Name: direct imaging of er calcium with targeted-esterase induced dye loading (ted)
Uploaded: 2013-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED at JoVE.com

Dette arbejde er blevet støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 og Friedrich-Baur-Stiftung. Vi vil gerne takke Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute Laboratories ved University of California, San Diego for at give os Tag-RFP-T2. Vi heldigvis erkender David Baltimore, California Institute of Technology, Pasadena, og Didier Trono, University of Geneva, Genève, for at give os den lentivirale plasmider FUGW og psPAX2/pMD2.G.

Denne protokol introducerer TED anvendt på cellelinier, hippocampusneuroner og corticale gliaceller. TED ydeevne er bedst, når TED vektorer udtrykkes stabilt, for eksempel ved lentivirusvektorer. En skematisk oversigt over TED metoden er vist i fig. 4. 1.. Fremstilling af opløsninger Følgende bør fremstilles før start og kan gemmes som angivet. Vi plejer at bruge steriliseret glas og plast og autoklaveret vand. <ol><li> Forbered HEPES-Rin...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).</li><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+calcium+signaling+in+neurons.">Local calcium signaling in neurons.</a> Neuron. 40, 331-346 (2003).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21, 13-26 (1998).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73, 862-885 (2012).</li><li>Neher, E., Sakaba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+calcium+ions+in+the+regulation+of+neurotransmitter+release.">Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release.</a> Neuron. 59, 861-872 (2008).</li><li>Jaepel, J., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+ER+calcium+dynamics.">Capturing ER calcium dynamics.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).</li><li>Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+the+calcium+store+in+the+endoplasmic+reticulum+of+neurons.">Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons.</a> Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).</li><li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function.">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).</li><li>Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+Ca2++from+a+nonmitochondrial+intracellular+store+in+pancreatic+acinar+cells+by+inositol-1,4,5-trisphosphate.">Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate.</a> Nature. 306, 67-69 (1983).</li><li>Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off-regulation+of+phospholipase+C-gamma+1-mediated+signal+transduction.">On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction.</a> Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP+channels+as+cellular+sensors.">TRP channels as cellular sensors.</a> Nature. 426, 517-524 (2003).</li><li>Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIMulating+store-operated+Ca(2+)+entry.">STIMulating store-operated Ca(2+) entry.</a> Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).</li><li>Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+cellular+stress+through+STIM+proteins.">Sensing cellular stress through STIM proteins.</a> Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).</li><li>Erdmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+calmodulin+with+Sec61alpha+limits+Ca2++leakage+from+the+endoplasmic+reticulum.">Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).</li><li>Sch&#228;uble, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiP-mediated+closing+of+the+Sec61+channel+limits+Ca(2+)+leakage+from+the+ER.">BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER.</a> The EMBO Journal. , (2012).</li><li>Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum+as+an+integrator+of+multiple+dendritic+events.">The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).</li><li>Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+compartments+serve+multiple+hippocampal+dendritic+spines+from+a+widespread+rather+than+a+local+store+of+recycling+membrane.">Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane.</a> The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).</li><li>Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+distribution+of+endoplasmic+reticulum+controls+metabotropic+signaling+and+plasticity+at+hippocampal+synapses.">Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).</li><li>Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+network+of+endoplasmic+reticulum+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J. Vis. Exp. (23), e1067 (2009).</li><li>Lang, S., Sch&#228;uble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+calcium+imaging+combined+with+siRNA+mediated+gene+silencing+identifies+Ca(2)(+)+leak+channels+in+the+ER+membrane+and+their+regulatory+mechanisms.">Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms.</a> J. Vis. Exp. (53), e2730 (2011).</li><li>Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+forward+to+seeing+calcium.">Looking forward to seeing calcium.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).</li><li>Mank, M., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators.">Genetically encoded calcium indicators.</a> Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamic+changes+in+free+Ca2++concentration+in+the+endoplasmic+reticulum+of+intact+cells.">Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells.</a> The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).</li><li>Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+environmental+sensitivity+of+yellow+fluorescent+protein.+Mechanism+and+applications.">Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).</li><li>Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++shuttling+between+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+underlying+Ca2++oscillations.">Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations.</a> EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2++analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor.">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).</li><li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+in+situ+measurement+of+calcium+in+intracellular+inositol+1,4,5-trisphosphate-sensitive+stores+using+the+fluorescent+indicator+mag-fura-2.">Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).</li><li>Solovyova, N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+free+calcium+in+the+neuronal+endoplasmic+reticulum:+an+overview+of+modern+approaches.">Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches.</a> Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).</li><li>Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+dynamics+in+the+lumen+of+the+endoplasmic+reticulum+in+sensory+neurons:+direct+visualization+of+Ca(2+)-induced+Ca(2+)+release+triggered+by+physiological+Ca(2+)+entry.">Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry.</a> The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).</li><li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum.">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).</li><li>Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, (2010).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+photostability+of+bright+monomeric+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5, 545-551 (2008).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zufferey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery.">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).</li><li>Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM+dyes+enter+via+a+store-operated+calcium+channel+and+modify+calcium+signaling+of+cultured+astrocytes.">FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).</li><li>Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium measurement methods. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), 147-167 (2010).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+esterase-ester+pair+for+targeting+small+molecules+with+cellular+specificity.">Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).</li><li>Samtleben, S., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+for+direct+ER+calcium+imaging+with+targeted-estersase+induced+dye+loading.">Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading.</a> , (2012).</li></ol>

