Name: long-term silencing of intersectin-1s in mouse lungs by repeated delivery of a specific sirna via cationic liposomes. evaluation of knockdown effects by electron microscopy
Uploaded: 2013-06-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Elect

Ce travail a été financé par l&#39;Institut national de la santé Subventions R01HL089462 à SP.

1. Préparation des liposomes cationiques <ol><li> Autoclave un ballon propre à être utilisé pour la préparation lipososmes. </li><li> Préparer des solutions de: <ol class="lalpha"><li> - Dissoudre 200 mg de bromure de diméthyl ammonium dioctadecyl (Doab) dans 10 ml de chloroforme en utilisant une petite bouteille en verre. </li><li> - Dissoudre 200 mg de cholestérol dans 10 ml de chloroforme en utilisant une petite bouteille en verre. </li><li> - Préparer et passer à l&#39;autoclave pour stériliser les 5% d...

<ol>
	<li>Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin-1s+regulates+the+mitochondrial+apoptotic+pathway+in+endothelial+cells.">Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells.</a> J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).</li><li>Uddin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipids+used+in+non-viral+gene+delivery+systems.">Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems.</a> Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).</li><li>Barenholz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+lipid+composition+on+the+thermotropic+behavior+and+size+distribution+of+mixed+cationic+liposomes.">Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes.</a> J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).</li><li>Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+caveolae+function+and+upregulation+of+alternative+endocytic+pathways+induced+by+experimental+modulation+of+intersectin-1s+expression+in+mouse+lung+endothelium.">Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium.</a> Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).</li><li>Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+in+vivo+delivery+of+siRNAs:+recent+progress.">Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress.</a> BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).</li><li>Caracciolo, G., Amenitsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+liposome/DNA+complexes:+from+structure+to+interactions+with+cellular+membranes.">Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes.</a> Eur. Biophys. J. , (2012).</li><li>Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+liposomes+as+adjuvants+for+influenza+hemagglutinin:+more+than+charge+alone.">Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).</li><li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+delivery+of+MicroRNA-7-expressing+plasmid+overcomes+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor-resistance+in+lung+cancer+cells.">Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells.</a> Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).</li><li>McLean, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+endothelial+cell+uptake+of+cationic+liposome-DNA+complexes+in+mice.">Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice.</a> Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. (432), 173-178 (2004).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+enhance+bioremediation+of+oil-contaminated+soil.">Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil.</a> J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).</li><li>Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal,+nanoparticle,+and+conjugated+formulations+of+anticancer+agents.">Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents.</a> Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).</li><li>Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacokinetics,+tissue+distribution,+and+therapeutic+effectiveness+of+cisplatin+encapsulated+in+long-circulating,+pegylated+liposomes+(SPI-077)+in+tumor-bearing+mice.">Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice.</a> Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).</li><li>Martino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+siRNA+delivery+by+the+cationic+liposome+DOTAP+in+human+hematopoietic+stem+cells+differentiating+into+dendritic+cells.">Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells.</a> J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delivery+system+targeting+bone+formation+surfaces+to+facilitate+RNAi-based+anabolic+therapy.">A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy.</a> Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).</li><li>Predescu, D., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmalemmal+vesicles+represent+the+large+pore+system+of+continuous+microvascular+endothelium.">Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium.</a> Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).</li><li>Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dap160/intersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis.">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li><li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li></ol>

Basé sur des études précédentes publiées par d&#39;autres 9 et nous 1, 18 nous avons développé cette méthodologie pour le long terme abattre des ITSN-1 in vivo par administration intraveineuse répétée (toutes les 72 h, pendant 24 jours consécutifs) de siRNA spécifique / complexes de liposomes. Cette approche expérimentale est efficace, peut être utilisé en toute sécurité et de façon répétée et il peut être facilement étendu pour étudier l&#39;implication d&#39;un g...

