Name: laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury
Uploaded: 2013-04-10T12:00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury at JoVE.com

Dette arbeidet er finansiert av R01 NS052532 (til HLH), Moody Foundation, og Institutt for Anestesiologi. Vi takker Laurie Bolding, Christine Courteau Butler og Christy Perry for sin redaksjonelle hjelp, og Christy Perry for layout og god produksjon av alle figurer, tabeller og illustrasjoner.

1. Kirurgiske prosedyrer og Fluid Percussion TBI <ol><li> Alle dyreforsøk er først godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas og National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (åttende Edition, National Research Council). </li><li> Rotter (voksen mann Sprague-Dawley rotter, 400-500 g innhentet fra leverandøren Charles Rivers, Portland, Maine) er plassert to per bur og sørget for mat og vann ad libitum i en vivarium med disse konstante forhold: lys syklus (600 hr til 1800 hr), temperatur (21 ° C til 23 ° C) og fuktighet (40% til 50%) en uke før bruk. </li><li> Anesthetize rotter med 4% isofluran, intubere, og mekanisk Luft (NEMI Scientific, New England Medical Instruments, Medway, MA) rottene med 1,5 til 2,0% isofluran i oksygen: Luft (70:30) og forberede dem for parasagittal væske-perkusjon skade som tidligere beskrevet. 8, 10 </li><li> Ofre rotter på riktig tidspunkt etter skade avhengig eksperimentell design. Raskt fjerne hjernen, fryse umiddelbart på tørris, og oppbevar ved -80 ° C i 50 ml tube eller fortsette umiddelbart å legge i OCT for frossen snitting. </li></ol> 2. Seksjonering og farging av Rat Brain <ol><li> Hjernevev som ikke brukes umiddelbart, kan oppbevares ved -80 ° C i opp til en måned hvis holdt på en konstant temperatur. Hjerner som fryses ved -80 ° C, deretter tint til -20 ° C for snitting, og deretter fryses ikke gir kvalitet RNA etter den andre tining. Når hjernen er tint, montert i oktober og seksjonert, bør lysbilder være farget innen 24 timer og brukt for LCM innenfor 30 min til en time av farging. Dette vil sikre god kvalitet RNA. Etter LCM kan fanges celler på LCM caps lagres i lyseringsbuffer ved -80 ° C i opp til en uke, men RNA bør isoleres på en riktig måte for å sikre høyest mulig kvalitet. &lt;/ Li&gt; <li> Før seksjonering hjernen, tørker kryostaten med RNase-Zap og rengjør børstene med ETOH (erstatte disponibel bladet mellom hver hjerne). </li><li> Hente hjernen i 50 ml rør fra -80 ° C fryser; plassere den i kryostaten ved en temperatur på -22 ° C og tining i rør i omtrent 10 min. Fjerne hjernen fra røret og plasser den på scenen på gasbind, ventral side opp. </li><li> Ved hjelp av et barberblad, skjære hjernen for å fjerne den bakre delen av hjernen bare rostral til lillehjernen og den fremre delen på chiasma. Fyll en cryomold med oktober montering medium (Tissue Tek), og plasser hjernen i formen med den fremre side ned. Tillat hjernevevet å fryse i monteringsmedium til den blir hvit (ca. 10 min). </li><li> Frys prøven plate (Tissue Tek) på hjernen med oktober Fjerne hjernen fra formen. Sett hjernen i prøven hodet og stram til skruene. </li><li> Sett inn en avfallshåndteringBLE, lav profil blad (Fisher Scientific) i knivholderen og stram spaken ned. </li><li> Begynn å skjære i hjernen på 20 mikrometer for å fjerne det ytterste laget av oktober Når hippocampus-regionen er nådd, setter micron dial til 10 år. Samle koronale seriesnitt ved å plassere et glass lysbilde eller pluss-glass lysbilde på vevsdeler (Fisher Scientific). Lysbilder er bevart ved -20 ° C i en RNase-fri farging takstativ inntil snitting er fullført. </li><li> Å fjerne alle RNases fra glass hvor vevsdelene behandles, tørke ned alle flekker beholdere og ble uteksaminert sylindere med Eliminase (Fisher Scientific) og skyll i Milli Q vann. Klargjør alle løsninger med RNase-fritt vann og filtrere Cresyl fiolett (Sigma-Aldrich) og fluor-Jade (Histo-chem) flekk med et 0,2 mikrometer filter før bruk. </li><li> Tine hjernen seksjoner ved