De fordele og ulemper ved TED metoden er blevet drøftet indgående i de seneste publikationer 34,35. Sammenlignet med andre ovenfor beskrevne fremgangsmåder, TED omgår problemet med at forstyrre og perfusion af cellerne. Desuden to aspekter skal fremhæves. Princippet om TED for ER calcium billeddannelse kræver (1..) Den målrettede ekspression af en aktiv carboxylesterase i ER lumen ved hjælp af TED vektorkonstruktioner og (2). Effektiv og præferentielle frigivelse af lav-affinitet syntetiske AM-estere...

For at løse fysiologiske calcium svarene fra ER, vi udviklet en ny strategi for at forbedre fældefangst af syntetiske calcium følsomme farvestoffer ind på skadestuen. Metoden gør det muligt direkte, ikke-forstyrrende realtidsovervågning af frit ER calcium i overværelse af ekstracellulært calcium. Funktion og signalering af ER Calcium Calcium-signaler findes i forskellige celletyper, fx muskel-celler, neuroner og gliaceller og deres funktioner spænder fra mediere muskelsammentrækning til en involvering i synaptisk transmission i indlæring og hukommelse 1,2. Ændringer i fri calciumkoncentration er af høj videnskabelig interesse, fordi calcium er involveret i reguleringen af gentranskription, celledeling, neuronal uro, celledød og andre celle signalering begivenheder 1-7. Alle disse cellulære calcium signaler er funktionelt forbundet og bidrager til intracellulær calciumbutik dynamik 8-10. Et fælles træk blandt alle calcium signaler er strømmen af ​​calcium mellem det ekstracellulære rum, cytosolen og organeller, hovedsagelig ER og mitokondrier. Dette forårsager dynamiske ændringer i calciumkoncentration i disse organeller, som afføles af forskellige signalsystemer komponenter. I almindelighed, calciumkoncentrationen i ER svinger mellem 100-800 uM i cytosolen calciumkoncentrationen er tæt på 100 nM, og i det ekstracellulære rum koncentrationen er omkring 1-2 mm. Følgelig er der er en høj kemisk drivkraft for calcium strømme mod cytosolen 2,9,10. De mest almindeligt undersøgte ER-afledte calcium signaler afhænger stimulering af G-protein-koblede receptorer (GPCR), som derefter aktiverer phospholipase C (PLC). PLC gengæld producerer inositol 1,4,5-triphosphat (IP3) 1.. Efter binding af IP3 til sin receptor (IP 3-Rec, figur 1) i ER-membranen er calciumioner frigøres fra ER lumen. Historisk, IP3-medieret calciumfrigivelse fra ER var første - selvom indirekte - målt i acinar pancreasceller ved Streb m.fl. i 1983 11... Denne publikation foreslået for første gang en signaleringskaskade involverer acetylcholin, phospholipase C, og IP3. På denne måde af calcium frigivelse generelt betegnes IP 3-induceret calcium frigivelse (IiCR) (Figur 1). Kinase-afhængig aktivering af phospholipase Cy ved receptor tyrosin kinaser links virkningen af vækstfaktorer og neurotrofiske faktorer til ER calcium signalering efter IP 3 elevation 12.. Ud over IiCR, kan calcium elevation være medieret af ionotropisk calcium-indtrængningen, fx via spændingsstyrede calciumkanaler (Ca V) og efterfølgende calcium-induceret calcium frigivelse (CICR) ved ryanodine receptors (Ryr). IiCR og CICR er fysiologisk bundet til butik-opererede calcium-indtrængningen (SOCE). SOCE omfatter virkningen af ​​STIM (stroma interagerende molekyle), som er en sensor for ER calcium frigivelse. STIM har vist sig at stimulere ekstracellulært calcium-indtrængningen gennem forbigående receptor potentielle kanaler (Trp) 13, Orai calciumkanaler 14 og endda spænding kalciumkanaler 15 (figur 1). Tab af ER calcium dynamisk reddet af virkningen af ​​Sarco-endoplasmatiske reticulum calcium ATPase (SERCA), som aktivt pumper calcium tilbage ind på skadestuen. Blokering af SERCA med lægemidler såsom thapsigargin afslører en kontinuerlig tab af ER calcium til den cytosoliske rum. Dette ER calcium &quot;lækage&quot; er forårsaget af ER intramembrane pore komplekser såsom Sec61 protein kompleks 16,17 (fig. 1). I 1998 offentliggjorde Berridge en model, &quot;neuron inden en neuron model&quot;, which foreslår et princip fysiologisk rolle for ER i at integrere neuronal calcium 5.. Denne model anser eksistensen af et kontinuerligt ER membran-system danner en intracellulær &quot;billede&quot; af neuronale plasmamembranen 5.. Denne binære eukaryot membran system blev hævdet at være en grundlæggende forudsætning for tidslige og rumlige integration af hurtige og langsomme calcium signaler i neuroner. Calcium-signaler, der opstår enten samtidig eller senere i forskellige pigge eller dendritter af samme neuron tillægges til cellens soma eller kerne via ER, hvor de opsummerede 5,18. Derefter kan deres sum have indvirkning på, ophidselse af neuron, regulering af gentranskription eller integration af signalleringskaskader. Således ER støtter integrationen af ​​calcium-signaler. En forudsætning for dette koncept er kontinuitet ER i en enkelt celle, som er blevet hævdet af flere undersøgelser, og som er blevet bevist i det mindste for somato-dendritic områder og kort afstand axonale fremspring 19-21. Om der er ER kontinuitet i lange axonale fremskrivninger er et spørgsmål om