Name: long-term silencing of intersectin-1s in mouse lungs by repeated delivery of a specific sirna via cationic liposomes. evaluation of knockdown effects by electron microscopy
Uploaded: 2013-06-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Elect

Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения R01HL089462 Гранты для SP.

1. Катионные липосомы подготовка <ol><li> Автоклав чистую круглодонную колбу, которые будут использоваться для подготовки lipososmes. </li><li> Подготовка исходных растворов: <ol class="lalpha"><li> - Растворить 200 мг диметил диоктадецил бромид (Doab) в 10 мл хлороформа с помощью небольшой стеклянной бутылки. </li...

<ol>
	<li>Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin-1s+regulates+the+mitochondrial+apoptotic+pathway+in+endothelial+cells.">Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells.</a> J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).</li><li>Uddin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipids+used+in+non-viral+gene+delivery+systems.">Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems.</a> Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).</li><li>Barenholz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+lipid+composition+on+the+thermotropic+behavior+and+size+distribution+of+mixed+cationic+liposomes.">Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes.</a> J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).</li><li>Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+caveolae+function+and+upregulation+of+alternative+endocytic+pathways+induced+by+experimental+modulation+of+intersectin-1s+expression+in+mouse+lung+endothelium.">Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium.</a> Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).</li><li>Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+in+vivo+delivery+of+siRNAs:+recent+progress.">Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress.</a> BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).</li><li>Caracciolo, G., Amenitsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+liposome/DNA+complexes:+from+structure+to+interactions+with+cellular+membranes.">Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes.</a> Eur. Biophys. J. , (2012).</li><li>Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+liposomes+as+adjuvants+for+influenza+hemagglutinin:+more+than+charge+alone.">Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).</li><li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+delivery+of+MicroRNA-7-expressing+plasmid+overcomes+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor-resistance+in+lung+cancer+cells.">Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells.</a> Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).</li><li>McLean, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+endothelial+cell+uptake+of+cationic+liposome-DNA+complexes+in+mice.">Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice.</a> Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. (432), 173-178 (2004).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+enhance+bioremediation+of+oil-contaminated+soil.">Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil.</a> J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).</li><li>Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal,+nanoparticle,+and+conjugated+formulations+of+anticancer+agents.">Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents.</a> Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).</li><li>Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacokinetics,+tissue+distribution,+and+therapeutic+effectiveness+of+cisplatin+encapsulated+in+long-circulating,+pegylated+liposomes+(SPI-077)+in+tumor-bearing+mice.">Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice.</a> Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).</li><li>Martino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+siRNA+delivery+by+the+cationic+liposome+DOTAP+in+human+hematopoietic+stem+cells+differentiating+into+dendritic+cells.">Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells.</a> J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delivery+system+targeting+bone+formation+surfaces+to+facilitate+RNAi-based+anabolic+therapy.">A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy.</a> Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).</li><li>Predescu, D., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmalemmal+vesicles+represent+the+large+pore+system+of+continuous+microvascular+endothelium.">Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium.</a> Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).</li><li>Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dap160/intersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis.">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li><li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li></ol>

Основываясь на предыдущих исследованиях, опубликованных другими 9 и 1, нам, 18 мы разработали эту методику для долгосрочного сбить из ITSN-1S в естественных условиях повторных внутривенного введения (каждые 72 ч, в течение 24 дней подряд) специфических миРНК / липосомы комплек...

Голые миРНК не может проникать через клеточную мембрану электрический заряд, и она легко разрушается ферментами в крови, тканей и клеток. Даже недавно структурных модификаций для улучшения стабильности, миРНК накопление в сайте-мишени после введения чрезвычайно низка и требует эффективного внутриклеточных транспортных средств 5. Катионные липосомы стала безопасной нуклеиновых кислот носителей с потенциалом для передачи больших фрагментов ДНК / РНК в клетки путем инкапсуляции и защиты нуклеиновых кислот из ферментативного расщепления 6. Кроме того, катионные липосомы спонтанно взаимодействуют с ДНК / РНК, тем самым способствуя переноса генов в клетки 2. Совсем недавно липосомы были применены для доставки вакцин и низким молекулярным весом препаратов 7. Липосомальной доставки микроРНК-7, экспрессирующих плазмид преодолевает рецептора эпидермального фактора роста ингибитор тирозинкиназы сопротивление в клетках рака легких 8. При ориентациисосудистого эндотелия, внутривенного введения важно, потому что комплексы вряд ли пересечь барьер эндотелиальных и вытекать из сосудов в ткань и интерстиций 9. По сравнению с другими органами, КЕ из микрососудов легких имеют наибольшее поглощение и жадно интернализации катионной липосомы и ДНК / РНК комплексов, а затем в лимфатических узлах и пейеровых бляшек 9. Внутривенное доставки на моделях грызунов миРНК через ретро-орбитальной или хвостовой вены инъекций было доказано безвредны даже в высоких концентрациях, например, 50 мг / кг 10. В опубликованной литературе состав катионные липосомы отличается на основе липидов разработки и их эквимол рном соотношении 11, 12. Существует широкий спектр потенциальных приложений с использованием катионных липосом для доставки генов в естественных условиях, будь таргетинга down-regulation/over-expression белков, поставка вакцин или противоопухолевой терапии 13-15. Важно помнить,является то, что эффективность ДНК / РНК-клеточное взаимодействие мембраны регулируется форма связи между генерируется комплексов и мембранных липидов. Это предполагает, что пошива липиды состав к целевой сотовой профилей мембрана может быть полезно и в результате высокий уровень трансфекции в конкретном типе клеток 6.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2779</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LiposoFast stabilizer (mini-extruder)</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LF-STB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LFM-50</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesterol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C-8667</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Mallinckrodt Chemicals</td>
 <td>4432-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's balanced salts</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H1387</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Round-bottom flask</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>FHB-275-030X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse siRNAITSN - on target </td>
 <td>Dharmacon/ThermoScientific</td>
 <td>J-046912-11</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump</td>
 <td>Ismatec</td>
 <td>REGLO-CDF digital with RHOO pump head</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ventilator</td>
 <td>Hugo Sachs Electronik</td>
 <td>NA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbital</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>B-0500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epon812</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>Discontinued by the manufacturer</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propylene oxide</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>20400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embedding molds</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>69923-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8 nm gold-albumin tracer</td>
 <td></td>
 <td>Prepared in the laboratory as in16</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Pyrex, 100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Modified siRNA, in vivo</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Part of IDEX corp.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>D-79232 March, Germany</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Replaced with Embed812, cat. # 14120</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

