i OLT frosset sektionering. </li></ol> 2. Sektionering og farvning af rottehjerne <ol><li> Hjernevæv, der ikke anvendes straks kan opbevares ved -80 ° C i op til en måned, hvis holdes ved en konstant temperatur. Hjerner, der er frosset ved -80 ° C, derefter optøet til -20 ° C til sektionering og derefter fryses igen giver ikke kvalitet RNA efter den anden optøning. Når hjernen er optøet, monteret i OCT og i snit, bør objektglassene farves i 24 timer og anvendt til LCM inden for 30 minutter til en times farvning. Dette vil sikre god kvalitet RNA. Efter LCM kan indfangede celler på LCM caps lagres i lysepuffer ved -80 ° C i op til en uge, men RNA bør isoleres i en rettidigt for at sikre den højeste kvalitet. &lt;/ Li&gt; <li> Forud for sektionering hjernen, tørre kryostaten med RNase-Zap og rense pensler med ETOH (erstat den disponible klinge mellem hver hjernen). </li><li> Hente hjernen i 50 ml røret fra -80 ° C fryser, lægge den i kryostaten ved en temperatur på -22 ° C og optøning i røret i ca 10 minutter. Fjern hjerne fra røret og anbringes på scenen på gaze, ventrale side op. </li><li> Anvendelse af et barberblad, hjernen skive at fjerne den bageste del af hjernen lige rostralt for cerebellum og den forreste del på den optiske chiasm. Fyld en kryoformen med OCT montering medium (Tissue Tek), og placer hjernen ind i formen med den forreste side nedad. Tillade hjernevæv at fryse i monteringsmedium, indtil den bliver hvid (ca. 10 min). </li><li> Frys prøven disk (Tissue Tek) på hjernen med oktober Fjern hjerne fra formen. Sæt hjernen i prøven hovedet og spænd skruerne. </li><li> Indsæt en disposaligt, lav profil klinge (Fisher Scientific) i knivholder og stram håndtaget ned. </li><li> Begynder udskæring hjernen ved 20 um for at fjerne det yderste lag af Oktober Når den hippocampale region er nået, skal du indstille micron drejeknappen til 10. Collect koronale seriesnit ved at placere et objektglas og plus-objektglas på vævssnittet (Fisher Scientific). Slides bevares ved -20 ° C i et RNase-frit farvning rack indtil skæring er fuldført. </li><li> For at fjerne alle RNaser fra glasvarer hvor vævssnit behandles, tørre ned alle farvning containere og dimitterede cylindre med Eliminase (Fisher Scientific) og skylles i Milli Q-vand. Forberede alle opløsninger med RNase-frit vand og filtrere cresylviolet (Sigma-Aldrich) og Fluoro-Jade (Histo-chem) farvning med et 0,2 um filter før brug. </li><li> Tø hjernesnit ved stuetemperatur i 30 sekunder og løse i 75% EtOH (1 min). </li><li> For LCM af enkelte beskadigede neuroner efter fiksering, skylles objektglassene i RNase-frit vand (1 min), Kontrastfarve med 1% cresylviolet (15-20 sek), skylles i RNase-frit vand (2 x 30 sek), farves med Fluoro-Jade (4 min), skylles i RNase-frit vand (3 x 1 min), dehydratisere med 95% ETOH fremstillet af RNase-frit vand (30 sek), 100% EtOH (30 sek), og xylen (2 x 3 min). </li><li> For LCM af skår af neuroner efter fiksering, objektglassene skylles i RNase-frit vand (1 min), farves med 1% cresylviolet (1 min), skylles i RNase-frit vand til (3 x 1 min), tørrer med 95% EtOH (2 x 30 sec), 100% EtOH (2 x 30 sek), og xylen (2 x 3 min). </li><li> Air tørre alle sektioner i et stinkskab i 15 min før LCM. Slides kan gemmes, § sider op, i et dias kasse foret med tørremiddel, hvis de har brug for at blive overført fra rum til rum. Imidlertid optimale resultater opnås, hvis LCM udføres umiddelbart efter sektioner er tørre. LCM bør begrænses fra 30 minutter til 1 time. I det næste afsnit beskriver vi først, hvordan man fange kontinuerlige skår af celler, som er easiest at mestre for dem, der er ved at lære denne teknik. Så vi beskrive, hvordan man præcist indfange enkelte neuroner. I vores procedure, identificerer vi døende neuroner ved deres affinitet for Fluor-Jade-en markør for degenererende neuroner. Fluor-Jade-negative celler antages at være overlevende neuroner. </li></ol> 3. Laser Capture mikrodissektion (LCM) LCM af skår af beriget populationer af hippocampus neuroner <ol><li> LCM udføres under anvendelse af en PixCell IIe mikroskop med en infrarød diodelaser (Life Technologies). </li><li> Juster midten joysticket til lodret position. Drej og lås 4X mål på plads. </li><li> Placere et objektglas på midten af ​​mikroskopbordet og manuelt