RT i 30 sek og fikse i 75% ETOH (1 min). </li><li> For LCM av single skadde nerveceller etter fiksering, skyll lysbilder i RNase-fritt vann (1 min), Counterstain med 1% Cresyl fiolett (15-20 sek), skyll i RNase-fritt vann (2 × 30 sek), flekken med fluor-Jade (4 min), skyll i RNase-fritt vann (3 × 1 min), dehydrere med 95% ETOH laget RNase-fritt vann (30 sek), 100% EtOH (30 sek), og xylen (2 x 3 min). </li><li> For LCM av ranker av nerveceller etter fiksering, skyll lysbilder i RNase-fritt vann (1 min), flekken med 1% Cresyl fiolett (1 min), skyll i RNase-fritt vann for (3 × 1 min), tørke med 95% ETOH (2 x 30 sek), 100% EtOH (2 x 30 sek), og xylen (2 x 3 min). </li><li> Lufttørke alle seksjoner i en avtrekkshette for 15 min før LCM. Lysbilder kan lagres, seksjon sider opp, i et lysbilde boks foret med tørkemiddel, hvis de trenger å bli overført fra rom til rom. Imidlertid er optimale resultater oppnås hvis LCM utføres umiddelbart etter deler er tørre. LCM bør begrenses fra 30 min til 1 time. I neste avsnitt beskriver vi først hvordan å fange kontinuerlig ranker av celler, som er easiest å mestre for de som lærer denne teknikken. Da vi beskrive hvordan du nettopp fange enkle nerveceller. I prosedyren vår, identifiserer vi døende nevroner etter affinitet deres for Fluoro-Jade-en markør for degenereres nevroner. Fluor-Jade-negative celler antas å være gjenlevende nerveceller. </li></ol> 3. Laser Capture mikrodisseksjon (LCM) LCM av ranker av anriket bestander av hippocampus nevroner <ol><li> LCM utføres ved hjelp av en PixCell IIe mikroskop med en infrarød diode laser (Life Technologies). </li><li> Juster midten joysticken til vertikal stilling. Roter og låse 4X målet på plass. </li><li> Plasser en lysbilde i sentrum av mikroskopet scenen og manuelt juster til regionen av hippocampus er i sikte. Bruk grovt og fint fokus justeringer for å bringe bildet i fokus. </li><li> Aktiver vakuum chuck ved å trykke på vakuum-knappen på kontrolleren. Roter og låse 10X målet i pless. Fokusere på nytt med grove og fine justeringer. </li><li> Laste CapSure Macro LCM caps (Life Technologies) i CapSure kassett modulen og sett en cap på lasten linjen posisjon. Roter Cap Placement arm og posisjon rundt hetten. Hev Cap Placement arm for å fjerne CapSure cap fra kassetten modulen. </li><li> Roter Cap Placement arm over raset og senke armen ned over lysbildet, og dette vil plassere hetten på lysbildet. Juster fin fokus og flytte styrespaken for å sjekke om cellene er i den svarte sirkelen på hetten. Alle celle fanger bør være inne i denne svart sirkel. </li><li> Still laser parametere. Trykk først på laser-aktivere knappen på kontrolleren. Laseren målet punktet vil være synlig som en rosa prikk i synsfeltet på dataskjermen. </li><li> Still laser spot størrelse til små (7,5 mikrometer) å fokusere laseren og justere kraften og varigheten til 65-75 mW, for 1.0 til 2.0 ms som nødvendig for optimal celle fangst. </li><li> Til test laser, kan du bruke styrespaken til å flytte laser spot til et område hvor det ikke er noen celler til å plukke opp. Avfyre ​​laseren med tommelen bryteren. Bruk styrespaken til å flytte laseren sted unna smeltet polymer spot og sjekk for å se om en synlig mørk ring omgir et åpent område hvor laseren ble avfyrt. </li><li> For å fange celler, bruker du styrespaken til å flytte laser spot over området av celler til fange. Avfyre ​​laseren med tommelen bryteren. Flytt styrespaken mens skyting laseren å fange et stort område av celler. Når laseren avfyres det smelter det termoplastiske polymerfilm på hetten til overflaten av målcellene. Polymeren absorberer laserstråling, således ikke endre RNA, DNA eller protein sikre integriteten av prøven for fremtidige molekylære applikasjoner. </li><li> Etter avfyring alle celler av interesse, løfte Cap Placement arm. Den fanget cellene vil skille seg fra vevsdeler og holder seg til CapSure cap. Den gjenværende vev og manglende cellene vil være visvertible i synsfeltet. Cellene på