forhandling. Strategier til at måle strømmen af ​​fri calcium over-membranen Calcium signaler hyppigst overvåges i cytosolen 22,23. Derfor kan det ikke let kan skelnes om Ca2 + strømmer ind i cytosolen fra ekstracellulære eller fra intracellulære lagre 6,24. For at overvinde denne begrænsning, har metodiske strategier for direkte ER calcium imaging blevet udviklet. Sammenfattende er de følgende strategier anvendt: (1) ER-målrettet gensplejsede protein-indikatorer 25-27 Protein-baserede lav affinitet Ca2 + indikatorerne bioluminescerende protein aequorin eller GFP i kombination med en kalciumfølende protein.. Disse gensplejsede Ca2 + indikatorer (GECIs) kanmålrettes til skadestuen ved hjælp af et signal-peptid og er aktivt holdt i ER ved hjælp af en tilbageholdelse og genfinding motiv. Fælles ER Ca 2 + indikatorer base på Cameleon princip og er Cameleon YC4.3 26,28, Cameleon split YC7.3ER 29 og Cameleon D1 30. (2) Direkte esterase-baserede farvestof lastning af AM-ester med lav affinitet Ca 2 + indikatorer 31,32. AM-derivater af indikatorfarvestoffer (Mag-fura2-AM, Mag-Fluo4-AM eller Fluo5N-AM) passere biologiske membraner i en lipofil, calcium-ufølsomme tilstand. Derefter, i cytosolen samt i ER, frigiver endogene esteraser spalter i AM-estergruppen og Ca2 + indikator, efterlader en vis mængde aktiv farvestof i cytosolen og i ER. Derfor er denne fremgangsmåde nyttig under betingelser med en høj calciumkoncentration i ER, så længe den cytosoliske calciumkoncentration forbliver godt under debeskyttelse grænse for lav-affinitet indikatorer, især under karakteristiske calcium signaler (fx nM til lave uM). (3) AM-ester belastning i kombination med plasma membranpermeabilisering 32.. Tiloversbleven cytosolisk Ca2 + indikator fjernes ved plasma membranpermeabilisering med små mængder af en &quot;mild&quot; rengøringsmiddel (fx saponin) i en kunstig intracellulær puffer. Således kan intracellulære membraner stimuleres, f.eks med IP3 i den intracellulære puffer, direkte gennem &quot;porer&quot; i plasmamembranen. (4) Dialyse af cytosolen under helcelle-konfiguration og samtidige målinger af Ca 2 + i ER lumen og cytosolen 32,33. En celle først fyldt med en lav-affinitet Ca2 +-indikator (f.eks Mag-fura2- AM, ratiometrisk, UV-lys). Bagefter, med hjælp af et plaster pipette resterende CYTosolic lav-affinitet Ca2 + indikator dialyseres ud af cytosolen med en buffer indeholdende en høj affinitet Ca2 +-indikator (f.eks Fluo-3, synligt lys). Denne strategi muliggør samtidig optagelse af cytosoliske og ER afledte signaler. (5) Målrettet-esterase-induceret farvestof loading 8,34. En carboxylesterase (CES) er målrettet til lumen af ER og giver en høj esteraseaktivitet til effektiv indfangning af AM-ester form af lav-affinitet Ca2 + indikatorer. Målrettet-esterase induceret farvestof belastning (TED) At forbedre målretning af lav-affinitet Ca2 + indikatorer til skadestuen lumen blev TED udviklet. TED kræver overekspression af en ER målrettet mus carboxylesterase (CES2) (figur 2), som opnås ved ekspressionskonstruktioner. Celler, som udtrykker en rekombinant CES-konstrukt inkuberes med AM-ester form af et calcium idikatoren farvestof (Fluo5N-AM, figur 2). Derefter, i ER er farvestoffet omdannes til Ca 2 + følsom, membran uigennemtrængelig Ca2 + indikator kompleks (Fluo5N/Ca 2 +) af den høje esteraseaktivitet, derfor fange farvestoffet i en høj koncentration i ER lumen 8 , 34.. Metoden er specielt anvendelig til at undersøge ER calcium-release via IiCR-veje for eksempel via metabotropiske, purinerge-eller glutamat receptorer 8,34 og at visualisere ER calcium udtømning via &quot;lække kanaler&quot; direkte, for eksempel efter blokade af SERCA 17 , 34.. Til vores erfaring med lav affinitet Ca 2 + indikator Fluo5N-AM er i øjeblikket den bedste tilgængelige indikator til brug sammen med TED farvestoffet loading strategi. Fluo5N-AM har en lav affinitet til Ca 2 + (dissociationskonstant KD ~ 90 pM, figur 2), er næsten ikke-fluorescerende i sin AM-formen, men giver høj fluorescensemission ved Calcium binding 8,34. Den Fluo5N/Ca 2 + kompleks kan exciteres med en standard lyskilde ~ 490 nm, hvilket svarer til standard farvestoffer, såsom FITC, Alexa 488, eller eGFP. Cytosoliske calcium signaler næppe nå en koncentration i det lave uM rækkevidde og derfor næppe påvises ved Fluo5N i cytosolen 35.. At forbedre TED ydeevne blev adskillige rekombinante vektorkonstruktioner udviklet (figur 3). Oprindeligt er TED vektorer baseret på den kodende sekvens af CES2 (RefSeq accession nummer NM_145603, CES2c) og bedste TED ydeevne observeres med stabil ekspression af CES konstruktioner. Nye TED vektorer udtrykker et centralt element i CES2 fusioneret med rød fluorescens protein TagRFP-T2 36. Disse vektorer har den fordel, at de kan anvendes til at identificere transducerede celler og til at bruge den røde fluorescens som en intern kontrol til normalisering af ændringer i Fluo5N/Ca 2 + fluorescens. Den røde fluorescens også giver mulighed for at visualisere den strukturelle fordeling af ER og ændringer i ER dynamik under stimulering betingelser.