justere indtil området i hippocampus er i betragtning. Brug grove og fine fokus justeringer for at bringe billedet i fokus. </li><li> Aktiver vakuum borepatronen ved at trykke på vakuum-knappen på controlleren. Drej og lås 10X mål til place. Fokus igen med grove og fine justeringer. </li><li> Indlæse CapSure Macro LCM hætter (Life Technologies) ind i CapSure kassettemodulet, og placere en hætte på belastningslinien position. Drej Cap Placement arm og position omkring hætten. Hæv Cap Placement arm for at fjerne CapSure hætte fra kassetten modulet. </li><li> Drej Cap Placement arm over slæden og sænke armen ned over slide, hvilket vil placere hætten på diaset. Juster fine fokus og bevæge joysticket til at kontrollere, om cellerne er inde i det sorte cirkel på hætten. Alle celle fanger bør være inde i denne sorte cirkel. </li><li> Indstil laserparametre. Tryk først på laser-aktivere knappen på controlleren. Laseren målet stedet vil være synlig som et lyserødt prik i synsfeltet på computerskærmen. </li><li> Indstil laserpunktet størrelse til mindre (7,5 um) for at fokusere laseren og justere effekten og varigheden til 65 til 75 mW, for 1,0 til 2,0 msek efter behov for optimal celleindfangning. </li><li> Til test laseren, skal du bruge joysticket til at flytte laseren stedet til et område, hvor der ikke er nogen celler at samle op. Affyre laseren med tommelfingeren knappen. Brug joysticket til at flytte laseren plet væk fra den smeltede polymer stedet og kontrollere, om en synlig mørk ring omgiver en klar område, hvor laseren blev fyret. </li><li> At fange celler, skal du bruge joysticket til at flytte laseren plet over det område af celler til fange. Affyre laseren med tommelfingeren knappen. Bevæg joysticket, mens fyring laseren til at indfange et stort område af celler. Når laseren brændes den smelter det termoplastiske polymerfilm på hætten til overfladen af ​​målcellerne. Polymeren absorberer laserstrålingen og således ikke ændring af RNA, DNA eller proteiner sikre integriteten af ​​prøven for fremtidige molekylære anvendelser. </li><li> Efter brænding alle celler af interesse, løfte Cap Placement arm. De opfangede celler vil separere fra vævssnittet og klæber til CapSure cap. Det resterende væv og manglende celler bliver overenelig i synsfeltet. Cellerne på hætten kan også ses ved at placere hætten på en tom del af præparatglasset. </li><li> Løft Cap Placement arm og drej det til den Cap Unload Station. Sænk hætten ind i stationen og drej Cap Placement arm tilbage til sin tidligere stilling. </li><li> Skub CapSure indføringsværktøj langs perronen og ned på hætten. Løft værktøjet fra platformen. Hætten vil forblive fastgjort. Lige rører hætten på den CapSure ren pad til at rense væk uønsket væv. </li><li> Anbring hætten i en 0,5 ml RNase-fri rør fyldt med 100 ul lysepuffer opnået fra RNAqueous Micro-Isolation Kit. Umiddelbart vortex hætten i 30 sekunder for at lysere cellerne. Inkuberes prøverne ved 42 ° C i 30 minutter og fryse ved -80 ° C indtil RNA-isolering. </li></ol> LCM af enkelte FJ + neuroner i hippocampus <ol start="15"><li> At fange enkelt celler, indlæse CapSure HS LCM hætter i CapSure kassette modul og posipå et loft på belastningslinien position. Drej Cap Placement arm og placer det rundt hætten. Hæv Cap Placement arm for at fjerne CapSure hætte fra kassetten modulet. </li><li> Indstil laserpunktet størrelse til mindre (7,5 um) for at fokusere laseren og justere lasereffekten og varigheden til 65 -75 mW til 0,45 til 0,50 msek for optimal celleindfangning af enkeltceller. </li><li> Drej Cap Placement arm over slæden og sænke armen ned mod slæden. Dette vil placere hætten på diaset. Den Capsure HS cap overflade sidder ophøjet fra prøven under LCM. </li><li> Brug joysticket til at flytte laseren over enkelte FJ +-celler. Alle celler bliver fanget skal være inde den lille sorte ring på hætten. Affyre laseren med tommelfingeren knappen. </li><li> Når alle celler i den sorte cirkel området er blevet fyret med laseren, skal du løfte Cap Placement arm. De indfangede celler vil adskille fra vævssnittet og overholde CapSure HS cap. </li><li> Placer et andet dias på mikroerklare scene og indsamle FJ +-celler, indtil HS cap er fuld. Anbring hætten i en 0,5 ml RNase-fri rør fyldt med 40-50 pi