hetten kan også ses ved å plassere lokket på en tom del av lysbildet. </li><li> Løft Cap Placement arm og roter det til Cap Unload Station. Senk lokket inn på stasjonen og roter Cap Placement armen tilbake til sin tidligere stilling. </li><li> Skyv CapSure innsetting verktøyet langs plattformen og på hetten. Løfter verktøyet fra plattformen. Beskyttelseshetten vil forbli festet. Så vidt berører toppen på den CapSure ren pad for å rense bort uønsket vev. </li><li> Sett lokket til en 0,5 ml RNase-frie rør fylt med 100 ul av lyseringsbuffer fås fra RNAqueous Micro-Isolation Kit. Umiddelbart vortex hetten i 30 sek for å lysere cellene. Inkuber prøvene ved 42 ° C i 30 min og fryser ved -80 ° C inntil RNA isolering. </li></ol> LCM av single FJ + nevroner i hippocampus <ol start="15"><li> For å fange enkeltceller, legger CapSure HS LCM caps i CapSure kassett modulen og posipå en cap på lasten linjen posisjon. Roter Cap Placement arm og plassere den rundt hetten. Hev Cap Placement arm for å fjerne CapSure cap fra kassetten modulen. </li><li> Still laserpunktet størrelse til liten (7,5 uM) for å fokusere laser og juster lasereffekten og varighet til 65 -75 mW for 0,45 til 0,50 msek for optimal celle fangst av enkeltceller. </li><li> Roter Cap Placement arm over raset og senke armen ned mot lysbildet. Dette vil plassere lokket på lysbildet. Den Capsure HS cap overflaten sitter forhøyet fra prøven under LCM. </li><li> Bruk styrespaken til å flytte laseren over én FJ + celler. Alle celler blir fanget må være inne den lille svarte ringen på hetten. Avfyre ​​laseren med tommelen bryteren. </li><li> Når alle cellene i den svarte sirkelen området har blitt avfyrt med laser, løft Cap Placement arm. Den fanget cellene vil skille seg fra vevsdeler og holder seg til den CapSure HS cap. </li><li> Plasser et annet lysbilde på mikroerhåndtere scenen og samle FJ + celler til HS cap er full. Sett lokket inn i en 0,5 ml RNase-fri rør fylt med 40-50 pl lyseringsbuffer. Umiddelbart vortex hetten i 30 sek for å lysere cellene. Inkuber prøvene ved 42 ° C i 30 min og fryser ved -80 ° C inntil RNA isolering. </li></ol> 4. Total RNA isolert fra LCM Samples (Denne delen vil bare være beskrevet i videopresentasjon) <ol><li> Total RNA fra celler er isolert med RNAqueous-Micro Kit (Ambion) etter produsentens protokoller. Alle reagenser og vask løsninger er oppgitt i dette settet. Pre-vått av mikrofilteret kassettanordningen ved tilsetning av 30 pl av lysis løsning buffer til filteret. Etter 5 min, sentrifuger filteret i 30 sek ved 10 000 x g. </li><li> Tilsett 3 pl LCM additiv til prøven lysatet, til pipette mikse og sentrifuge. </li><li> Legg 52 pl 100% EtOH (todel volum) til prøven lysatet; pipette å blande, og overføre lysatet til filteretkolonnen. </li><li> Sentrifuger filteret kolonnen ved 10.000 x g i 1 min for å binde RNA til kolonnen. Hvis det er flere caps for en prøve, spinne hver lysat gjennom samme kolonnen separat. </li><li> Fullfør RNA isolering prosedyren som beskrevet i RNAqueous Micro kit. </li><li> Utfør DNase behandling og DNase inaktivering av LCM RNA prøver som beskrevet i settet, overføre RNA til en RNase-fri rør og oppbevar ved -80 ° C. </li></ol> 5. RNA kvantifisering og nedstrøms applikasjoner Vurdering av RNA kvalitet og kvantifisering er utført med en Agilent Bioanalyzer hjelp reagenser fra Pico Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) etter produsentens protokoll. <ol><li> Total RNA er analysert på en Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Programvaren evaluerer konsentrasjonen og integriteten av RNA prøven ved å tilordne en RNA Integrity Number (RIN) til hver prøve som strekker fROM 1-10. 1-5 indikerer degradert RNA og 7-10 indikerer god kvalitet RNA. </li><li> Non-degradert intakte RNA vil bli brukt for Real-Time PCR, individuelle TaqMan analyser eller RT2 profiler matriser med SYBR-grønn kjemi. RNA kan også bli brukt for mRNA microarray analyse og mikroRNA microarray analyse. </li></ol>

