Name: direct imaging of er calcium with targeted-esterase induced dye loading (ted)
Uploaded: 2013-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 e la Friedrich-Baur-Stiftung. Vorremmo ringraziare Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute laboratori presso l&#39;Università della California, San Diego per averci fornito Tag-RFP-T2. Noi per fortuna riconosciamo David Baltimore, California Institute of Technology, Pasadena, e Didier Trono, Università di Ginevra, Ginevra, per averci fornito il lentiviral plasmidi FUGW e psPAX2/pMD2.G.

Questo protocollo introduce TED applicata alle linee di cellule, neuroni ippocampali e cellule gliali corticali. TED performance è migliore quando vettori TED sono stabilmente espresse, ad esempio vettori lentivirali. Una panoramica schematica del metodo TED è mostrato in Figura 4. 1. Preparazione delle soluzioni Le seguenti soluzioni devono essere preparate prima di iniziare e possono essere conservati come indicato. Usiamo generalmente di vetro...

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	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).</li><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+calcium+signaling+in+neurons.">Local calcium signaling in neurons.</a> Neuron. 40, 331-346 (2003).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21, 13-26 (1998).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73, 862-885 (2012).</li><li>Neher, E., Sakaba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+calcium+ions+in+the+regulation+of+neurotransmitter+release.">Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release.</a> Neuron. 59, 861-872 (2008).</li><li>Jaepel, J., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+ER+calcium+dynamics.">Capturing ER calcium dynamics.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).</li><li>Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+the+calcium+store+in+the+endoplasmic+reticulum+of+neurons.">Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons.</a> Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).</li><li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function.">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).</li><li>Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+Ca2++from+a+nonmitochondrial+intracellular+store+in+pancreatic+acinar+cells+by+inositol-1,4,5-trisphosphate.">Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate.</a> Nature. 306, 67-69 (1983).</li><li>Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+cellular+stress+through+STIM+proteins.">Sensing cellular stress through STIM proteins.</a> Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).</li><li>Erdmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+calmodulin+with+Sec61alpha+limits+Ca2++leakage+from+the+endoplasmic+reticulum.">Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).</li><li>Sch&#228;uble, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiP-mediated+closing+of+the+Sec61+channel+limits+Ca(2+)+leakage+from+the+ER.">BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER.</a> The EMBO Journal. , (2012).</li><li>Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum+as+an+integrator+of+multiple+dendritic+events.">The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).</li><li>Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. 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L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J. Vis. Exp. (23), e1067 (2009).</li><li>Lang, S., Sch&#228;uble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+calcium+imaging+combined+with+siRNA+mediated+gene+silencing+identifies+Ca(2)(+)+leak+channels+in+the+ER+membrane+and+their+regulatory+mechanisms.">Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms.</a> J. Vis. Exp. (53), e2730 (2011).</li><li>Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+forward+to+seeing+calcium.">Looking forward to seeing calcium.</a> Nature reviews. 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S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+environmental+sensitivity+of+yellow+fluorescent+protein.+Mechanism+and+applications.">Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).</li><li>Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++shuttling+between+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+underlying+Ca2++oscillations.">Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations.</a> EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2++analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor.">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).</li><li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+in+situ+measurement+of+calcium+in+intracellular+inositol+1,4,5-trisphosphate-sensitive+stores+using+the+fluorescent+indicator+mag-fura-2.">Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).</li><li>Solovyova, N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+free+calcium+in+the+neuronal+endoplasmic+reticulum:+an+overview+of+modern+approaches.">Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches.</a> Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).</li><li>Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+dynamics+in+the+lumen+of+the+endoplasmic+reticulum+in+sensory+neurons:+direct+visualization+of+Ca(2+)-induced+Ca(2+)+release+triggered+by+physiological+Ca(2+)+entry.">Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry.</a> The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).</li><li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum.">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).</li><li>Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. 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J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zufferey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery.">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).</li><li>Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM+dyes+enter+via+a+store-operated+calcium+channel+and+modify+calcium+signaling+of+cultured+astrocytes.">FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).</li><li>Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium measurement methods. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), 147-167 (2010).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+esterase-ester+pair+for+targeting+small+molecules+with+cellular+specificity.">Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).</li><li>Samtleben, S., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+for+direct+ER+calcium+imaging+with+targeted-estersase+induced+dye+loading.">Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading.</a> , (2012).</li></ol>

I vantaggi e gli svantaggi del metodo di TED sono state ampiamente discusse in recenti pubblicazioni 34,35. Rispetto ad altri metodi sopra descritti, TED elude il problema di interrompere e perfusione delle cellule. Inoltre, due aspetti hanno bisogno di essere sottolineato. Il principio di TED per ER calcium imaging richiede (1.) L&#39;espressione mirata di un carbossilesterasi attiva nel lume ER con l&#39;aiuto del TED costrutti vettoriali e (2.) Il rilascio efficiente e preferenziale di bassa affinità sint...