lysisbuffer. Umiddelbart vortex hætten i 30 sekunder for at lysere cellerne. Inkuberes prøverne ved 42 ° C i 30 minutter og fryse ved -80 ° C indtil RNA-isolering. </li></ol> 4. Total RNA Isolering fra LCM Samples (Dette afsnit vil bare blive beskrevet i videopræsentationen) <ol><li> Totalt RNA fra celler isoleres ved hjælp af RNAqueous-Micro Kit (Ambion) ifølge producentens protokoller. Alle reagenser og vaskeopløsninger findes i dette kit. Pre-wet mikrofilteret patronsamlingen ved tilsætning af 30 fil af lyseopløsning puffer til filteret. Efter 5 minutter, centrifugeres filteret i 30 sekunder ved 10.000 × g. </li><li> Tilsæt 3 pi af LCM additiv til prøven lysat, til pipetten blandes og centrifugeres. </li><li> Tilsættes 52 pi 100% EtOH (1/2 volumen) til prøven lysat, pipette at blande, og overføre lysatet til filteretkolonne. </li><li> Centrifuger filteret kolonnen ved 10.000 x g i 1 min at binde RNA til søjlen. Hvis der er flere hætter til én prøve, dreje hvert lysat gennem den samme kolonne separat. </li><li> Fuldføre RNA isolation procedure som beskrevet i RNAqueous Micro kit. </li><li> Udfør DNase-behandling og DNase inaktivering af LCM RNA-prøver som beskrevet i kittet, overføre RNA til et RNase-frit rør og opbevares ved -80 ° C. </li></ol> 5. RNA Kvantificering og senere applikationer Vurdering af RNA-kvalitet og kvantificering udføres med en Agilent Bioanalyzer anvendelse af reagenser fra Pico Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ved at følge fabrikantens protokol. <ol><li> Totalt RNA analyseres på en Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Den software evaluerer koncentration og integritet af RNA-prøve ved at tildele et RNA Integrity Number (RIN) til hver prøve spænder from 1 til 10. 1-5 viser nedbrudt RNA og 7-10 viser god kvalitet RNA. </li><li> Ikke-nedbrudte intakt RNA vil blive anvendt til Real-Time PCR, individuelle TaqMan assays eller RT2 profiler arrays med SYBR-grøn kemi. RNA kan også anvendes til mRNA microarray analyse og microRNA microarray analyse. </li></ol>

<ol>
	<li>Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medial+temporal+lobe.">The medial temporal lobe.</a> Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).</li><li>Bast, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+integrative+perspective+on+hippocampal+function:+from+the+rapid+encoding+of+experience+to+adaptive+behavior.">Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior.</a> Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).</li><li>Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+networks+to+brain+networks.">From gene networks to brain networks.</a> Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).</li><li>Schouten, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+in+traumatic+brain+injury:+a+complex+struggle+against+the+biology+of+nature.">Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature.</a> Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).</li><li>Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade:+a+novel+fluorochrome+for+the+sensitive+and+reliable+histochemical+localization+of+neuronal+degeneration.">Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration.</a> Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).</li><li>Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade+and+silver+methods:+application+to+the+neuropathology+of+scrapie,+a+transmissible+spongiform+encephalopathy.">Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain:+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression.">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).</li><li>Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Fluid+Percussion:+Model+of+Traumatic+Brain+Injury+in+Mice.">Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice.</a> J. Vis. Exp. (54), e3063 (2011).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+long-term+gene+expression+in+neurons+of+the+hippocampal+subfields+following+traumatic+brain+injury+in+rats.">Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats.</a> Neuroscience. 131 (1), 87-97 (2005).</li><li>Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+correlates+of+age-specific+responses+to+traumatic+brain+injury+in+mice.">Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice.