Name: long-term silencing of intersectin-1s in mouse lungs by repeated delivery of a specific sirna via cationic liposomes. evaluation of knockdown effects by electron microscopy
Uploaded: 2013-06-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Elect

Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health Grants R01HL089462 SP unterstützt.

1. Kationische Liposomen Vorbereitung <ol><li> Autoklav eine saubere Rundkolben für lipososmes Zubereitung verwendet werden. </li><li> Bereiten Stammlösungen: <ol class="lalpha"><li> - Man löst 200 mg Dimethyl-dioctadecyl Ammoniumbromid (DOAB) in 10 ml Chloroform mit einer kleinen Glasflasche. </li><li> - Lösen Sie 200 mg Cholesterin in 10 ml Chloroform mit einer kleinen Glasflasche. </li><li> - Vorbereitung und Autoklaven auf 5% Glucose in 100 ml RNA / DNA-ase kostenlos destilliertem Wasser zu sterilisieren. </li...

<ol>
	<li>Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin-1s+regulates+the+mitochondrial+apoptotic+pathway+in+endothelial+cells.">Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells.</a> J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).</li><li>Uddin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipids+used+in+non-viral+gene+delivery+systems.">Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems.</a> Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).</li><li>Barenholz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+lipid+composition+on+the+thermotropic+behavior+and+size+distribution+of+mixed+cationic+liposomes.">Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes.</a> J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).</li><li>Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+caveolae+function+and+upregulation+of+alternative+endocytic+pathways+induced+by+experimental+modulation+of+intersectin-1s+expression+in+mouse+lung+endothelium.">Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium.</a> Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).</li><li>Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+in+vivo+delivery+of+siRNAs:+recent+progress.">Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress.</a> BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).</li><li>Caracciolo, G., Amenitsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+liposome/DNA+complexes:+from+structure+to+interactions+with+cellular+membranes.">Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes.</a> Eur. Biophys. J. , (2012).</li><li>Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+liposomes+as+adjuvants+for+influenza+hemagglutinin:+more+than+charge+alone.">Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).</li><li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+delivery+of+MicroRNA-7-expressing+plasmid+overcomes+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor-resistance+in+lung+cancer+cells.">Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells.</a> Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).</li><li>McLean, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+endothelial+cell+uptake+of+cationic+liposome-DNA+complexes+in+mice.">Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice.</a> Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. (432), 173-178 (2004).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+enhance+bioremediation+of+oil-contaminated+soil.">Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil.</a> J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).</li><li>Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal,+nanoparticle,+and+conjugated+formulations+of+anticancer+agents.">Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents.</a> Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).</li><li>Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacokinetics,+tissue+distribution,+and+therapeutic+effectiveness+of+cisplatin+encapsulated+in+long-circulating,+pegylated+liposomes+(SPI-077)+in+tumor-bearing+mice.">Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice.</a> Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).</li><li>Martino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+siRNA+delivery+by+the+cationic+liposome+DOTAP+in+human+hematopoietic+stem+cells+differentiating+into+dendritic+cells.">Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells.</a> J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delivery+system+targeting+bone+formation+surfaces+to+facilitate+RNAi-based+anabolic+therapy.">A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy.</a> Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).</li><li>Predescu, D., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmalemmal+vesicles+represent+the+large+pore+system+of+continuous+microvascular+endothelium.">Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium.</a> Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).</li><li>Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dap160/intersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis.">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li><li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li></ol>

Basierend auf früheren Studien von anderen 9 und uns 1, 18 haben wir diese Methode für die langfristige knock down von ITSN-1s in vivo durch wiederholte intravenöse Verabreichung (alle 72 h für 24 aufeinanderfolgende Tage) spezifischer siRNA / Liposom-Komplexen veröffentlicht. Dieser experimentelle Ansatz ist effizient, sicher und immer wieder verwendet werden und es kann leicht erweitert werden, um die Beteiligung eines Gens jedes Protein von Interesse in der Lunge und pulmonaler End...

Nackte siRNA kann nicht durch die Zellmembran, das negativ geladen ist, und es ist leicht durch Enzyme abgebaut in Blut, Gewebe und Zellen. Selbst mit kurzem strukturelle Veränderungen, um die Stabilität zu verbessern, ist siRNA Akkumulation am Zielort nach Verabreichung äußerst gering und erfordert eine effiziente intrazelluläre Fahrzeug 5. Kationische Liposomen erwies sich als sicher Nukleinsäuren Träger mit dem Potenzial, große Stücke von DNA / RNA in Zellen übertragen durch Verkapselung und Schutz der Nukleinsäuren vor enzymatischem Abbau 6. Auch kationische Liposomen spontan interagieren mit DNA / RNA, damit die Förderung Gentransfer in die Zellen 2. In jüngerer Zeit Liposomen wurden angewendet, um Impfstoffe und niedrigem Molekulargewicht Drogen 7 liefern. Liposomal Lieferung microRNA-7-exprimierenden Plasmid überwindet epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Inhibitor-Resistenz in Lungenkrebszellen 8. Bei der Ausrichtung dervaskulären Endothel ist die intravenöse Verabreichung notwendig, weil die Komplexe unwahrscheinlich, dass die endotheliale Schranke und extravasieren in dem Interstitium 9 sind. Im Vergleich zu anderen Organen, ECS vom Mikrovaskulatur der Lunge haben die größte Aufnahme und eifrig verinnerlichen kationische Liposomen und DNA / RNA-Komplexen, die Lymphknoten und Peyer-Plaques 9 gefolgt. Intravenöse Lieferung in Tiermodellen der siRNA über retroorbitalen oder Schwanzvene Injektionen ist erwiesen, auch in hohen Konzentrationen, wie 50 mg / kg 10 harmlos. In der Literatur die Zusammensetzung Liposomen, unterscheidet, basierend auf der Formulierung, Lipide und deren äquimolaren Verhältnis 11, 12. Es gibt eine breite Palette von möglichen Anwendungen, die kationische Liposomen für den Gentransfer in vivo, ob Targeting down-regulation/over-expression der Proteine, die Lieferung von Impfstoffen oder Anti-Tumor-Therapien 13-15. Wichtig zu merkenist, dass die Effizienz der DNA / RNA-Zellmembran Wechselwirkung durch die Form Kopplung zwischen erzeugten Komplexe und Membranlipiden geregelt wird. Dies legt nahe, dass Anpassung der Lipide Zusammensetzung auf die gezielte Zellmembran Profilen von Vorteil sein kann und zu einer hohen Transfektionseffizienz in einem bestimmten Zelltyp 6.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2779</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LiposoFast stabilizer (mini-extruder)</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LF-STB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LFM-50</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesterol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C-8667</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Mallinckrodt Chemicals</td>
 <td>4432-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's balanced salts</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H1387</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Round-bottom flask</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>FHB-275-030X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse siRNAITSN - on target </td>
 <td>Dharmacon/ThermoScientific</td>
 <td>J-046912-11</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump</td>
 <td>Ismatec</td>
 <td>REGLO-CDF digital with RHOO pump head</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ventilator</td>
 <td>Hugo Sachs Electronik</td>
 <td>NA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbital</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>B-0500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epon812</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>Discontinued by the manufacturer</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propylene oxide</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>20400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embedding molds</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>69923-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8 nm gold-albumin tracer</td>
 <td></td>
 <td>Prepared in the laboratory as in16</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Pyrex, 100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Modified siRNA, in vivo</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Part of IDEX corp.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>D-79232 March, Germany</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Replaced with Embed812, cat. # 14120</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