<ol>
	<li>Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medial+temporal+lobe.">The medial temporal lobe.</a> Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).</li><li>Bast, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+integrative+perspective+on+hippocampal+function:+from+the+rapid+encoding+of+experience+to+adaptive+behavior.">Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior.</a> Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).</li><li>Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+networks+to+brain+networks.">From gene networks to brain networks.</a> Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).</li><li>Schouten, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+in+traumatic+brain+injury:+a+complex+struggle+against+the+biology+of+nature.">Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature.</a> Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).</li><li>Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade:+a+novel+fluorochrome+for+the+sensitive+and+reliable+histochemical+localization+of+neuronal+degeneration.">Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration.</a> Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).</li><li>Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade+and+silver+methods:+application+to+the+neuropathology+of+scrapie,+a+transmissible+spongiform+encephalopathy.">Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain:+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression.">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).</li><li>Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Fluid+Percussion:+Model+of+Traumatic+Brain+Injury+in+Mice.">Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice.</a> J. Vis. Exp. (54), e3063 (2011).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+long-term+gene+expression+in+neurons+of+the+hippocampal+subfields+following+traumatic+brain+injury+in+rats.">Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats.</a> Neuroscience. 131 (1), 87-97 (2005).</li><li>Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+correlates+of+age-specific+responses+to+traumatic+brain+injury+in+mice.">Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice.</a> Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).</li><li>Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+hypotension+suppress+neuroprotective+gene+expression+in+injured+hippocampal+neurons.">Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons.</a> Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).</li><li>Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stochastic+gene+expression+on+the+cell+survival+rheostat+after+traumatic+brain+injury.">Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury.</a> PLoS One. 6 (8), e2311 (2011).</li><li>Elstner, M., Morris, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+dopaminergic+neurons+in+Parkinson's+disease+and+aging+links+transcriptional+dysregulation+of+energy+metabolism+to+cell+death.">Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death.</a> Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).</li><li>Chen, H., Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Profiling+of+Nucleus+Accumbens+Neurons+Projecting+to+Ventral+Pallidum+Using+both+Microarray+and+Transcriptome+Sequencing.">Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing.</a> Front. Neurosci. 5, 98 (2011).</li><li>Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li><li>Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons,+numbers+and+the+hippocampal+network.">Neurons, numbers and the hippocampal network.</a> Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).</li><li>Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+long-term+treatment+with+L-deprenyl+on+the+age-dependent+microanatomical+changes+in+the+rat+hippocampus.">Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus.</a> Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).</li><li>Schmued, L. C., Hopkins, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Jade:+novel+fluorochromes+for+detecting+toxicant-induced+neuronal+degeneration.">Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration.</a> Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).</li><li>Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+use+of+laser+capture+microdissection+to+selectively+obtain+distinct+populations+of+cells+for+proteomic+analysis--+preliminary+findings.">The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis-- preliminary findings.</a> Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).</li><li>Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunostained+frozen+sections+for+mRNA+analysis.">Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis.</a> Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).</li></ol>