</a> Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).</li><li>Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+hypotension+suppress+neuroprotective+gene+expression+in+injured+hippocampal+neurons.">Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons.</a> Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).</li><li>Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stochastic+gene+expression+on+the+cell+survival+rheostat+after+traumatic+brain+injury.">Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury.</a> PLoS One. 6 (8), e2311 (2011).</li><li>Elstner, M., Morris, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+dopaminergic+neurons+in+Parkinson's+disease+and+aging+links+transcriptional+dysregulation+of+energy+metabolism+to+cell+death.">Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death.</a> Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).</li><li>Chen, H., Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Profiling+of+Nucleus+Accumbens+Neurons+Projecting+to+Ventral+Pallidum+Using+both+Microarray+and+Transcriptome+Sequencing.">Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing.</a> Front. Neurosci. 5, 98 (2011).</li><li>Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li><li>Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons,+numbers+and+the+hippocampal+network.">Neurons, numbers and the hippocampal network.</a> Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).</li><li>Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+long-term+treatment+with+L-deprenyl+on+the+age-dependent+microanatomical+changes+in+the+rat+hippocampus.">Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus.</a> Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).</li><li>Schmued, L. C., Hopkins, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade:+novel+fluorochromes+for+detecting+toxicant-induced+neuronal+degeneration.">Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration.</a> Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).</li><li>Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+use+of+laser+capture+microdissection+to+selectively+obtain+distinct+populations+of+cells+for+proteomic+analysis--+preliminary+findings.">The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis-- preliminary findings.</a> Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).</li><li>Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunostained+frozen+sections+for+mRNA+analysis.">Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis.</a> Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Denne LCM teknik har gjort det muligt for os at gøre betydelige fremskridt i forståelsen af de molekylære mekanismer i TBI. 8,10,11,12,13 Vi var de første forskere til at udnytte denne teknik til at vise, at forskellige subregioner af rotte hippocampus har genekspressionsprofiler at korrelerer med deres selektive sårbarhed over for skader. Vore undersøgelser viste, at vi kunne kvantificere genekspression ved qPCR, fra så få som 10 laser opfangede celler, og at vi kunne udføre genomet hele microarray analyse fra så få som 600 opfangede celler. LCM ville være et værdifuldt værktøj i lignende undersøgelser i andre områder af hjernen, der vides at være impliceret i forskellige neurologiske og neuropsykiatriske lidelser. For eksempel har undersøgelser med LCM belyse i patogenesen af Parkinsons sygdom i dopaminerge neuroner i substantia nigra, 14 og hjulpet genom-dækkende profilering undersøgelser af nucleus accumbens, der er involveret i belønning kredsløb impliceret i substance misbrug lidelser. 15 Neuronal heterogenitet der reflekteres fra genomplan 16 og kan bidrage til den manglende succes af eksperimentelle behandlinger for TBI i kliniske forsøg. Således er vores mål er at udnytte denne teknik til at undersøge de kritiske elementer påvirker neuronal overlevelse efter TBI. Vores nylige genomet hele profilering undersøgelse for at dø og tilstødende overlevende hippocampale neuroner efter TBI foreslået, at et cellulært rheostat, der afspejler forholdet mellem ekspressionsniveauerne af celleoverlevelse til celledød gener regulerer cellens skæbne efter TBI. Disse igangværende studier vil bidrage til udformning og udvikling af farmakoterapeutiske strategier, der kan have