SiARN nu ne peut pas pénétrer la membrane cellulaire, étant chargé négativement, et il est facilement dégradés par les enzymes dans le sang, les tissus et les cellules. Même avec des modifications structurales récemment d&#39;améliorer la stabilité, l&#39;accumulation de siRNA au niveau du site cible après administration est extrêmement faible et nécessite un véhicule intracellulaire efficace 5. Les liposomes cationiques sont apparus comme sûrs acides nucléiques transporteurs ayant le potentiel de transférer de gros morceaux d&#39;ADN / ARN dans les cellules par encapsulation et la protection des acides nucléiques à partir de la dégradation enzymatique 6. En outre, les liposomes cationiques interagissent spontanément avec l&#39;ADN / ARN, favorisant ainsi le transfert de gènes dans les cellules 2. Plus récemment liposomes ont été appliquées à l&#39;administration de vaccins et de médicaments à faible poids moléculaire 7. Livraison liposomale de microRNA-7 plasmide exprimant surmonte facteur de croissance épidermique récepteur tyrosine kinase inhibiteur de la résistance dans les cellules de cancer du poumon 8. Lorsque vous ciblez l&#39;endothélium vasculaire, l&#39;administration par voie intraveineuse est essentielle parce que les complexes sont peu susceptibles de traverser la barrière endothéliale et s&#39;extravaser dans le tissu interstitiel 9. En comparaison à d&#39;autres organes, ECS de la microvascularisation du poumon ont le plus l&#39;absorption et avidement internaliser liposome cationique et complexes ADN / ARN, suivie par les ganglions lymphatiques et les plaques de Peyer 9. Administration intraveineuse dans des modèles rongeurs de siRNA via injections veine rétro-orbitaires ou la queue a été prouvé inoffensif, même à des concentrations élevées, telles que 50 mg / kg 10. Dans la littérature publiée de la composition de liposomes cationiques est différente, sur la base de la formulation de lipides et de leur rapport équimolaire 11, 12. Il existe un large éventail d&#39;applications potentielles en utilisant des liposomes cationiques pour la livraison de gènes in vivo, si le ciblage down-regulation/over-expression des protéines, la livraison des vaccins ou des thérapies anti-tumorales 13-15. Important de se rappelerest que l&#39;efficacité de l&#39;interaction de la membrane l&#39;ADN / ARN cellulaire est régulée par la forme de couplage entre les complexes générés et les lipides membranaires. Ceci suggère que l&#39;adaptation de la composition des lipides aux profils ciblés de la membrane cellulaire peut être bénéfique et entraîner des taux élevés de transfection dans un type cellulaire particulier 6.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2779</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LiposoFast stabilizer (mini-extruder)</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LF-STB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LFM-50</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesterol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C-8667</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Mallinckrodt Chemicals</td>
 <td>4432-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's balanced salts</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H1387</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Round-bottom flask</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>FHB-275-030X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse siRNAITSN - on target </td>
 <td>Dharmacon/ThermoScientific</td>
 <td>J-046912-11</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump</td>
 <td>Ismatec</td>
 <td>REGLO-CDF digital with RHOO pump head</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ventilator</td>
 <td>Hugo Sachs Electronik</td>
 <td>NA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbital</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>B-0500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epon812</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>Discontinued by the manufacturer</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propylene oxide</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>20400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embedding molds</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>69923-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8 nm gold-albumin tracer</td>
 <td></td>
 <td>Prepared in the laboratory as in16</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Pyrex, 100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Modified siRNA, in vivo</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Part of IDEX corp.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>D-79232 March, Germany</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Replaced with Embed812, cat. # 14120</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

long-term silencing of intersectin-1s in mouse lungs by repeated delivery of a specific sirna via cationic liposomes. evaluation of knockdown effects by electron microscopy

Des études antérieures ont montré que knockdown de ITSN-1 (KD ITSN), une protéine endocytose impliqué dans la régulation du poumon perméabilité vasculaire et les cellules endothéliales () la survie, la mort cellulaire par apoptose induite, un obstacle majeur au développement d&#39;un système de culture cellulaire avec prolongée ITSN-1s une inhibition. Utilisant des liposomes cationiques comme porteurs, nous avons exploré le silence des gènes ITSN-1 dans les poumons de souris par l&#39;administration systémique de siRNA ciblant ITSN-1 gène (ITSN de siRNA). Les liposomes cationiques offrent plusieurs avantages pour la livraison de siRNA: coffre-fort avec des doses répétées, non immunogène, non toxique et facile à produire 2. performance des liposomes et l&#39;activité biologique dépend de leur taille, la charge, lipides composition, la stabilité, la dose et la voie d&#39;administration 3 Ici, efficace et ITSN KD spécifique dans les poumons de souris a été obtenu en utilisant une combinaison de bromure d&#39;ammonium dioctadecyl cholestérol et de diméthyle. Administration intraveineusede ITSN de siRNA / complexes liposome cationique transitoire renversé protéines ITSN-1 et l&#39;ARNm dans les poumons de souris au jour 3, qui a récupéré après 3 jours supplémentaires. Profitant des liposomes cationiques comme un transporteur sûr reproductible, l&#39;étude prolongée de 24 jours. Ainsi, le traitement rétro-orbital avec des complexes fraîchement générés a été administrée tous les 3 jours, induisant soutenue ITSN KD tout au long de l&#39;étude 4. tissus de souris recueillies en plusieurs points du temps post-siRNA ITSN ont été soumis à des analyses en microscopie électronique (EM) pour évaluer les effets de la chronique KD ITSN, dans l&#39;endothélium pulmonaire. Imagerie EM à haute résolution nous a permis d&#39;évaluer les changements morphologiques causés par KDITSN dans le lit vasculaire pulmonaire (c. rupture de la barrière endothéliale, le nombre de cavéoles et la régulation positive des voies alternatives de transport a diminué), les caractéristiques non détectables par microscopie optique. Globalement, ces résultats ont établi un importantTANT rôle de ITSN-1 dans la fonction EC et l&#39;homéostasie du poumon, tout en illustrant l&#39;efficacité de la livraison de siRNA-liposomes in vivo.

Taux de protéines ITSN-1 et l&#39;ARNm ont été contrôlés à plusieurs points de temps après la livraison de siRNA ITSN par Western blot et PCR classique et quantitative en 4. Taux de protéines ITSN-1 et l&#39;ARNm dans les poumons siRNA ITSN traités souris étaient environ 75% plus faible par rapport aux contrôles pendant knockdown continue de ITSN-1 pendant 21 jours. Sans ITSN-1s, dynamin-2, un premier partenaire d&#39;interaction du lecteur ITSN-1 et essentiel dans ...

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Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Des injections répétées rétro-orbitaires de complexes cationiques liposomes/siRNA/ITSN-1s chez la souris, toutes les 72 heures pendant 24 jours, fournir efficacement le duplex de siRNA à la microvascularisation pulmonaire de la souris réduire ARNm ITSN-1 et l&#39;expression des protéines de 75%. Cette technique est hautement reproductible dans un modèle animal, n&#39;a pas d&#39;effets indésirables et évite les accidents mortels.

Taire à long terme de intersectine-1 dans les poumons de souris par livraison répétée d&#39;un siRNA spécifique via des liposomes cationiques. Évaluation des effets de sacrifiés par microscopie électronique

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

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