Al fine di risolvere le risposte fisiologiche di calcio del ER, abbiamo sviluppato una nuova strategia per migliorare la cattura di calcio sintetici coloranti sensibili al pronto soccorso. Il metodo consente la diretta, senza interruzioni monitoraggio in tempo reale di libero ER calcio in presenza di calcio extracellulare. Funzione e segnalazione di calcio ER Segnali di calcio si trovano in diversi tipi di cellule, ad esempio-cellule muscolari, neuroni e cellule gliali e la loro gamma di funzioni di mediazione contrazione muscolare ad un coinvolgimento nella trasmissione sinaptica nell&#39;apprendimento e nella memoria di 1,2. Cambiamenti nella concentrazione di calcio libero sono di grande interesse scientifico perché il calcio è coinvolto nella regolazione della trascrizione genica, la proliferazione cellulare, eccitabilità neuronale, la morte cellulare e altri eventi di segnalazione cellulare 1-7. Tutti questi segnali di calcio cellulari sono funzionalmente collegati e contribuiscono a intracellulare di calcionegozio dinamiche 8-10. Una caratteristica comune a tutti i segnali di calcio è il flusso di calcio tra lo spazio extracellulare, citoplasma e organelli, soprattutto il ER e mitocondri. Questo provoca cambiamenti dinamici nella concentrazione di calcio all&#39;interno di questi organelli, che vengono rilevate dai diversi componenti di segnalamento. In generale, la concentrazione di calcio nelle gamme ER tra 100 a 800 pM, nel citosol della concentrazione di calcio è quasi 100 nM, e nello spazio extracellulare la concentrazione è di circa 1-2 mm. Pertanto, vi è una forza motrice elevato chimica per flusso di calcio verso il citosol 2,9,10. I segnali di calcio ER-derivati ​​più comunemente studiate dipendono dalla stimolazione dei recettori accoppiati alla proteina G (GPCR), che poi attivano la fosfolipasi C (PLC). PLC a sua volta produce inositolo 1,4,5-trifosfato (IP 3) 1. In seguito al legame di IP 3 alla sua receptor (IP 3-Rec, Figura 1) in ER-membrana, gli ioni calcio vengono rilasciati dal lume ER. Storicamente, IP rilascio di calcio 3-mediata dal pronto soccorso è stato il primo - anche se indirettamente - misurata in cellule pancreatiche acinose di Streb et al nel 1983 11.. Questa pubblicazione suggerito per la prima volta una cascata di segnalazione che coinvolge acetilcolina, fosfolipasi C, e IP 3. Questo modo di rilascio del calcio è generalmente definito IP rilascio del calcio 3-indotta (IiCR) (Figura 1). L&#39;attivazione della chinasi-dipendente della fosfolipasi Cγ da recettore tirosin chinasi link l&#39;azione di fattori di crescita e fattori neurotrofici di ER di calcio di segnalazione IP dopo 3 elevazione 12. Oltre a IiCR, elevazione di calcio può essere mediata da recettori ionotropici ingresso di calcio, per esempio attraverso i canali del calcio voltaggio-dipendenti (CA V), e il successivo rilascio di calcio di calcio indotta (CICR) di ryanodine rirecettori (RyR). IiCR e CICR sono fisiologicamente legati al negozio-Entry operato di calcio (SOCE). SOCE comprende l&#39;azione di STIM (stroma interagenti molecola), che è un sensore per il rilascio di calcio ER. STIM ha mostrato di stimolare l&#39;ingresso di calcio extracellulare attraverso canali potenziali transitori recettore (Trp) 13, Orai canali del calcio 14 e anche canali del calcio voltaggio-dipendenti 15 (Figura 1). Perdita di ER calcio viene salvato dinamicamente dall&#39;azione del Sarco-reticolo endoplasmatico calcio ATPasi (SERCA), che attivamente pompe indietro calcio nel ER. Bloccare il SERCA con farmaci come thapsigargin svela una continua perdita di calcio ER al compartimento citosolico. Questo calcio ER &quot;fuga&quot; è causato da ER intramembrane complessi del poro come il complesso proteico Sec61 16,17 (figura 1). Nel 1998, Berridge pubblicato un modello, il &quot;neurone all&#39;interno di un modello di neurone&quot;, which suggerisce un ruolo fisiologico principio della ER nell&#39;integrazione di calcio neuronale 5. Questo modello considera l&#39;esistenza di un sistema a membrana ER continuo formando una &quot;immagine&quot; intracellulare della membrana plasmatica neuronale 5. Questo sistema a membrana eucariotica binario è stato affermato di essere un prerequisito fondamentale per l&#39;integrazione temporale e spaziale dei segnali veloci e lenti di calcio nei neuroni. Segnali di calcio che si verificano sia in concomitanza o successivamente in diverse spine o dendriti del neurone stesso sono conferiti a soma o nucleo attraverso il pronto soccorso, dove vengono riassunte 5,18 della cellula. Quindi, la loro somma può avere effetto sul l&#39;eccitabilità del neurone, regolazione della trascrizione genica o l&#39;integrazione di cascate di segnalazione. Così, l&#39;ER sostiene l&#39;integrazione dei segnali di calcio. Una condizione per questo concetto è la continuità della ER in una singola cella, che è stato rivendicato da diversi studi e che è stato dimostrato almeno per somato-daree endritic e breve distanza proiezioni assonali 19-21. Che ci sia continuità ER entro lunghe proiezioni assonale è una questione di dibattito. Strategie per misurare il flusso di calcio gratis su membrana ER Segnali di calcio sono più frequentemente monitorati nel citosol 22,23. Pertanto, non può essere distinto facilmente se Ca 2 + fluisce nel citosol da extracellulare o da riserve intracellulari 