en positiv indflydelse på celleoverlevelse rheostat. Endvidere har vi i øjeblikket bruger LCM at spore og overvåge virkningerne af potentielle terapeutiske lægemiddelbehandlinger i hippocampus neuroner efter TBI. Således vores undersøgelser viser, at givne omhyggelige RNase-fri håndteringsteknikker og nogleændringer af eksisterende protokoller, er det muligt at opnå en høj kvalitet RNA-prøver fra LCM for præcis kvantitativ genekspressionsanalyse. Men der er et par faldgruber, der er forbundet med LCM teknikker. For eksempel kan indsamle kun neuronale celler uden microglia kontaminering være næsten umuligt. I det pyramidale cellelag i hippocampus er det blevet anslået, at 95% af cellerne er neuroner med 90% af denne population for at være pyramideformede celler og 10% interneuroner, hvilket efterlader en lille procentdel af gliale og andre celletyper. 8,17, 18 I vores undersøgelser har vi bruger Fluoro-jade et fluorescerende farvestof, som specifikt kun etiketter tilskadekomne neuroner i hjernevæv. En anden plet, der er en markør for GFAP ville være nødvendigt at farve microglia. 19 Indsamling kun Fluoro-jade farvede enkelt neuronale organer sikrer en mere homogen population af neuroner. Et andet fælles problem, der kan kræve fejlfinding er, at en cirkel ikket defineret, når laseren er fyret. Hvis dette sker, er det nødvendigt at kontrollere laser indstillinger og justere effekten og varigheden efter behov. Det er også vigtigt at sikre, at hætten er placeret fladt på vævet og placeret korrekt i armen. Under henvisning til LCM teknisk manual eller ringe teknisk support vil nogle gange være nødvendigt. Efter LCM-og RNA-isolering, bør kvaliteten af ​​RNA&#39;et altid vurderes under anvendelse af en bioanalyzer forud for enhver genekspressionsanalyse. Der findes flere typer af laser capture instrumenter på markedet i øjeblikket, herunder laserskæring (Life Technologies, Leica Microsystems) og laser catapulting (Zeiss) instrumenter. Vores LCM system fungerer godt til optagelse af et lille antal celler. Andre high-throughput og mere automatiserede systemer kan være mere egnede til opnåelse af større antal celler til genomisk og især proteom analyse. Faktisk LCM anvendelse af disse automatiske systemer har et stort potentiale for analyse af protein ekspression i identificerede celler eller berigede populationer af celler. 20 Endvidere kan LCM lette genekspressionsanalyse af immunolabeled celler, 21 gør det muligt for os at undersøge genekspression i definerede celletyper uanset kompleksiteten i de mest heterogene væv. Således LCM er et fremragende værktøj til cutting-edge molekylære studier af enkelte eller berigede populationer af celler.

Genekspressionsanalyse af heterogene væv har altid været problematisk. Dette gælder især i pattedyrhjernen, som har cirka 5.000 forskellige celletyper 4 Forud for udviklingen af laseropfangnings-mikrodissektion (LCM) teknik, genomiske undersøgelser af virkningerne af TBI in vivo blev baseret på analyse af genekspression i en blandet population af hjernen omfattede celler, ikke kun af forskellige neuronale celletyper, men også for at støtte glial og immunmodulerende celler. De resulterende komplekse genekspressionsprofiler opnået fra disse heterogene væv, og de ​​ofte modstridende mønstre af skade-inducerede cellulære signaler, kan være en forklaring på den manglende i humane kliniske undersøgelser af terapeutiske strategier vist sig effektiv i prækliniske studier af TBI. 5 For at opnå en klar forståelse af skade-induceret genekspression i sårbare populationer af neuroner fra rotte hoftepocampus vedtog vi en teknik, LCM, først rapporteret af Emmert-Buck et al. 3 Efterfølgende vi modificeret og optimeret denne mikrodissektion teknik til effektiv opsamling af beriget populationer af neuroner og enlige neuroner til mRNA profilering ved hjælp af kvantitativ real-time PCR og microarray analyse . At opretholde integriteten af ​​mRNA i frosne snit af hjernevæv for genomisk analyse, vi modificeret eksisterende protokoller til fastsættelse farvning og hurtig opsamling af neuroner fra frosne rottehjerne sektioner. Til identifikation og isolering af beskadigede og døende hippocampale neuroner har vi også optimeret Fluoro-Jade farvningsteknik for LCM. Fluor-Jade skelner ikke mellem apoptotisk og nekrotisk celledød. Således kan alle typer af degenererende neuroner påvises ved denne farvning. 