Name: creating adhesive and soluble gradients for imaging cell migration with fluorescence microscopy
Uploaded: 2013-04-04T13:00:00
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Die Autoren danken Mittel aus dem Australian Research Council und National Health and Medical Research Council of Australia und auch möchte ich danke Australian National Fabrication Facility für die SU-8-Master für das Mikrokontaktdruck. SHN wird durch das Ministerium für Höhere Bildung Malaysia und Universiti Sains Malaysia unterstützt.

Ein. Passivierung von Deckgläsern mit PLL-PEG-Biotin Dieser Schritt ist für die Oberfläche zu passivieren, so dass Zellen anhaften und auf spezifische Bereiche auf dem Deckglas, das mit microcontract Drucken (Schritt 2-3a) oder Dip-Pen-Lithographie (Schritt 3b) angelegt werden migrieren. Zur Passivierung ist ein Copolymer aus Poly-L-Lysin (PLL) und Polyethylenglykol (PEG) eingesetzt, bei denen 20% der PEG-Moleküle an Biotin (PLL-PEG-Biotin) gepfropft werden. <ol><li> Um Deckgläschen (...

<ol>
	<li>Pulsipher, A., Yousaf, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Chemistry+and+Cell+Biological+Tools+for+the+Analysis+of+Cell+Adhesion+and+Migration.">Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration.</a> Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+cancer.">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).</li><li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. 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(22), e1065 (2008).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. 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H., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Migration+on+Surface-Density+Gradients+of+Fibronectin,+VEGF,+or+Both+Proteins.">Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins.</a> Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+cell+migration:+a+multiscale+tuning+model.">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).</li><li>Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. 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Mater. 21, 2257-2268 (2009).</li><li>Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+dip-pen+nanolithography.">Applications of dip-pen nanolithography.</a> Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).</li><li>Wouters, D., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolithography+and+nanochemistry:+probe-related+patterning+techniques+and+chemical+modification+for+nanometer-sized+devices.">Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).</li><li>Xia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+control+of+cell+motility+through+focal+adhesion+positioning+and+spatial+control+of+Rac+activation.">Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation.</a> FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).</li><li>Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+is+required+but+not+sufficient+for+focal+adhesion+maturation+without+a+stress+fiber+template.">Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template.</a> The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).</li></ol>

Bei diesem Protokoll, verwendeten wir ein handelsübliches Mikrofluidvorrichtung (Slide-klebrigen Chemotaxis 3D von Ibidi), um die Effekte von chemisch modifizierten Oberflächen und chemoattraktive Gradienten auf Zellmigration studieren. Diese mikrofluidischen Einrichtung erfordert keine Strömung, da der Gradient durch Diffusion entlang der Länge des Kanals einstellt. Dies ist wichtig, weil Flow unterschiedlich beeinflussen könnte langsam wandernden Zellen wie Fibroblasten, die stabil fokalen Adhäsionen ...