<table border="1">
	 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)</td>
 <td>Tocris</td>
 <td>0805</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A26209-1G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B-27 supplement,50x</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17504-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Carbamoylcholine chloride (Charbachol)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C4382-1g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cyclopiazonic acid (CPA)</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM with Glutamax</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>31966-047</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x</td>
 <td>PAA</td>
 <td>H15-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf serum</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>10270-106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-5N-AM, 10 x 50 &mu;g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F14204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutamate</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutamax</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ham's F12 nutrients mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>21765-029</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS</td>
 <td>PAA Laboratories</td>
 <td>H15-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Horse serum</td>
 <td>SHD3250YK</td>
 <td>Linearis</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ionomycin Ca2+ salt</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-116</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>murine EGF </td>
 <td>PreproTech</td>
 <td>315-09</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N2 supplement 100x</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17502-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal medium</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>21103-049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F127, low UV absorbance,2g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P6867</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P8638</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-Lysin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2636</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thapsigargin</td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>586005-1mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TryLE Express</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12605-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS-003707</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T6522</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heater controller TC-344B</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-0101</td>
 <td>to control in line solution heater</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NIH ImageJ software</td>
 <td>WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>, 1997--2006</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N2709100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UPLFLN40XO</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N1478700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N1480700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion chamber, inverse</td>
 <td>custom-made</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion chamber, RC-49FS</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>W4 64-1709 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion tube: PT-49</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-1730</td>
 <td>for perfusion</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>n.a. </td>
 <td>perfusion pump</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single inline solution heater SH-27B</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-0102</td>
 <td>controlled by heater controller</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Suction tubes: ST3R</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-1407</td>
 <td>for perfusion</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel</td>
 <td>Pecon</td>
 <td>n.a. </td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