6,7 Her beskriver vi den protokol, der anvendes i vores laboratorium for at få puljer af enkelt dør eller overlever neuroner samt skår af beriget populations af forskellige neuronale celletyper (dvs. CA1-CA3 neuroner for genekspressionsanalyse efter TBI). Proceduren for fluid percussion hjerneskade udført i vores laboratorium er beskrevet i detaljer i Shimamura et al. 8 og er meget lig den lateral fluidperkussion skade protokol for mus offentliggjort i Jove af Alder et al. 9 Da LCM teknik har vist sig at have minimal eller ingen virkning på integriteten af ​​DNA, RNA og protein i væv, er et udmærket værktøj for molekylær-og proteinanalyse af definerede celletyper.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PixCell IIe Laser Capture Microscope</td>
 <td>Life Technologies (Arcturus)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAqueous Micro- Kit</td>
 <td>Life Technologies (Ambion)</td>
 <td>AM1931 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 6000 Pico Kit</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Capsure LCM caps</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>LCM0211/LCM0214</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoro-Jade</td>
 <td>Histo-chem Inc.</td>
 <td>#1FJ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cresyl Violet Acetate</td>
 <td>Sigma-aldrich</td>
 <td>C5042-10G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylene (Histological grade)</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>X3P-1GAL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td>
 <td>UTMB pharmacy</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase free barrier pipette tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies)</a> 
 <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Zeiss Laser Microdissection The PALM family </a> 
 <a href="http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica DM6000 B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">Leica Microsystems</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury

Langsigtet kognitive handicap efter TBI er forbundet med skade-induceret neurodegeneration i hippocampus-en region i den mediale tindingelappen, der er afgørende for indlæring, hukommelse og udøvende funktion. 1,2 Deraf vores undersøgelser fokuserer på genekspression analyse af specifik neuronal populationer i særskilte underområder i hippocampus. Teknikken med laseropfangnings-mikrodissektion (LCM), blev indført i 1996 af Emmert-Buck, et al. Tre har muliggjort betydelige fremskridt inden for genekspression analyse af enkelte celler og berigede populationer af celler fra heterogene væv, såsom pattedyrs hjerne, der indeholder tusinder af funktionelle celletyper. fire Vi bruger LCM og en veletableret rottemodel for traumatisk hjerneskade (TBI) til at undersøge de molekylære mekanismer, der ligger til grund for pathogenesen af TBI. Efter fluidperkussion TBI, er hjerner fjernes på forudbestemte tidspunkter efter skaden, straks frosset på tøris,og forberedes til skæring i en kryostat. De rottehjerner kan indlejres i OLT og snittet straks eller gemmes flere måneder ved -80 ° C før sektionering til laser capture mikrodissektion. Derudover bruger vi LCM at studere virkningerne af TBI på døgnrytmen. Til dette fange vi neuroner fra suprachiasmatiske nuclei, som indeholder hovedkloksignalet i pattedyrs hjerne. Her viser vi anvendelse af LCM at opnå enkelte identificerede neuroner (skadet og degenererende, fluor-Jade-positive, eller ubeskadiget, fluor-Jade-negative) og berigede populationer af hippocampale neuroner for efterfølgende genekspressionsanalyse ved real time PCR og / eller hel-genom microarrays. Disse LCM-baserede undersøgelser har vist, at den selektive sårbarhed anatomisk distinkte områder af rottehippocampus afspejles i de forskellige genekspressionsprofiler fra forskellige populationer af neuroner opnået ved LCM fra disse forskellige områder. Resultaterne fra vores encellede studier, hvorvi sammenligner de transkriptionelle profiler for at dø og tilstødende overlevende hippocampale neuroner, at der eksisterer en celleoverlevelse rheostat, der regulerer celledød og overlevelse efter TBI.