6,24. Per superare questa limitazione, sono state sviluppate strategie metodologiche per l&#39;imaging diretto di calcio ER. In sintesi, le seguenti strategie da utilizzare sono: (1) ER-mirati geneticamente proteine ​​indicatori 25-27 a base di proteine ​​a bassa affinità Ca 2 + indicatori utilizzano la proteina bioluminescente aequorina o GFP in combinazione con una proteina di rilevamento. Calcio. Queste Ca 2 + indicatori geneticamente (GeCIS) puòessere mirati al pronto soccorso con l&#39;aiuto di un peptide segnale e sono tenute attivamente al pronto soccorso con una ritenzione e motivo recupero. Comune ER Ca 2 + indicatori di base sul principio Cameleon e sono il Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon spaccatura YC7.3ER 29, e Cameleon D1 30. (2) colorante diretto carico esterasi a base di AM-estere a bassa affinità Ca 2 + indicatori 31,32. Dell&#39;indicatore di coloranti (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM o Fluo5N-AM)-derivati ​​AM passare il membrane biologiche in una lipofila, Stato di calcio-insensitive. Poi, nel citosol, nonché in ER, esterasi endogene fendere del gruppo AM-estere e rilasciano l&#39;indicatore di Ca 2 +, lasciando una certa quantità di colorante attivo nel citosol e nel ER. Pertanto, questo approccio è utile in condizioni di una concentrazione elevata di calcio in ER finché la concentrazione di calcio citosolico rimane ben al di sotto delimite di protezione degli indicatori a bassa affinità, in particolare durante segnali di calcio caratteristici (per esempio nM a basse pM). (3) loading AM-estere in associazione con permeabilizzazione della membrana plasmatica 32. Qualsiasi residuo + citosolico indicatore Ca 2 viene rimosso mediante permeabilizzazione della membrana plasmatica con piccole quantità di un detergente &quot;neutro&quot; (ad es saponina) in un tampone intracellulare artificiale. Così, le membrane intracellulari possono essere stimolate, ad esempio con IP 3 nel buffer intracellulare, direttamente attraverso &quot;pori&quot; nella membrana plasmatica. (4) Dialisi del citosol in configurazione whole-cell e misure simultanee di Ca 2 + nel lume ER e il citosol 32,33. Una cella viene prima caricato con una bassa affinità Ca 2 + indicatore (ad esempio Mag-Fura2- AM, raziometrico, luce UV). In seguito, con l&#39;aiuto di una pipetta di patch, qualsiasi residuo cytosolic Ca + indicatore a bassa affinità 2 viene dializzato dal citosol con un tampone contenente un Ca 2 + indicatore ad alta affinità (es. Fluo-3, luce visibile). Questa strategia consente la registrazione simultanea di segnali derivati ​​citosolici e ER. (5) Targeted-esterasi indotta colorante carico 8,34. Un carbossilesterasi (CES) è mirato a lume del ER e fornisce una elevata attività di esterasi intrappolamento efficiente del modulo AM-estere di bassa affinità Ca 2 + indicatori. Mirata-esterasi indotta colorante di caricamento (TED) Per migliorare il targeting di bassa affinità Ca 2 + indicatori per l&#39;ER lumen, TED è stato sviluppato. TED richiede la sovraespressione di un ER carbossilesterasi topo mirata (CES2) (Figura 2), che si ottiene tramite costrutti di espressione. Cellule esprimenti un CES-costrutto ricombinante vengono incubate con il modulo AM-estere di un calcio nelgnalazione colorante (Fluo5N-AM, la Figura 2). Poi, in ER, il colorante viene convertito al Ca 2 + sensibile, membrana impermeabile Ca 2 + indicatore complesso (Fluo5N/Ca 2 +) dall&#39;attività elevata esterasi, quindi intrappolando il colorante in una concentrazione elevata nel lume ER 8 , 34. Il metodo è particolarmente utile per indagare ER calcio-release tramite i IiCR-percorsi per esempio tramite metabotropici purinergici-o glutammato recettori, 8,34 e visualizzare ER deplezione di calcio attraverso &quot;canali di perdite&quot; direttamente, per esempio, dopo il blocco del SERCA 17 , 34. Per la nostra esperienza la bassa affinità Ca 2 + indicatore Fluo5N-AM è attualmente il miglior indicatore disponibile per l&#39;utilizzo con la strategia di caricamento TED colorante. Fluo5N-AM ha una bassa affinità per il Ca 2 + (costante di dissociazione K D ~ 90 pM, Figura 2), è quasi non fluorescente nella sua AM-forma, ma fornisce alta emissione di fluorescenza upon calcium 8,34 vincolante. Il Fluo5N/Ca 2 + complesso può essere eccitato con una sorgente luminosa standard di ~ 490 nm, che corrisponde a coloranti standard come FITC, Alexa 488, o eGFP. Segnali di calcio citosolico raggiungono appena un concentrazione nell&#39;intervallo pM bassa e sono quindi appena rilevati dal Fluo5N nel citosol 35. Per migliorare la prestazione TED, sono stati sviluppati diversi costrutti vettore ricombinante (Figura 3). In origine, vettori TED base alla sequenza codificante di CES2 (Refseq numero adesione NM_145603, CES2c) e migliori prestazioni TED si osserva con espressione stabile del CES costrutti. Nuovi TED vettori esprimono un elemento centrale della CES2 fusa alla proteina fluorescente rossa TagRFP-T2 36. Questi vettori hanno il vantaggio che possono essere utilizzati per identificare cellule trasdotte e di utilizzare la fluorescenza rossa come controllo interno per la normalizzazione dei cambiamenti in Fluo5N/Ca 2 + fluorescenza. La fluorescenza rossa offre anche la possibilità di visualizzare la distribuzione strutturale del ER e cambiamenti nelle dinamiche ER in condizioni di stimolazione.