Forfatterne hevder at de ikke har noen interessekonflikter.

Dette LCM teknikken har gjort oss i stand til å gjøre betydelige fremskritt i å forstå de molekylære mekanismene for hodeskader. 8,10,11,12,13 vi var de første etterforskerne å utnytte denne teknikken til å vise at forskjellige underregioner av rotte hippocampus har genuttrykk profiler som korrelerer med deres selektive sårbarhet for skade. Våre undersøkelser viste at vi kunne kvantifisere genuttrykket ved qPCR, fra så få som 10 laser fanget celler og at vi kunne utføre genom-wide microarray analyse fra så få som 600 fangede celler. LCM ville være et verdifullt verktøy i lignende studier av andre områder av hjernen som er kjent for å være innblandet i ulike nevrologiske og nevropsykiatriske lidelser. For eksempel har studier med LCM belyse i patogenesen av Parkinsons sykdom i dopamin neurons av substantia nigra, 14 og hjulpet genom-wide profilering studier av nucleus accumbens, som er involvert i belønning kretser innblandet i substance misbruk lidelser. 15 Neuronal heterogenitet gjenspeiles på genomet nivå 16 og kan bidra til mangel på suksess eksperimentelle behandlinger for TBI i kliniske studier. Dermed er vårt mål å utnytte denne teknikken for å undersøke de kritiske elementene påvirker nevronal overlevelse etter hodeskader. Vårt nylige genom-wide profilering studie av farging og tilstøtende gjenlevende hippocampus nevroner etter TBI foreslo at en cellulær rheostat som reflekterer forholdet uttrykket nivåer av celleoverlevelse til celledød gener regulerer celle skjebne etter hodeskader. Disse pågående studier vil bidra til design og utvikling av Farmakoterapeutisk strategier som kan positivt påvirke celle overlevelse rheostat. Videre har vi i dag bruker LCM å spore og overvåke virkningene av potensielle terapeutiske medikamentelle behandlinger i hippocampus nevroner etter hodeskader. Dermed våre studier viser at gitt forsiktig RNase-frie håndtering teknikker og noenmodifikasjoner av eksisterende protokoller, er det mulig å oppnå høy kvalitet RNA prøver fra LCM for nøyaktig kvantitativ genekspresjonsanalyse. Men det er noen fallgruver forbundet med LCM teknikker. For eksempel, kan samle bare neuronale celler uten microglia kontaminering være nesten umulig. I pyramidal cellelaget av hippocampus har det blitt anslått at 95% av cellene er nervecellene med 90% av denne populasjonen å være pyramidale celler og 10% interneurons, forlater en liten prosentandel av glial og andre celletyper. 8,17, 18 I våre studier bruker vi Fluoro-jade et fluorescerende fargestoff som spesifikt etiketter bare skadde nerveceller i hjernen vev. En annen flekk som er en markør for GFAP ville være nødvendig å farge microglia. 19 Samle bare Fluoro-jade farget enkelt nevrale organer sikrer en mer homogen befolkning av nerveceller. Et annet vanlig problem som kan kreve feilsøking er at en sirkel er ingent definert når laseren er avfyrt. Hvis dette skjer, er det nødvendig å kontrollere laser innstillinger og justere kraften og varighet som er nødvendig. Likeledes er det viktig å sikre at hetten er plassert flatt på vev og sittende riktig i armen. Med henvisning til LCM tekniske håndboken eller ringe teknisk støtte vil noen ganger være nødvendig. Etter LCM og RNA isolasjon, kvaliteten av RNA alltid vurderes ved hjelp av en Bioanalyzer før enhver genekspresjonsanalyse. Det finnes flere typer laser capture instrumenter på markedet, inkludert laser cutting (Life Technologies, Leica Microsystems) og laser catapulting (Zeiss) instrumenter. Vår LCM system fungerer godt for å fange et lite antall celler. Andre high-throughput og mer automatiserte systemer kan være mer egnet til å oppnå større antall celler for genomisk og spesielt proteomikk analyser. Faktisk har LCM bruke disse automatiserte systemer stort potensial for analyse av protein uttrykk i identifiserte celler eller beriket bestander av celler. 20 Videre kan LCM lette genekspresjonsanalyse av immunolabeled celler, 21 tillater oss å undersøke genekspresjon i definerte celletyper uavhengig av kompleksiteten i de mest heterogene vev. Dermed er LCM et utmerket verktøy for cutting-edge molekylære studier av ett eller beriket populasjoner av celler.