long-term silencing of intersectin-1s in mouse lungs by repeated delivery of a specific sirna via cationic liposomes. evaluation of knockdown effects by electron microscopy

Предыдущие исследования показали, что нокдаун ITSN-1S (KD ITSN), эндоцитотический белок, участвующий в регуляции проницаемости сосудов легких и эндотелиальные клетки (ECS) выживание, индуцированного апоптоза, основным препятствием в развитии системы клеточных культур с длительным ITSN-1S торможения 1. Использование катионных липосом в качестве носителей, мы исследовали молчание ITSN-1 гена в легких мышей при системном введении миРНК ориентации ITSN-1 ген (миРНК ITSN). Катионные липосомы обладают рядом преимуществ для доставки миРНК: Допускаются повторные дозировки, неиммуногенные, нетоксичны и легко производить 2. Липосомы производительности и биологической активности зависит от их размера, заряда, липидный состав, стабильность, доза и способ введения 3 Здесь, эффективный и специфический KD ITSN в легких мышей были получены с использованием холестерина и диметил диоктадецил сочетание бромид аммония. Внутривенного введениямиРНК ITSN / катионной липосомы комплексы временно сбил ITSN-1 белка и мРНК в легких мышей на 3 день, который восстановился после еще ​​3 дня. Воспользовавшись тем, что катионные липосомы как безопасного перевозчика, повторяемые, исследование продлен на 24 дней. Таким образом, ретроорбитальной лечения с только что созданной комплексы вводили каждые 3 дня, вызывая устойчивый KD ITSN на протяжении всего исследования 4. Мышь ткани, собранные в нескольких временных точках после миРНК ITSN подвергали электронной микроскопии (ЭМ) анализы, чтобы оценить эффекты хронического KD ITSN, в легких эндотелия. Высокое разрешение изображения EM позволило нам оценить морфологические изменения, вызванные KDITSN в постели легких сосудистого (т.е. разрушение эндотелиального барьера, снижение количества кавеолы ​​и активацию альтернативные пути транспортировки), характеристики необнаруженными с помощью световой микроскопии. Общая этих выводов установленным важноеважную роль ITSN-1 в функции ЭКС и легких гомеостаза, а иллюстрирующие эффективность миРНК-липосомы доставки в естественных условиях.

ITSN-1 белка и мРНК наблюдали в нескольких временных точках после доставки миРНК ITSN методом вестерн-блоттинга и обычных и количественной ПЦР, как в 4. ITSN-1 белка и мРНК в миРНК ITSN обработанных легких мышей были приблизительно на 75% ниже со ссылкой на управление во время неп?...

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Elect

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Повторные ретро-орбитальной инъекции катионные комплексы liposomes/siRNA/ITSN-1s у мышей, каждые 72 часа в течение 24 дней, эффективной доставки миРНК дуплекс с микрососудов легких у мышей снижение ITSN-1 мРНК и экспрессию белка на 75%. Этот метод хорошо воспроизводимый в животной модели, не имеет побочных эффектов и позволяет избежать летальных исходов.

Долгосрочные молчание интерсектин-1 в легких мышей по повторной сдачи Конкретные миРНК через катионные липосомы. Оценка нокдаун эффекты электронной микроскопией

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Долгосрочные изображений клетках млекопитающих использованием широкого поля микроскопии

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Серийный обогащению сперматогониальные стволовых и клеток-предшественников (SSC) в культуре Вывод Долгосрочные взрослых мышей линии Юг-Юг

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Многослойные Монтаж для долгосрочного Light Sheet микроскопии данио рерио

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Визуализация АТФ-синтазы димеров в митохондриях с помощью электронной Cryo-томографии

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

В Vivo миРНК трансфекции и Нокдаун гена в спинного мозга через Rapid неинвазивной поясничного Intrathecal инъекций у мышей

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Крио-электронной микроскопии Изготовление образцов с помощью электронного луча, сфокусированного

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Корреляционный конфокальной и 3D Электронная микроскопия конкретного чувственного Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Фекальные глюкокортикоиды Анализ: безоперационная Надпочечная Мониторинг в Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...