<table border="1">
	 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)</td>
 <td>Tocris</td>
 <td>0805</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A26209-1G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B-27 supplement,50x</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17504-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Carbamoylcholine chloride (Charbachol)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C4382-1g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cyclopiazonic acid (CPA)</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM with Glutamax</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>31966-047</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x</td>
 <td>PAA</td>
 <td>H15-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf serum</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>10270-106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-5N-AM, 10 x 50 &mu;g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F14204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutamate</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutamax</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ham's F12 nutrients mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>21765-029</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS</td>
 <td>PAA Laboratories</td>
 <td>H15-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Horse serum</td>
 <td>SHD3250YK</td>
 <td>Linearis</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ionomycin Ca2+ salt</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-116</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>murine EGF </td>
 <td>PreproTech</td>
 <td>315-09</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N2 supplement 100x</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17502-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal medium</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>21103-049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F127, low UV absorbance,2g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P6867</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P8638</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-Lysin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2636</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thapsigargin</td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>586005-1mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TryLE Express</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12605-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS-003707</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T6522</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heater controller TC-344B</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-0101</td>
 <td>to control in line solution heater</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NIH ImageJ software</td>
 <td>WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>, 1997--2006</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N2709100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UPLFLN40XO</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N1478700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N1480700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion chamber, inverse</td>
 <td>custom-made</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion chamber, RC-49FS</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>W4 64-1709 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion tube: PT-49</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-1730</td>
 <td>for perfusion</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>n.a. </td>
 <td>perfusion pump</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single inline solution heater SH-27B</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-0102</td>
 <td>controlled by heater controller</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Suction tubes: ST3R</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-1407</td>
 <td>for perfusion</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel</td>
 <td>Pecon</td>
 <td>n.a. </td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