Genekspresjonsanalyse av heterogene vev har alltid vært problematisk;. Dette gjelder særlig i hjernen hos pattedyr, som har ca 5000 forskjellige celletyper 4 Før utviklingen av laser capture mikrodisseksjon (LCM) teknikk, genomisk studier av effekten av TBI in vivo var basert på analyse av genuttrykk i en blandet befolkning av hjerneceller består ikke bare av forskjellige nevrale celletyper, men også for å støtte glial og immunmodulerende celler. De resulterende komplekse genuttrykk profiler innhentet fra disse heterogene vev, og de ​​ofte motstridende mønstre av skade-indusert mobilnettet signaler, kan være en forklaring på svikten i kliniske studier med terapeutiske strategier vist seg effektive i pre-kliniske studier av hodeskader. 5 Å få en klar forståelse av skade-indusert genuttrykk i sårbare bestander av nerveceller fra rat hippocampus, vedtok vi teknikken LCM, først rapportert av Emmert-Buck et al. 3 Deretter endret vi og optimalisert denne mikrodisseksjon teknikk for effektiv fangst av beriket bestander av nevroner og single nevroner for mRNA profilering ved hjelp kvantitativ real time PCR og microarray analyse . For å opprettholde integriteten av mRNA i frosne deler av hjernevev for genomisk analyse, endret vi eksisterende protokoller for å fikse, farging og rask fangst av nerveceller fra frosne rottehjernen seksjoner. For identifisering og isolering av skadde og døende hippocampus nevroner, vi også optimalisert Fluoro-Jade farging teknikk for LCM. Fluor-Jade skiller ikke mellom apoptotiske og nekrotisk celledød. Dermed kan alle typer degenereres nevroner bli oppdaget av denne flekken. 6,7 Her beskriver vi protokollen som brukes i vårt laboratorium for å få bassenger av single dør eller overlever nevroner samt ranker av anriket befolkningenons av forskjellige nevrale celletyper (dvs. CA1-CA3 nevroner for genekspresjonsanalyse etter TBI). Prosedyren for fluid perkusjon hjerneskade utført i vårt laboratorium er beskrevet i detalj i Shimamura m.fl.., 8 og er svært lik den laterale fluidum-perkusjon skade protokoll for mus publisert i Jove etter Alder et al. 9 Siden LCM teknikken har vist seg å ha minimal eller ingen virkning på integriteten av DNA, RNA og protein i vev, er dette et utmerket verktøy for molekylær og protein analyse av definerte celletyper.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PixCell IIe Laser Capture Microscope</td>
 <td>Life Technologies (Arcturus)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAqueous Micro- Kit</td>
 <td>Life Technologies (Ambion)</td>
 <td>AM1931 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 6000 Pico Kit</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Capsure LCM caps</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>LCM0211/LCM0214</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoro-Jade</td>
 <td>Histo-chem Inc.</td>
 <td>#1FJ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cresyl Violet Acetate</td>
 <td>Sigma-aldrich</td>
 <td>C5042-10G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylene (Histological grade)</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>X3P-1GAL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td>
 <td>UTMB pharmacy</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase free barrier pipette tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies)</a> 
 <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Zeiss Laser Microdissection The PALM family </a> 
 <a href="http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica DM6000 B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">Leica Microsystems</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury

