Name: long-term silencing of intersectin-1s in mouse lungs by repeated delivery of a specific sirna via cationic liposomes. evaluation of knockdown effects by electron microscopy
Uploaded: 2013-06-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Elect

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health Grants R01HL089462 til SP.

En. Kationiske Liposomes Forberedelse <ol><li> Autoklaver en ren rundkolbe som skal brukes for fremstilling lipososmes. </li><li> Forbered lager løsninger: <ol class="lalpha"><li> - Oppløs 200 mg dimetyl-dioctadecyl ammoniumbromid (DOAB) i 10 ml kloroform ved hjelp av en liten glassflaske. </li><li> - Oppløs 200 mg kolesterol i 10 ml kloroform ved hjelp av en liten glassflaske. </li><li> - Utarbeide og autoklaver å sterilisere 5% glukose i 100 ml av RNA / DNA-ase gratis destillert vann. </li></ol></li><li> Skyll r...

<ol>
	<li>Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin-1s+regulates+the+mitochondrial+apoptotic+pathway+in+endothelial+cells.">Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells.</a> J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).</li><li>Uddin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipids+used+in+non-viral+gene+delivery+systems.">Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems.</a> Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).</li><li>Barenholz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+lipid+composition+on+the+thermotropic+behavior+and+size+distribution+of+mixed+cationic+liposomes.">Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes.</a> J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).</li><li>Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+caveolae+function+and+upregulation+of+alternative+endocytic+pathways+induced+by+experimental+modulation+of+intersectin-1s+expression+in+mouse+lung+endothelium.">Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium.</a> Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).</li><li>Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+in+vivo+delivery+of+siRNAs:+recent+progress.">Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress.</a> BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).</li><li>Caracciolo, G., Amenitsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+liposome/DNA+complexes:+from+structure+to+interactions+with+cellular+membranes.">Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes.</a> Eur. Biophys. J. , (2012).</li><li>Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+liposomes+as+adjuvants+for+influenza+hemagglutinin:+more+than+charge+alone.">Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).</li><li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+delivery+of+MicroRNA-7-expressing+plasmid+overcomes+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor-resistance+in+lung+cancer+cells.">Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells.</a> Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).</li><li>McLean, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+endothelial+cell+uptake+of+cationic+liposome-DNA+complexes+in+mice.">Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice.</a> Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. (432), 173-178 (2004).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+enhance+bioremediation+of+oil-contaminated+soil.">Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil.</a> J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).</li><li>Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal,+nanoparticle,+and+conjugated+formulations+of+anticancer+agents.">Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents.</a> Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).</li><li>Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacokinetics,+tissue+distribution,+and+therapeutic+effectiveness+of+cisplatin+encapsulated+in+long-circulating,+pegylated+liposomes+(SPI-077)+in+tumor-bearing+mice.">Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice.</a> Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).</li><li>Martino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+siRNA+delivery+by+the+cationic+liposome+DOTAP+in+human+hematopoietic+stem+cells+differentiating+into+dendritic+cells.">Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells.</a> J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delivery+system+targeting+bone+formation+surfaces+to+facilitate+RNAi-based+anabolic+therapy.">A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy.</a> Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).</li><li>Predescu, D., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmalemmal+vesicles+represent+the+large+pore+system+of+continuous+microvascular+endothelium.">Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium.</a> Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).</li><li>Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dap160/intersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis.">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li><li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li></ol>

Basert på tidligere studier publisert av andre ni og en oss, 18 vi utviklet denne metoden for langsiktig slå ned av ITSN-1s in vivo ved gjentatt intravenøs administrasjon (hver 72 timer, i 24 sammenhengende dager) av spesifikke siRNA / liposomoppløsninger komplekser. Dette eksperimentelle tilnærmingen er effektiv, kan brukes trygt og gjentatte ganger, og det kan enkelt utvides til å studere involvering av et gen som koder for et protein av interesse i lunge endotelet og pulmonal home...