Regie Zellwanderung ist eine grundlegende Eigenschaft von vielen Zellen und ist ein wichtiger Aspekt von vielen physiologischen Prozessen, einschließlich der embryonalen Entwicklung, Infektabwehr und Wundheilung. Zusätzlich Zellwanderung spielt auch eine wichtige Rolle bei vielen Krankheiten wie Gefäßerkrankung, Tumorzellenmetastase und chronischen Entzündungen 1,2. Während die klassischen Zuständen der Zellwanderung - Polarisation Vorsprung Erweiterung, Bildung Haftung, Krafterzeugung und hinten Rückzug - in der Regel 3,4 angenommen werden, hat die Aufklärung der raumzeitlichen Mechanismen, durch die Signal-Integration koordiniert wurde schwieriger. Die extrazelluläre Matrix (ECM) dient als Substrat für die Zelladhäsion und durch inhärente chemische und physikalische 5 6 Vielfalt stellt Richtungshinweise für Zellennavigationsmodus 7,8. Neben diesen Klebstoff Cues 9, lösliche Faktoren 10-12 &lt;/ Sup&gt;, wie Chemokine und Wachstumsfaktoren können induzieren gerichteten Zellmigration durch chemoattraktive Rezeptoren und deren stromabwärts motogenic Signalisierung. Derzeit ist es nicht bekannt, ob Eingriff und Signalisierung durch Adhäsionsrezeptoren (dh Integrine) oder chemoattraktive Rezeptoren, wie Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK), dominant sind. Auch ist es nicht bekannt, ob Hierarchien von Rezeptor-Systeme Zelltyp spezifisch sind. Live-Mikroskopie bietet eine Fülle von Informationen, die nicht zugänglich ist lose Assays und kann mit mikrofluidischen Bauteilen kombiniert werden, um Steigungen von immobilisierten 13,14 und löslichen Cues 15 16 zu generieren. Das hier beschriebene Verfahren verwendet eine Reihe von einfachen und bewährten Schritte zur Oberflächenmodifizierung in Verbindung mit einem handelsüblichen Mikrofluidik-Kammer, eine Abbildungsanordnung Assay für Zellmigration, dass leicht in einer Zelle Biologielaboranten (Abbildung 1) implementiert werden erstellen. Die zusammengebauteMikrofluidikvorrichtung besitzt optische Eigenschaften, die vergleichbar mit Glas und 17 sind die Steigungen der diffundierbare Moleküle sind für mindestens 16 Stunden stabil. Das System kann für Epifluoreszenz-Mikroskopie und fortschrittliche Techniken verwendet werden. Im Gegensatz zu anderen Chemotaxis Setups 18, eignet sich dieses System zum Aufzeichnen langsam wandernden, adhärenten Zellen. Wichtig ist, ist das System modular aufgebaut und leicht ermöglicht die Einführung alternativer Kleber oder lösliche Migration Signale und Prüfung verschiedener Zelltypen.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverglass staining outfits</td>
 <td>Thomas Scientific</td>
 <td>8542 E40</td>
 <td>Coverslip rack</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oven</td>
 <td>Binder</td>
 <td></td>
 <td>ED 53 series</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicon wafer</td>
 <td>Silicon Quest</td>
 <td>708-007</td>
 <td>Boron doped &lt;100&gt; wafer, 4" diameter, 500 &mu;m, single side polished</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GM1070 SU-8 photoresist</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 developer</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 curing agent</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 elastomer prepolymer</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td >&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PLL-PEG-biotin (20%)</td>
 <td>SuSos AG</td>
 <td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescein</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>46955</td>
 <td>1 mM in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-AlexaFluor350</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S-11249</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-4-fluorescein</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B-1370</td>
 <td>0.03 &mu;g/&mu;l in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-RGD</td>
 <td>GenScript</td>
 <td>SC1208</td>
 <td>0.03 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syto 64 Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td> S-11346 </td>
 <td>1 &mu;M in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sticky slide chemotaxis 3D</td>
 <td>Ibidi</td>
 <td>80328</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l Greiner yellow bevelled tip</td>
 <td>Greiner Bio-One</td>
 <td>739261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaseline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>16415</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin wax, mp 55-57 &deg;C</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>327204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nano eNabler 10 &mu;m cantilever </td>
 <td>BioForce</td>
 <td>SPT-S-C-10s</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Image J software</td>
 <td>National Institute of Health</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Tracking plugin</td>
 <td>Fabrice Cordeli&egrave;res</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemotaxis and Migration Tool</td>
 <td>Ibidi GmbH</td>
 <td></td>
 <td><a href="http://www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html" target="_blank">www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html</a></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

creating adhesive and soluble gradients for imaging cell migration with fluorescence microscopy

Zellen können zu erfassen und zu höheren Konzentrationen an Klebstoff Zeitgeber wie die Glycoproteine ​​der extrazellulären Matrix und löslichen Cues wie Wachstumsfaktoren migrieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur gegenüberliegenden Gradienten aus Klebstoff und löslichen Signale in einem Mikrofluidik-Kammer, die mit lebenden Zellen zu schaffen. Ein Copolymer aus Poly-L-Lysin und Polyethylenglykol (PEG-PLL) wird eingesetzt, um Glasdeckgläser passivieren und verhindern eine unspezifische Adsorption von Biomolekülen und Zellen. Weiter, Mikrokontaktdrucken oder Dip-Pen-Lithographie verwendet werden, um Spuren von Streptavidin an den passivierten Oberflächen zu schaffen, um so Verankerungspunkte für das biotinylierte Peptid Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) als klebende Cue dienen. Mikrofluidische Vorrichtung wird auf die modifizierte Oberfläche platziert und verwendet, um den Gradienten des Klebstoffs Queues (100% bis 0% RGD RGD) an den Streptavidin Spuren zu erzeugen. Schließlich wird der gleichen mikrofluidischen Vorrichtung verwendet, um einen Gradienten eines chemoattraktiven erfolg erstellenh wie fötalem Rinderserum (FBS), wie die lösliche Cue in der entgegengesetzten Richtung des Gradienten aus Klebstoff Signale.

Zelle zu verstehen, wie Wanderungssignale integrieren 25 haben wir ein Verfahren entwickelt, um Bildzellen mit Fluoreszenzmikroskopie dass in einer Umgebung mit konkurrierenden Klebstoff und löslichen Gradienten (Abbildung 1) zu migrieren. Klebstoff Spuren, die fluoreszierende Streptavidin und biotinyliertem RGD enthalten waren, mit Mikrokontaktstruktur gedruckten Spuren und Dip-Pen-Lithographie (Abbildung 2) geschaffen. Erfolgreiche Mikrokontaktdruck wird durch die Linie Pr...

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Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Ein Verfahren zur Montage von Klebstoff und löslichen Gradienten in einer Mikroskopie Kammer für lebende Zellmigration Studien beschrieben. Die gebaute Umwelt verbindet Antifouling Oberflächen und Kleber Tracks mit Lösung Steigungen und ermöglicht somit ein, um die relative Bedeutung von Leitlinien Hinweise zu bestimmen.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Forschung

Biotechnik

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Einfügen von Flexible Neural Sonden mit starren Versteifungen Biodissolvable mit Klebstoff befestigt

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

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Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...