Langsiktig kognitiv funksjonshemming etter TBI er forbundet med skade-indusert neurodegeneration i hippocampus-en region i den mediale tinninglappen som er kritisk for læring, hukommelse og utøvende funksjon. 1,2 Derav våre studier fokuserer på genekspresjonsanalyse av spesifikke nevronale populasjoner i forskjellige underregioner av hippocampus. Teknikken av laser fangst mikrodisseksjon (LCM), ble innført i 1996 av Emmert-Buck et al., 3 har åpnet for betydelige fremskritt i genekspresjonsanalyse av enkeltceller og beriket populasjoner av celler fra heterogene vev som hjernen hos pattedyr som inneholder tusenvis av funksjonelle celletyper. 4 Vi bruker LCM og en godt etablert rotte modell av traumatisk hjerneskade (TBI) for å undersøke de molekylære mekanismene som ligger til grunn patogenesen av hodeskader. Etter væske-perkusjon TBI blir hjernene fjernet ved forhåndsbestemte tider etter skade, umiddelbart frosset på tørris,og forberedt for seksjonering i en kryostaten. De rottehjerner kan bygges inn i oktober og seksjonert umiddelbart, eller lagres i flere måneder ved -80 ° C før snitting for laser fangst mikrodisseksjon. I tillegg bruker vi LCM å studere effekter av TBI på døgnrytme. For dette, fanger vi nerveceller fra suprachiasmatic kjerner som inneholder master klokke av hjernen hos pattedyr. Her viser vi bruken av LCM å få enkle identifiserte nevroner (skadet og degenereres, fluor-Jade-positive, eller uskadet, fluor-Jade-negative) og beriket bestander av hippocampus nevroner for senere genekspresjonsanalyse av Real Time PCR og / eller hel-genom microarrays. Disse LCM-aktiverte studier har avdekket at den selektive sårbarhet anatomisk distinkte regioner av rotte hippocampus gjenspeiles i de ulike genuttrykk profiler av forskjellige populasjoner av nerveceller innhentet av LCM fra disse forskjellige regioner. Resultatene fra våre encellede studier, derSammenligner vi transcriptional profiler av døende og tilstøtende overlevende hippocampus nevroner, foreslår eksistensen av en celle overlevelse rheostat som regulerer celledød og overlevelse etter hodeskader.