Naken siRNA kan ikke trenge gjennom cellemembranen, blir negativt ladet, og det er lett degradert av enzymer i blod, vev og celler. Selv med nylig strukturelle modifikasjoner for å øke stabiliteten, er siRNA opphopning ved målsetet etter administrering ekstremt lav og krever en effektiv intracellulær kjøretøy 5.. Kationiske liposomer fremkom som trygge nukleinsyrer bærere med mulighet for å overføre store biter av DNA / RNA i celler ved å innkapsle og beskytte nukleinsyrer fra enzymatisk degradering 6.. Også kationiske liposomer spontant samhandle med DNA / RNA, noe som fremmer genoverføring til cellene 2. Mer nylig liposomer har blitt brukt til å levere vaksiner og lav-molekylær-vekt narkotika syv. Liposomal levering av microRNA-7-uttrykkende plasmid overvinner epidermal vekstfaktor-reseptor-tyrosinkinase-inhibitor-resistens i lungekreft celler 8. Når rettet motvaskulær endotel, er det intravenøs levering vesentlig fordi kompleksene er usannsynlig å krysse den endoteliske barrieren og extravasate inn til interstitium 9.. Ved sammenligning med andre organer ECS fra microvasculature av lungen har størst opptak og ivrig internalisere kationisk liposom og DNA / RNA-komplekser, etterfulgt av lymfeknuter og Peyer sin flekker 9. Intravenøs levering i gnager modeller av siRNA via retro-orbital eller hale vein injeksjoner har blitt bevist ufarlig selv i høye konsentrasjoner, for eksempel 50 mg / kg 10. I den publiserte litteratur sammensetningen av kationiske liposomer forskjellig, basert på formulering lipider og deres ekvimolart forhold 11, 12. Det er et bredt spekter av mulige bruksområder ved hjelp av kationiske liposomer for genet levering in vivo, enten målretting down-regulation/over-expression av proteiner, levering av vaksiner eller anti-tumor terapi 13-15. Viktig å huskeer at effektiviteten av DNA / RNA-cellulære membran interaksjon reguleres av formen kopling mellom tilført komplekser og membranlipider. Dette tyder på at skreddersy lipider sammensetningen til målrettede cellulære membransystemer profiler kan være gunstig og resultere i høye priser av transfeksjon i en bestemt celletype seks.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2779</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LiposoFast stabilizer (mini-extruder)</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LF-STB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LFM-50</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesterol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C-8667</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Mallinckrodt Chemicals</td>
 <td>4432-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's balanced salts</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H1387</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Round-bottom flask</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>FHB-275-030X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse siRNAITSN - on target </td>
 <td>Dharmacon/ThermoScientific</td>
 <td>J-046912-11</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump</td>
 <td>Ismatec</td>
 <td>REGLO-CDF digital with RHOO pump head</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ventilator</td>
 <td>Hugo Sachs Electronik</td>
 <td>NA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbital</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>B-0500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epon812</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>Discontinued by the manufacturer</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propylene oxide</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>20400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embedding molds</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>69923-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8 nm gold-albumin tracer</td>
 <td></td>
 <td>Prepared in the laboratory as in16</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Pyrex, 100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Modified siRNA, in vivo</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Part of IDEX corp.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>D-79232 March, Germany</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Replaced with Embed812, cat. # 14120</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

long-term silencing of intersectin-1s in mouse lungs by repeated delivery of a specific sirna via cationic liposomes. evaluation of knockdown effects by electron microscopy