long-term silencing of intersectin-1s in mouse lungs by repeated delivery of a specific sirna via cationic liposomes. evaluation of knockdown effects by electron microscopy

Frühere Studien zeigten, dass Knockdown von ITSN-1s (KD ITSN), ein Protein, das in der Regulierung endozytischen Lunge vaskulären Permeabilität und Endothelzellen (ECs) Überleben, induzierte Apoptose, ein wesentliches Hindernis bei der Entwicklung eines Zellkultur-System mit längerer ITSN-1s beteiligt Hemmung 1. Mit kationische Liposomen als Träger, erkundeten wir die Silencing ITSN-1s-Gen in der Maus Lunge durch systemische Verabreichung von siRNA Targeting ITSN-1-Gen (siRNA ITSN). Kationische Liposomen bieten mehrere Vorteile für siRNA Lieferung: Safe mit wiederholter Gabe, nicht immunogen, ungiftig und einfach zu 2 zu erzeugen. Liposomen Leistung und biologische Aktivität von ihrer Größe, Ladung, Lipid-Zusammensetzung, Stabilität, Dosis und Art der Verabreichung 3 Hier eine effiziente und spezifische KD ITSN in Mauslungen wurde unter Verwendung eines Cholesterin-und Dimethyl Dioctadecyl ammoniumbromid Kombination ab. Intravenöse Verabreichungvon siRNA ITSN / kationische Liposomen-Komplexe vorübergehend abgerissen ITSN-1s Protein und mRNA in Mauslungen am Tag 3, die nach weiteren 3 Tagen wiedergefunden. Unter Ausnutzung der kationische Liposomen als wiederholbare sichere Fluggesellschaft, erweitert die Studie für 24 Tage. So wurde retroorbitalen Behandlung mit frisch erzeugten Komplexe verabreicht jeden 3. Tag, induzieren anhaltende KD ITSN während der Studie 4. Maus-Gewebe an mehreren Zeitpunkten nach der siRNA ITSN gesammelt wurden elektronenmikroskopische (EM)-Analysen unterzogen, um die Wirkung einer chronischen KD ITSN auszuwerten, Lunge Endothel. Hochauflösende EM Bildgebung erlaubt es uns, die morphologischen Veränderungen durch KDITSN in der Lunge Gefäßsystem verursacht bewerten (dh Störung der endothelialen Barriere, verringerte Anzahl von Caveolae und Hochregulation alternative Transportwege), Eigenschaften nicht nachweisbar durch Lichtmikroskopie. Insgesamt diese Erkenntnisse etabliert eine wichtigewichtige Rolle von ITSN-1s in der ECs Funktion und Lunge Homöostase, während, die die Wirksamkeit von siRNA-Liposomen Lieferung in vivo.

ITSN-1s Protein-und mRNA-Spiegel wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der siRNA ITSN Lieferung durch Western-Blot-und konventionellen und quantitative PCR, wie in 4 überwacht. ITSN-1s Protein-und mRNA-Level in siRNA-behandelten Maus ITSN Lungen waren etwa 75% niedriger unter Bezugnahme auf die Kontrollen während der kontinuierlichen Knockdown von ITSN-1s für 21 Tage. Ohne ITSN-1s, Dynamin-2 ist ein wichtiger Interaktionspartner von ITSN-1s und wichtiger Akteur in Ablösung von Cav...

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Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Wiederholte retroorbitalen Injektionen kationische liposomes/siRNA/ITSN-1s Komplexe in Mäusen, alle 72 Stunden für 24 Tage, effizient die siRNA-Duplex zum Mauslunge Mikrovaskulatur Reduzierung ITSN-1s mRNA und Protein-Expression von 75%. Diese Technik ist in hohem Maße reproduzierbar in einem Tiermodell, hat keine Nebenwirkungen und Todesfälle verhindert.

Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Langfristige Imaging Säugetierzellen mit Wide-Field-Mikroskopie

Forschung

Biologie

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