I vår første LCM studien kunne vi vise at funksjonelt distinkte underregioner (CA1 og CA3) av rotte hippocampus har genuttrykk profiler som gjenspeiler deres sårbarhet for hodeskader. 8 Figur 1A-1C viser laser fangst av hippocampus pyramidale nevroner (CA1- CA3), dentate gyrus nevroner og SCN nevroner før, og etter LCM. Rene fanger av pyramideformet, granule eller SCN nevroner, henholdsvis, er vist på makro caps. Figur 2A-2B illustrerer døende, fluor-Jade positive pyramidale nevroner og overlevende, fluor-Jade negative pyramidale nevroner før og etter LCM. Den rene fangst av døende eller etterlatte nevroner vises ved å se de fangede cellene på LCM caps. Etter LCM, kan den totale RNA brukes til et variert utvalg av molekylære studier inkludert kvantitativ real-time PCR-analyse av genuttrykk med TaqMan eller SYBR grønne kjemikalier (figur 3A), liten focused PCR arrays med SYBR grønne prober (Figur 3B) eller hele genomet microarray studier (figur 3C). <img alt="Figur 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> Figur 1. Laser fangst mikrodisseksjon av ranker av definerte celle populasjoner fra rottehjerne. Frosne 10 mikrometer koronale deler av rottehjerne er løst i etanol, farget med en nissl flekk (Cresyl fiolett) og forberedt for LCM. Vist er bilder av rotte hippocampus og suprachiasmatic nucleus før og etter LCM og de ​​fanget celler som visualisert på makro caps. A. pyramidale nevroner fra CA1-CA3 subfields av rotte hippocampus. B. granule celler i hippocampus dentate gyrus. C. Bilateral suprachiasmatic atomkjerner plassert på hver side av den tredje ventrikkelog ligger over den optiske chiasma. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> Figur 2. Laser fangst mikrodisseksjon av single neurons fra rotte hippocampus. Vist er A. degenereres, fluor-Jade-positive (farget) hippocampus CA3 nevroner og B. overleve, fluor-Jade-negative (unstained) CA3 nevroner før og etter LCM. Captured celler er visualisert. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <img alt="Figur 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ Files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot; /&gt; Figur 3. Genekspresjonsanalyse av total RNA isolert fra laser fanget nevroner. A. Kvantitative Real Time PCR data biologiske klokke genuttrykk i SCN. B. Heatmap av genuttrykk i døende og gjenlevende hippocampus nevroner viser uttrykk av apoptose-relaterte gener ved hjelp av fokusert PCR arrays . C. Agilent hel-genom microarray analyse av genuttrykk i hippocampus CA1-CA3 nevroner fra rotter som fikk sham skade, TBI eller TBI pluss en rekombinant adeno-assosiert siRNA virus laget for å knockdown uttrykket av gener indusert av hjerneskade (neuronal nitrogenoksid syntase og glutationperoksidase-1). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Vi beskriver hvordan du bruker laser capture mikrodisseksjon (LCM) for å få beriket bestander av hippocampus nevroner eller enkelt nevroner fra frosne deler av den skadde rottehjernen for påfølgende genekspresjonsanalyse ved hjelp av kvantitativ real time PCR og / eller hel-genom mikromatriser.

Laser Capture mikrodisseksjon av anriket Bestander av neuroner eller Enslige nevroner for genekspresjonsanalyse etter traumatisk hjerneskade

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-Laser Capture Mikroskopi Approach for mikrodisseksjon av Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation og nedstrøms Next-Generation Sekvensering og Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Laser Capture microdissection av nerveceller fra Differensiert Menneskelig Neuroprogenitor celler i kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produksjon av RNA for transkripsjonsanalyse fra mus ryggmargsmotor neuroncellelegemer ved laserfangst mikrodeseksjon

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Olfactory Nevroner innhentet gjennom Nasal Biopsi Kombinert med Laser-Capture mikrodisseksjon: En Potential tilnærming til Study Behandling Response i psykiske lidelser

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser Capture mikrodisseksjon - En demonstrasjon av Isolering av Individuell dopaminneuroner og hele Ventral tegmentale området

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Analyse av genuttrykk Endringer i Rat Hippocampus Etter dyp hjernestimulering av fremre talamiske Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sortering (FACS) og Gene Expression Analyse av Fos-uttrykker Nerveceller fra fersk og fryst Rat hjernevev

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Stereotactic Atlas-guidede Laser fange Microdissection av hjernen regionene påvirkes av traumatisk skade

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Romanen In Vitro modell for Blast traumatisk hjerneskade

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...