Tidligere studier viste at knockdown av ITSN-1s (KD ITSN), en endocytic protein som er involvert i regulering av lunge vaskulær permeabilitet og endotelceller (ECS) overlevelse, indusert celledød ved apoptose, et stort hinder i å utvikle en cellekultur system med langvarig ITSN-1s hemming en. Ved hjelp av kationiske liposomer som bærere, utforsket vi stanse all ITSN-1s genet i mus lungene ved systemisk administrasjon av siRNA rettet ITSN-1 genet (siRNA ITSN). Kationiske liposomer tilbyr flere fordeler for siRNA levering: safe med gjentatt dosering, nonimmunogenic, ikke giftig, og lett å produsere to. Liposomer ytelse og biologisk aktivitet avhenge av deres størrelse, ladning, lipidsammensetning, stabilitet, dose og administreringsmåten 3 Her, effektiv og spesifikk KD ITSN i muselunger har blitt oppnådd ved bruk av en kolesterol-og dimetyl dioctadecyl ammoniumbromid kombinasjon. Intravenøs leveringav siRNA ITSN / kationiske liposomoppløsninger komplekser forbigående slått ned ITSN-1s protein og mRNA i muselunger på dag 3, som utvinnes etter ytterligere tre dager. Benytte seg av de kationiske liposomer som en repeterbare sikker transportør, utvidet studie i 24 dager. Dermed ble retro-orbital behandling med fersk genererte komplekser administrert hver tredje dag, indusere vedvarende KD ITSN gjennom hele studien fire. Mus vev samlet på flere tidspunkter etter siRNA ITSN ble utsatt for elektronmikroskopi (EM) analyser for å evaluere effektene av kronisk KD ITSN, i lunge endotel. Høyoppløselig EM bildebehandling tillatt oss å vurdere morfologiske endringer forårsaket av KDITSN i lungene vaskulære sengen (dvs. forstyrrelser i endotelial barriere, redusert antall caveolae og oppregulering av alternative transportløsninger trasé), egenskaper som ikke påvises ved lysmikroskopi. Totalt disse funnene etablert et viktigtig rolle ITSN-1s i egenkapitalbevis funksjon og lunge homeostase, mens illustrerer effekten av siRNA-liposomer levering in vivo.

ITSN-1s protein og mRNA nivåene ble målt på flere tidspunkter etter siRNA ITSN levering av Western blot og konvensjonell og kvantitativ PCR som i fire. ITSN-1s protein og mRNA nivåer i siRNA ITSN-behandlede muselunger var omtrent 75% lavere ved henvisning til kontroller under kontinuerlig knockdown av ITSN-1s i 21 dager. Uten ITSN-1s, dynamin-2, er en viktig samspill partner av ITSN-1s og viktig aktør i avløsning av caveolae fra plasma membranen ikke effektivt rekruttert til endocy...

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Elect

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Gjentatte retro-orbital injeksjoner av kationiske liposomes/siRNA/ITSN-1s komplekser i mus, hver 72. time i 24 dager, effektivt levere siRNA duplex til musen lunge microvasculature redusere ITSN-1s mRNA og protein uttrykk med 75%. Denne teknikken er svært reproduserbare i en dyremodell, og har ingen bivirkninger og unngår tap av menneskeliv.

Langsiktig stanse av Intersectin-1s i muselunger etter Gjentatt Levering av en spesifikk siRNA via Kationiske Liposomes. Evaluering av Knockdown Effekter av elektronmikroskopi

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Anrikning av Spermatogonial Stem og stamceller (SSCS) i Kultur for Utledning av langsiktige Voksen Mus SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Multilayer Montering for Long-term Lett Sheet Mikroskopi av Sebrafisk

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Visualisering av ATP synthase dimer i Mitokondrier av Electron Cryo-tomografi

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

I Vivo siRNA Transfection og Gene Knockdown i Spinal Cord via Rapid Noninvasiv Lumbar Intratekal Injeksjoner i Mus

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-elektron mikroskopi prøven forberedelse ved hjelp av en Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Korrelerende Confocal og 3D Elektronmikroskopi av en bestemt Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fecal Glukokortikoid analyse: Ikke-invasiv Adrenal Monitoring i Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...