I vores første LCM undersøgelse, var vi i stand til at vise, at funktionelt forskellige underområder (CA1 og CA3) af rotte hippocampus har genekspressionsprofiler der afspejler deres sårbarhed over for TBI. 8 Figur 1A-1C viser laser capture af hippocampale pyramidale neuroner (CA1- CA3), gyrus dentatus neuroner og SCN neuroner før og efter LCM. Rene fangster af pyramidal, granulat eller SCN neuroner henholdsvis er vist på makro hætter. Figur 2A-2B illustrerer døende, Fluor-Jade positive pyramideformede neuroner og overleve, Fluor-Jade negative pyramidale neuroner før og efter LCM. Den rene opsamling af den døende eller overlever neuroner er vist ved at se de indfangede celler på LCM caps. Efter LCM, kan det totale RNA anvendes til en bred vifte af molekylære undersøgelser, herunder kvantitative real-time PCR-analyse af gen-ekspression under anvendelse af TaqMan eller SYBR Green kemier (figur 3A), små focused PCR arrays med SYBR Green prober (figur 3B) eller hele genom microarray undersøgelser (figur 3C). <img alt="Figur 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> Figur 1. Laseropfangnings-mikrodissektion af skår af definerede cellepopulationer fra rottehjerne. Frosne 10 um coronale snit af rottehjerne fikseres i ethanol, farvet med en Nissl farvning (cresylviolet) og forberedt til LCM. Vist er billeder af rottehippocampus og suprachiasmatiske kerne før og efter LCM og de ​​indfangede celler som visualiseret på makro hætter. A. pyramidale neuroner fra CA1-CA3 underfelter i rottehippocampus. B. granulceller i den hippocampale tandede hjernevinding. C. Bilateral suprachiasmatic kerner placeret på hver side af den tredje ventrikelog placeret over den optiske chiasma. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> Figur 2. Laser capture mikrodissektion af enkelte neuroner fra rotte hippocampus. Vist er A. udarter, Fluor-Jade-positive (farvede) hippocampale CA3 neuroner og B. Surviving, Fluor-Jade-negativ (ufarvet) CA3 neuroner før og efter LCM. Tilfangetagne celler er visualiseret. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ Files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot; /&gt; Figur 3. Genekspressionsanalyse af total RNA isoleret fra laser fanget neuroner. A. Kvantitativ real time PCR data af døgnrytmen ur genekspression i SCN. B. Heatmap af genekspression i at dø og overleve hippocampale neuroner, der viser ekspression af apoptose-relaterede gener ved hjælp af fokuserede PCR arrays . C. Agilent hel-genom microarray analyse af genekspression i hippocampale CA1-CA3 neuroner fra rotter, som fik skin-skade, TBI eller TBI plus en rekombinant adenoassocieret siRNA virus konstrueret til at knockdown ekspression af gener induceret af hjerneskade (neuronal nitrogenoxid syntase og glutathionperoxidase-1). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Vi beskriver, hvordan du bruger laser capture mikrodissektion (LCM) for at opnå berigede populationer af hippocampus neuroner eller enlige neuroner fra frosne dele af den sårede rottehjerne til efterfølgende genekspressionsanalyse ved brug af kvantitativ real-time PCR og / eller hel-genom microarrays.

Laser Capture mikrodissektion af beriget populationer af neuroner eller enkelte neuroner til genekspression analyse efter traumatisk hjerneskade

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Ikke-Laser Capture Mikroskopi Tilgang til mikrodissektion af diskrete Mouse Brain Regioner for Total RNA Isolation og downstream næste generation sekventering og Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Laser Capture mikrodissektion af neuroner fra differentierede humane Neuroprogenitor celler i kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produktion af RNA til transskriptionsanalyse fra Mus Rygmarv Motor Neuron Cell Organer ved Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Olfaktoriske Neuroner opnået ved nasal biopsi Kombineret med Laser-Capture mikrodissektion: En Potentiel tilgang til Uddannelse behandlingsrespons i Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser Capture mikrodissektion - en demonstration af Isolering af Individual dopaminneuroner og hele Ventral tegmentalområde

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Analyse af genekspression Ændringer i rottehippocampus Efter Deep Brain Stimulation af den forreste thalamiske Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og Gene Expression Analyse af Fos-udtrykkende neuroner fra Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Stereotactic Atlas-styrede Laser fange Microdissection af hjerneregioner ramt af traumatisk skade

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

En roman In Vitro Model af Blast traumatisk hjerneskade

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...