direct imaging of er calcium with targeted-esterase induced dye loading (ted)

Visualizzazione delle dinamiche di calcio è importante per capire il ruolo del calcio nella fisiologia cellulare. Per esaminare le dinamiche del calcio, fluorescenti Ca 2 + indictors sintetici sono diventati popolari. Qui mostriamo TED (= colorante carico mirato-esterasi indotto), un metodo per migliorare il rilascio di Ca 2 + pigmenti indicatori nel lume ER di tipi cellulari. Ad oggi, TED è stato utilizzato in linee cellulari, cellule gliali e neuroni in vitro. Basi TED su efficiente, ricombinante di mira di un&#39;attività ad alto carbossilesterasi al lume ER utilizzando vettori costrutti che esprimono carbossilesterasi (CES). Le ultime vettori TED contengono un elemento centrale della CES2 fuso ad una proteina fluorescente rossa, consentendo in tal modo l&#39;imaging simultaneo a due colori. La dinamica del calcio libero in ER vengono esposte in un unico colore, mentre la corrispondente struttura di ER appare in rosso. All&#39;inizio del procedimento, le cellule vengono trasdotte con un lentivirus. Successivamente, le cellule infette ari seminati su vetrini per consentire finalmente l&#39;imaging cellulare dal vivo. Poi, le cellule viventi sono incubate con l&#39;estere acetossimetil (AM-estere) sotto forma di bassa affinità Ca 2 + indicatori, per esempio Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, o Mag-Fura2-AM. L&#39;attività esterasi nei unirà ER off catene laterali idrofobiche dal modulo AM del + indicatore Ca 2 e una idrofila colorante fluorescente / Ca 2 + complesso è formato e intrappolato in ER lumen. Dopo il colorante di caricamento, le cellule vengono analizzate con un microscopio confocale a scansione laser invertito. Le cellule sono continuamente perfusi con soluzioni di Ringer-like e le dinamiche del calcio ER sono direttamente visualizzati da time-lapse imaging. Rilascio del calcio dal RE è identificato da una diminuzione della intensità di fluorescenza in regioni di interesse, mentre il riempimento del negozio calcio ER produce un aumento di intensità di fluorescenza. Infine, la variazione di intensità fluorescente nel tempo è determinata mediante calcolo di Af / F 0.

Questo protocollo fornisce un approccio non distruttivo per l&#39;imaging diretto di libera ER calcio. Bassa affinità sintetica Ca 2 + indicatori vengono rilasciati e intrappolati nel lume ER con l&#39;aiuto di un ER mirati, attività enzimatica esterasi ricombinante. Migliorata caricamento delle Ca 2 + indicatore coloranti al pronto soccorso lume consente una rappresentazione diretta e veloce di ER calcio negozio dinamiche. Tipi di cellule per TED <p class="jove_cont...

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Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Mirata-esterasi indotta colorante di caricamento (TED) supporta l&#39;analisi delle dinamiche di calcio intracellulare negozio di imaging di fluorescenza. Il metodo basa sul targeting di un carbossilesterasi ricombinante al reticolo endoplasmatico (ER), dove migliora la smascheramento locale di sintetico a bassa affinità Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indicatore di coloranti in ER lumen.

Imaging diretta di calcio ER con Targeted-esterasi Induced Loading Dye (TED)

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