direct imaging of er calcium with targeted-esterase induced dye loading (ted)

Visualisering af calcium dynamik er vigtigt at forstå betydningen af ​​calcium i cellefysiologi. At undersøge calcium dynamik, har syntetiske fluorescerende Ca2 + indikatorer blive populær. Her viser vi TED (= målrettet-esterase induceret farvestof lastning), en metode til at forbedre frigivelsen af Ca2 + indikatorfarvestoffer i ER lumen af forskellige celletyper. Til dato, blev TED anvendt i cellelinjer, gliaceller og neuroner in vitro. TED baser på effektiv, rekombinant målretning af høj carboxylesterase aktivitet til skadestuen lumen ved hjælp vektor-konstruktioner, der udtrykker Carboxylesterases (CES). De seneste TED vektorer indeholder et centralt element i CES2 fusioneret til et rødt fluorescerende protein, og dermed gør det muligt samtidig tofarvet billeddannelse. Dynamikken i frit calcium i ER afbildes i én farve, medens det tilsvarende ER struktur vises i rødt. Ved begyndelsen af ​​proceduren, celler transduceret med en lentivirus. Efterfølgende de inficerede celler enre podet på dækglas til endelig muliggøre levende celler. Derefter levende celler inkuberes med acetoxymethylester (AM-ester) form af lav affinitet Ca 2 + indikatorer, fx Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM eller Mag-fura2-AM. Esterase aktivitet i ER spalter off hydrofobe sidekæder fra AM form Ca2 + indikator og en hydrofil fluorescerende farvestof / Ca2 + borkompleks og fanget i ER lumen. Efter farvestof lastning, cellerne analyseres ved en inverteret konfokal laser scanning mikroskop. Celler løbende perfuseres med Ringer-lignende løsninger, og de ER calcium dynamik direkte visualiseres ved time-lapse billeddannelse. Calcium frigivelse fra ER er identificeret ved et fald i fluorescensintensitet i regioner af interesse, hvorimod påfyldning af ER calcium butikken frembringer en stigning i fluorescensintensitet. Endelig er ændringen i fluorescerende intensitet over tid bestemmes ved beregning af bf / F 0.

Denne protokol giver en ikke-forstyrrende tilgang til direkte billeddannelse af fri ER calcium. Lav-affinitet syntetisk Ca2 + indikatorer frigives og fanget i ER lumen ved hjælp af en målrettet ER, rekombinant esterase-enzym-aktivitet. Forbedret belastning af Ca 2 + indikatorfarvestoffer til skadestuen lumen giver mulighed for en direkte og hurtig billeddannelse af ER calcium butik dynamik. Celletyper til TED Muligheden for at metoden er blev...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED at JoVE.com

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Målrettet-esterase induceret farvestof belastning (TED) støtter analysen af ​​intracellulære calcium butik dynamik ved fluorescens billeddannelse. Fremgangsmåden baserer på målretning af en rekombinant carboxylesterase til det endoplasmatiske reticulum (ER), hvor det forbedrer den lokale demaskering af syntetisk lav-affinitet Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indikatorfarvestoffer i ER lumen.

Direkte Imaging af ER Calcium med målrettet-Esterase induceret Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Ekspression og oprensning af viruslignende partikler til vaccination

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Overvågning af ER / SR-calciumfrigivelse med den målrettede Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor CatchER<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging mellemliggende filamenter og mikrotubuli med 2-dimensionelle direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescens opsving efter Photobleaching af gul fluorescerende proteiner markeret p62 i Aggresome-lignende induceret strukturer

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...